Ф уайт метод культуры тканей

Самые ранние работы по изолированию культур принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ, Саксу (1893). В этих исследованиях зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях. Первым исследователем, занявшимся установлением минимального размера экспланта, был Карл Рехингер (1893). Он выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Эти исследования показали, что каллус образуется при толщине среза не менее 1,5 мм. Еще в 19 веке Х. Фёхтинг провел ряд экспериментов, доказывающих тотипотентность клетки. При этом им убедительно показана полярность как органов, так и клеток.

Основы экспериментальной эмбриологии растений были заложены исследованиями Моссарта (1902), который наблюдал набухание завязей некоторых растений после обработки их спорами Licopodium, нежизнеспособными поллиниями и водными экстрактами пыльцы. В связи с этим было высказано предположение, что пыльцевая трубка не только обеспечивает передвижение спермиев к яйцеклетке, но и переносит в завязь ауксины, стимулирующие ее рост.

Г. Габерланд (1902) научился культивировать отдельные клетки в течение некоторого времени. Но он выбрал для культивирования зеленые клетки, изолированные из клеток палисадной паренхимы Lamium purpureum и волосков традесканции вирджинской и медуницы мягкой, резонно рассудив, что при этом отпадет потребность в источниках углеводов. Однако упустил из виду то, что ассимилирующие зеленые клетки — зрелые и высокодифференцированные, потеряли способность к меристематической деятельности. Исходное предположение автора, что содержащие хлорофилл клетки полностью обеспечивают себя питательными веществами, необходимыми для их жизнедеятельности и роста, не было подтверждено экспериментально. Габерланд также выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки расте­ния, которая впоследствии была подтверждена экспериментально. Ряд ученых, в том числе и его ученики, последовали его примеру и получили отрицательные результаты. Некоторые на основании этого усомнились в гипотезе тотипотентности растительных клеток. Исследования Габерландта с фотосинтезирующими клетками были неудачны, что привело к потере интереса к культивированию тканей и клеток растений. Однако они все же положили начало поиску адекватных питательных смесей и условий, необходимых для поддержания роста органов, тканей и клеток растений.

Толчком к возобновлению работ послужили исследования Гаррисона, проведенные в 1904 — 1907 гг. Он вырастил нейробласты лягушки в лимфатической жидкости, доказав возможность выращивания in vitro изолированных клеток. Большое влияние на направление дальнейших работ с растительными клетками оказали работы зоологов Карреля и Барроуза (1911), культивировавших ткани и клетки млекопитающих на среде сложного состава, содержащей плазму крови и экстракты эмбриональных тканей.

Французский ученый Мольяр уже в 1921 культивировал сегменты корня и гипокотиля молодых побегов редьки. Они были способны к росту в условиях культуры, но при этом не происходило формирования новых тканей.

В 1922 г. один из учеников Рехингера — Коттэ начал эксперименты с лишенными пигментов меристематическими тканями — изолированными кончиками корней, и добился успеха. Практически одновременно и независимо от Коттэ Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты по­ложили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах. Не всегда эти исследования были успешны. Под влиянием работ Карреля и Барроуза в 1927 году Прат начал культивировать клетки растений на средах с добавками растительных экстрактов. Результаты его экспериментов были отрицательны, так как он избрал неудачные объекты для исследований.

Начало длительным и удачным исследованиям по культивированию клеток и тканей растений положили работы американского исследователя Ф. Уайта и француза Р. Готре. Они показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Такую же способность наблюдал Ф. Уайт для клеток опухолевого происхождения. Результаты чужих и собственных экспериментов Уайт обобщил в монографии «Культура растительных тканей», которая была переведена на русский язык и издана в СССР в 1949 году. В ней он выделяет несколько периодов в истории развития метода культуры клеток, тканей и органов растений:

1. 1834 -1900 гг. — создание и разработка клеточной теории.
2. 1900 – 1922 гг. — сформулирована идея культуры тканей.
3. 1922 – 34 гг. — безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное культивирование тканей.
4. 1934 — 39 гг. — детальная разработка техники культуры растительных тканей.

Читайте также: Ткань для матраса в коляску

Период 1940 — 1960 гг. значительно расширил список видов, выращиваемых in vitro. В монографию Готре, вышедшую в 1959 г., включено уже 142 вида. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макроэлементов для поддер­жания нормальной ростовой активности тканей, определено влияние витаминов и стимуляторов роста. Проводились работы по выявлению значения различных натуральных экстрактов (из эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других рас­тений) для поддержания неорганизованного клеточного роста, а также для стимуляции органогенеза. Показано значение кинетина для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого морфогенеза. Изучением этих вопросов занимались такие ученые, как Р. Хеллер, И. Нич, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р. Г. Бутенко. В это же время разработаны методы получения и выращивания клеточных сус­пензий, а также культивирования отдельной клетки, деление ко­торой индуцируется с помощью ткани-няньки.

В 1960 — 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов. Осново­положник этого метода — Э. Коккинг. Такебе с сотрудниками были определены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют клеточные стенки, делятся и дают начало клеточным линиям, способным к морфогенезу. Были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, бактерий. В лабораториях Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глебы проводились исследования по­ведения ядерного и цитоплазматического геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и потомстве соматических гибридов растений — регенерантов. В этот же период были разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей. Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток.

Начиная с 1976 г., разработывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельско­хозяйственных растений. Удалось создать системы иммобили­зованных клеток для получения различных химических соеди­нений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Метод культуры тканей: сущность и применение

Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.

Сущность

Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.

В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).

История развития

Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.

В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.

К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.

Типы исследуемого материала

Различают 2 основных вида культур тканей растений:

• Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
• Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.

Читайте также: Как обшить потолок балкона пластиковыми панелями своими руками: пошаговая инструкция с фото

По способу выращивания выделяют следующие методы:

• на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
• с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
• применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
• выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.

Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.

Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.

Необходимые условия

Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:

• Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
• Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
• Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.

В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).

Достоинства и недостатки

Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:

• хорошая воспроизводимость полученных результатов;
• регулирование межклеточных взаимодействий;
• небольшой расход реагентов;
• генетическая однородность клеточных линий;
• возможность механизации процесса выращивания;
• контроль над условиями содержания клеток;
• низкотемпературное хранение живых культур.

К недостатком данной биотехнологии относят:

• необходимость соблюдения строгих условий асептики;
• нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
• дороговизна химических реагентов;
• неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.

Применение

Метод культуры тканей используется для проведения исследований:

• процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
• межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
• взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
• результатов генетических манипуляций с клетками.

Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:

• получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
• направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
• клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
• выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
• криоконсервация генофонда;
• реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).

Культура изолированных тканей

Методы выращивания изолированных тканей растений были разработаны Ф. Уайтом и Р. Готре. Сущность метода заключается в том, что выделенные ку­сочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях. Если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться, и затем из нее может развиться целый растительный организм. Так, из одной полностью дифференцированной клетки флоэмы, выделенной из корнеплода моркови, из клетки сердцевинной паренхимы табака и других можно получить целое, полностью развившееся растение. В опытах Р.Г. Бутенко с клетками фло­эмы моркови при выращивании на питательной среде в стерильных условиях сначала клетки быстро делились. Получалась недифференцированная масса мелких клеток — каллюс меристематической структуры (увеличенное число рибосом, митохондрий и т. д.) с интенсивным синтезом РНК и белка. При этом возрастала интенсивность дыхания и увеличивалась доля пентозофосфатного пути. Затем в массе однородных клеток возникали очаги дифференциации, клет­ки дифференцировались вторично. Процесс вторичной дифференцировки можно разделить на две фазы. Первая фаза — это образование в массе однородных клеток очагов регенерационной меристемы и возникновение зародышевых структур (эмбриоидов), которые на­поминают настоящие и имеют зачаточную почечку и зачаточный корешок. На второй фазе происходит рост этих зародышевых структур. При этом в зависи­мости от соотношения фитогормонов (ауксинов и цитокининов) происходит преимущественный рост тех или иных органов. В настоящее время ведутся исследования с изолированными протопластами, которые выделяют путем раз­рушения клеточных стенок специальными ферментами. Изолированные про­топласты при помещении их на подходящую питательную среду образуют но­вую оболочку, т. е. превращаются в клетки. Вместе с тем протопласты способны сливаться вежду собой и образовывать клеточную оболочку. Таким образом, можно получить гибридную клетку, а из нее растение. Рост и дифференциация и в этом случае зависят от соотношения физических и гормональных веществ в питательной среде. Метод выращивания изолированных тканей, клеток, протопластов позволя­ет решать многие теоретические вопросы, связанные с раскрытием механизмов дифференцировки (морфогенеза), регуляции физиологических процессов и др. Этот метод получил также широкое практическое применение в области сель­ского хозяйства, биотехнологической промышленности.

Читайте также: Ткань риностоп что это

Биотехнология — наука, использующая биологические принципы в практиче­ских целях. Эта отрасль науки охватывает очень широкий круг вопросов. Ряд из них решается с помощью клеточных культур. Так, все более важное значение приобретает клональное размножение. Клон — ряд поколений генетически одно­родных потомков одной исходной особи, образующейся в результате бесполого размножения. Клонирование позволяет получать большое количество поса­дочного материала, полностью идентичного исходной особи. При клональном микроразмножении в большинстве случаев в качестве ис­ходного материала используются фрагменты верхушечной апикальной мери­стемы. Верхушечные меристемы не содержат патогенных микроорганизмов, поэтому растения, полученные от них, являются здоровыми. Изолированные меристемы выращивают в стерильных условиях на ряде последовательно меняю­щихся питательных сред. В результате получаются растения с корневой системой, пригодные для посадки в почву. Этим методом от клеток меристемы одного растения можно получить практически неограниченное число потомков. Ме­тод широко применяется для размножения декоративных, ягодных и других растений. Все большее значение в селекции приобретает метод изолированных клеток. Здесь возможны разные направления: направленный отбор клеток, ока­завшихся устойчивыми к тем или иным неблагоприятным условиям среды или болезням, и выращивание из них устойчивых растений (клеточная селекция). Важное значение имеет получение гаплоидных растений, содержащих одинар­ный набор хромосом. Этот метод предполагает получение растений из мужских либо из женских гамет. Гаплоидные растения после обработки колхицином имеют два набора идентичных хромосом, полностью соответствующих материнскому рас­тению. Большие надежды возлагаются на соматическую гибридизацию, заключаю­щуюся в слиянии двух протопластов. Таким путем были получены гибриды между картофелем и томатами, названные «помато». Преимущества такой гибридизации заключаются в том, что наследуются признаки, не только закодированные в ядре, но и в органеллах цитоплазмы. Следовательно, можно управлять такими важными процессами, как фотосинтез, дыхание и др. Наконец, нельзя не отметить широкое использование культуры изолированных тканей для промышленного получения ряда важнейших лекарственных и пищевых препаратов. В качестве примера мож­но привести получение тонизирующих веществ из клеток женьшеня, стероидных сапонинов из клеток дискореи дельфитовидной и др.

Необходимо в заключение отметить, что для всех направлений применения метода изолированных тканей необходимо знание физиологических особенно­стей используемого объекта. Из опытов с культурой изолированных тканей, кле­ток и протопластов можно сделать несколько выводов:

1. Все клетки действительно имеют одинаковые потенциальные возможности.

2. Клетка, находящаяся в окружении других клеток, и клетка, выделенная из ткани, проявляют эти возможности по-разному.

3. Проявление потенциальных возможностей клеток определяется внутрен­ними и внешними условиями. Большое значение имеют гормоны.

4. В основе регуляции дифференциации клетки лежит дифференциальная ак­тивность генома.

5. Не все клетки могут полностью проявить свои возможности. В некоторых случаях гены настолько репрессированы, что эти возможности не проявляются. В процессе развития клетка может также потерять способность реализовать имеющуюся информацию.

• Свежие записи
  • Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
  • Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
  • Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
  • Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
  • Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом