1) плазмиды агробактерийAgrobacterium tumefaciens,которые являются естественным вектором для горизонтального переноса генов у двудольных растений. Эти бактерии вызывают образование опухолей стебля двудольных растений — корончатых галлов. Причиной опухолеобразования являются так называемые Ti-плазмиды (от англ. tumor inducing- индуцирующая опухоль. Ti-плазмида проникает из клетки бактерии в растение и часть ее, называемая Т-ДНК (от англ. transferred DNA- переносящаяся), ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения.
Размер всей Ti-плазмиды составляет 200-250 тпн, размер T-ДНК в разных плазмидах варьирует от 10 до 30 тпн (что составляет примерно 10% Ti-плазмиды). На T-области картировано не менее 7 генов, каждый из которых регулируется собственным промотором (что сходно с генами эукариот). Эти гены отвечают за синтез опинов (тип которых, например, нопалин, октопин, агроцинопин, манопин зависит от штамма агробактерии, вызывающего его образование) и подавление дифференцировки клеток (онкогены) — подавление образования корней и побегов. Эти гены функционируют лишь после их переноса в растительную клетку. С концов T-ДНК ограничена правым и левым прямыми повторами из 25 пн, что придает ей сходство с мобильными генетическими элементами. Поэтому любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за T-ДНК и перенесена в растительную клетку. Важно отметить, что все гены (их около 35), ответственные за перенос и интеграцию T-ДНК, находятся не в T-ДНК, а в области вирулентности (vir-область).
Однако практическое использование природных Ti-плазмид как векторов для переноса генетической информации в растительные клетки и клонирования генов затруднено из-за ее больших размеров (до 250 тпн, тогда как для прокариот вектор pBR322 имеет размеры всего 4,4 тпн). Учеными были разработаны различные стратегии введения чужеродных генов в состав T-ДНК, одна из которых, нашедшая широкое применение, — создание бинарной векторной системы. В этом случае конструируют два вектора, один из которых содержит область T-ДНК, а другой — гены vir-области, обеспечивающие все функции переноса T-ДНК в геном растительных клеток. Трансгены, кодирующие хозяйственно ценные признаки, встраивают в T-ДНК. Эта же область снабжается маркерными генами, эукариотическим промотором и уникальными сайтами рестрикции. Причем, гены, подавляющие дифференцировку растительных клеток и вызывающие развитие опухоли (онкогены), инактивируются или вырезаются, вследствие чего рост трансформированных растений не нарушается.
В последние годы для создания искусственных векторов используется Ri-плазмида (от англ. root inducing — индуцирующая корни), присутствующая в штаммах Agrobacterium rhizogenes. Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они являются естественными безвредными векторами, т.е. после встраивания T-ДНК в хромосомную ДНК растительных клеток в области заражения наблюдается усиленное образование корешков («бородатость»), из которых легче регенерировать здоровые плодовитые растения, чем из недифференцированной ткани опухоли.
Необходимым условием для инфекции Ti-плазмиды является поранение растения. Поэтому агробактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды, наносят на срезанную часть растения (например, побег) или осуществляют совместное культивирование (кокультивирование) агробактерий и стерильного растительного материала (например, сегментов междоузлий, листовых дисков, протопластов) на питательных средах в условиях in vitro.
2) Прямой физический перенос ДНК в клетку, который используется для трансформации устойчивых к агробактериям растений. Сюда включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом. Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы — хлоропласты и митохондрии
3) Использование антисмысловых (перевернутых)РНК что позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора к-ДНК встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.
Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена, контролирующего синтез полигалактуроназы — фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибковым заболеваниям.
Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген, продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен — это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.
Cтратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.
4) Агролистический метод трансформации (комбинированный) При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.
5) ДНК-инсерционный мутагенез. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты, используя явление сайлесинга – замолкания генов. На основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу, а также трансгенные растения с измененными декоративными свойствами (растений петунии с разноцветными цветками), голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.
После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.
Читайте также: Какую ткань лучше брать для юбки
Цисгеномика: новое слово в селекции растений
Автор
Редактор
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Испокон веков люди пытаются улучшить урожаи сельскохозяйственных культур. Статья повествует о том, какими средствами пользовались селекционеры на протяжении развития растениеводства, а особое внимание уделяется одному из самых современных и многообещающих методов молекулярной генетики растений — цисгеномике. Пора узнать, чем отличаются трансгенные организмы от цисгенных!
Обратите внимание!
Эта работа опубликована в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса «био/мол/текст»-2015.
Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.
От неосознанного отбора к направленной селекции и генетической модификации растений
С незапамятных времен люди стремились улучшить качество и свойства используемых растений. Для этого они выбирали лучшие плоды и самые крупные зерна, бессознательно изменяя растения в нужном направлении. С развитием генетики, открывшей законы наследственности и изменчивости, появилась возможность осознанно управлять передачей необходимых признаков. Экспериментаторы поняли, что методом простого отбора человек не может получить принципиально новых свойств у разводимых организмов, так как при отборе можно выделить только те генотипы, которые уже существуют в популяции. Поэтому для получения новых сортов растений стали применять гибридизацию — скрещивание организмов с желаемыми признаками. Несмотря на то, что этот метод используется уже более века, процесс создания новых сортов остается очень трудоемким и требует многих лет напряженной работы. Современное сельское хозяйство испытывает острую необходимость в новых сортах, отличающихся устойчивостью к воздействию биотических и абиотических факторов окружающей среды, высокой продуктивностью и продолжительными сроками хранения урожая. На сегодняшний день показано, что такими качествами обладают дикие предки культивируемых растений. Чтобы передать их «полезные» гены современным сортам, необходимо проведение межвидового скрещивания, которое технологически сложнее и возможно далеко не для всех культур в силу генетической несовместимости.
Выход из этой ситуации появился с развитием генетической инженерии, которая сделала возможным перенос генов из одного организма в другой.
Различные виды генетически модифицированных растений
Генетически модифицированный организм (ГМО) — организм, генотип которого был целенаправленно изменен при помощи методов генной инженерии *. Основными способами биотехнологического изменения генома растений являются: искусственный мутагенез (физический и химический), трансгенез — введение гена неродственного организма, интрагенез — введение гена самогό организма или его «выключение», а также цисгенез — введение гена близкородственного вида, с которым возможно природное скрещивание.
* — На биомолекуле можно найти и размышления о пользе/вреде ГМ-растений, и «рецептуру приготовления» ГМ-риса и даже стратегии создания растительных фабрик: «Трансгенные растения — спасители планеты или бомбы замедленного действия?» [1], «Готовим ГМ-рис вместе» [2], «Растения-биофабрики» [3]. — Ред.
В 1994 году появилось первое коммерческое генно-инженерное растение — томат Flavr Savr [1, 4]. Вслед за этим стали активно создаваться трансгенные растения, устойчивые к биотическим и абиотическим факторам среды. (Отметим, что трансгенным считают такой организм, в геном которого искусственно введен ген, который не может быть приобретен при естественном скрещивании.) Ученые нашли необходимые гены устойчивости в геномах бактерий и насекомых и перенесли их в растительные организмы [5]. Обывателю покажется, что это достаточно рискованно, потому что, на первый взгляд, в природе такого быть не может (хотя есть и исключения — например, почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens переносит свои гены в растительные клетки для получения необходимых метаболитов).
Другая проблема, с которой связано получение трансгенных растений, — это использование антибиотиков. Для того чтобы узнать, попал ли интересующий ученых ген в геном растительной клетки, необходим некий маркер (репортер), который отделит клетки с внедрившимся чужеродным геном от неудачных образцов. Такими репортерами и являются гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам. Клетки, подвергшиеся изменениям, высаживают на среду с антибиотиком, и, если они остались живы, значит, ген устойчивости проник в их геном, а с ним — и наш целевой ген. Несмотря на то, что трансгенные растения являются мощным фактором развития сельского хозяйства и экономики, возможность их использования провоцирует широкое общественное обсуждение.
Принимая во внимание всеобщую обеспокоенность биологической безопасностью трансгенных продуктов питания, в настоящее время активно разрабатывается новый подход для модификации сортов растений — цисгенез [5–7].
Применение геномного секвенирования сельскохозяйственно-значимых культур, таких как кукуруза, картофель, рис, и разработка эффективных технологий выделения новых генов расширили границы возможностей улучшения сельскохозяйственных культур. В последние десятилетия описан широкий круг генов, кодирующих важные качественные и количественные признаки как самих сельскохозяйственных культур, так и их дикорастущих родственников. Эти гены выделены и перенесены в геномы элитных сортов. Полученные в результате таких манипуляций растения называют цисгенными, чтобы отделить их от понятия трансгенов [5].
Цисгенез — такая технология генетической модификации рекомбинантной ДНК, при которой манипуляция происходит с использованием ДНК того же или близкородственного вида растения, с которым возможен половой процесс [8]. В отличие от трансгенных, такие растения не содержат гены неродственных организмов и гены устойчивости к антибиотикам (рис. 1). Это дает возможность ожидать, что общество с большей легкостью воспримет цисгенные растения, нежели трансгенные. Так, опрос в штате Миссисипи показал, что 81% респондентов готов употреблять в пищу цисгенные растения, в то время как лишь 14-23% согласны на трансгенные [5].
- Для внедрения в геном растения используются гены любого организма (растения, бактерий, насекомых и др.)
- Ген редактируется, изменяется
- Используются маркерные гены
- Используется ген близкородственного вида, с которым возможно природное скрещивание
- Все компоненты гена (промотор, интроны и терминатор) сохраняются в природной форме
- Селекционные маркеры удаляются
- Ген и его регуляторные элементы могут принадлежать самому растению или видам, с которыми возможно перекрестное опыление
- Последовательность основных элементов может быть изменена
- Возможно выключение гена
- Селекционные маркеры удаляются
Рисунок 1. Изменение генома при классической селекции, трансгенезе и цисгенезе.
Цисгенез = классическая селекция?
Современное состояние вопроса о повышении качества и урожайности сельскохозяйственных растений можно объяснить на примере такой стратегически важной культуры, как картофель.
Представим себе, что у нас есть элитный сорт картофеля, который дает прекрасный — качественный и обильный — урожай, но подвержен инфекционным заболеваниям. А еще нам известно, что есть вид дикого картофеля, который не дает никакого съедобного урожая, но при этом устойчив к болезням. Первым делом мы пытаемся выяснить, что в геноме дикого вида определяет его устойчивость (см. врезку). Возможности современной молекулярной генетики и геномики растений позволяют нам найти тот ген, который отвечает за устойчивость, выделить его открытую рамку считывания и участок ДНК, контролирующий его экспрессию, вырезать их, клонировать и внедрить в геном нашего элитного сорта, не внося никаких кардинальных изменений ни в геном сорта, ни в нуклеотидную последовательность гена, которой мы оперируем. Таким образом, если наши манипуляции прошли успешно, мы получаем исходный элитный сорт картофеля, который так же дает прекрасные клубни, но при этом не подвержен заражению паразитами, и мы не теряем урожай.
Гены устойчивости растений
В отличие от животных, растения не имеют иммунной системы. Тем не менее существование растительных организмов, несмотря на огромное количество патогенов (среди которых вирусы, бактерии, грибы, нематоды и даже другие растения), говорит о том, что им свойственны конкретные механизмы устойчивости. Они определяются работой генов устойчивости, которые позволяют растению отследить появление патогена и запустить механизм защитной реакции. Эти гены были открыты в начале 20 века, а спустя 90 лет — выделены [9].
Согласно одной из основных гипотез, растение имеет ген устойчивости, а патоген несет комплементарный ген авирулентности [10]. Когда продукт гена авирулентности взаимодействует с клетками растения, продукт гена устойчивости растения запускает каскад защитных реакций [11]. Фитопатогенные организмы и их механизмы заражения растений чрезвычайно разнообразны, поэтому удивительно, что все известные гены резистентности кодируют небольшое количество белков, которые имеют общее эволюционное происхождение и содержат общие консервативные участки (домены) [12]. Таким образом, гены устойчивости растений можно искать в геноме резистентных видов по наличию определенных нуклеотидных последовательностей. Для поиска и выделения генов используются специальные молекулярные маркеры и техники (PCR, AFLP, RFLP, RAPD и другие) [13].
На сегодняшний день цисгеномика является альтернативным подходом, а основным инструментом создания новых сортов растений остаются классические методы селекции. Для этого мы скрещиваем наш элитный сорт с диким видом картофеля, получаем гибрид, у которого половина генетического материала происходит от исходного элитного сорта, а половина — от дикого предка. Таким образом мы приобретаем устойчивый к паразитам гибрид. Заметим, что мы при этом теряем половину полезных генов, которые были у элитного сорта, и наш новый гибрид не дает такого обильного и вкусного урожая, который долго хранится и не боится холодов. Более того, помимо желаемого гена устойчивости от дикого предка наш гибрид получает еще тысячи ненужных (а возможно, и опасных) сцепленных с ним генов, продукты которых могут оказаться токсичными. Подобная ситуация нас не устраивает, и мы проводим так называемое «обратное насыщающее скрещивание»: пытаемся вернуть нашему гибриду «утерянные» гены элитной родительской формы. Для этого мы опять скрещиваем наш гибрид с элитным сортом, тем самым «разбавляя» его генόм. И так множество раз. Заметим, что после каждого скрещивания должно пройти достаточно времени, чтобы новый гибрид вырос и дал урожай. В результате процесс классической селекции обычно затягивается на десятки лет.
Если вы всё еще против генетически модифицированных растений, представим следующую ситуацию: у нас есть элитный сорт картофеля, единственным слабым местом которого является подверженность заболеваниям. Классическая селекция отнимает слишком много сил и времени и не дает надежного результата, а генетически модифицированные растения не внушают доверия. Даже в этой ситуации есть альтернатива! Химическая промышленность изобрела огромное количество разнообразных пестицидов, которые защитят наш картофель от болезней. Этот путь самый простой и самый опасный: загрязнение окружающей среды химическими реагентами может привести к катастрофическим последствиям (см. врезку).
Химические средства для повышения урожайности растений
Рынок химических средств защиты растений в России составляет более $500 млн в год [14]. Гербициды, инсектициды, фунгициды на сегодняшний день являются важным инструментом увеличения объема урожая, так как они борются с сорняками, убивают насекомых, бактерий, грибы, а также других вредителей сельскохозяйственных растений. Но есть и обратная сторона медали. Все эти тонны химических реагентов ежегодно попадают в почву, водоемы и атмосферу. Многие вещества, используемые в качестве удобрений, надолго сохраняются в среде. Так, в водах озера Онтарио в 90-е годы определяли высокие концентрации пестицида мирекс, использование которого было прекращено еще в конце 70-х [15]. И даже если после обработки определенной местности неким веществом, оно через некоторое время перестает там выявляться, это совсем не означает, что оно распалось или растворилось. С током поверхностных и грунтовых вод, с помощью ветра химические молекулы могут переместиться в другие регионы. Так, например, гербицид атразин, используемый для защиты широколиственных растений в сельском и парковом хозяйстве США, повсеместно присутствует там в поверхностных водах. По некоторым данным, до 92% исследованных водоемов США содержат этот пестицид. Поскольку вещество достаточно стойкое и легко растворимо в воде, оно мигрирует и в грунтовые воды и там накапливается.
Еще неприятнее тот факт, что химические соединения могут перераспределяться в природе не только c помощью дождя и ветра, но и внутри живых организмов, а именно — по пищевым цепям. Организмы получают токсичные вещества из воды, почвы, воздуха. Этот процесс называется биоаккумуляцией. В результате наносится вред как самому организму, так и тому, кто его съест.
В США для борьбы с переносчиком голландской болезни, поражающей вязы, — вязовым заболонником Scolytes multistriatus — деревья обрабатывали ДДТ. Часть пестицида попадала в почву, где его поглощали дождевые черви и накапливали в тканях. У поедающих преимущественно дождевых червей перелетных дроздов развивалось отравление ДДТ. Часть из них погибала, у других нарушалась репродуктивная функция — они откладывали стерильные яйца. В результате борьба с заболеванием деревьев привела к почти полному исчезновению перелетных дроздов в ряде регионов США [15].
Еще более интересным процессом является биомагнификация — это увеличение концентрации токсичного реагента в пищевой цепи. Так, для уничтожения комаров на одном из калифорнийских озер применили ДДТ. После обработки содержание пестицида в воде составило 0,02 части на миллион (ppm). Через некоторое время в планктоне ДДТ определялся в концентрации 10 ppm, в тканях планктоноядных рыб — 900 ppm, хищных рыб — 2700 ppm, птиц, питающихся рыбой — 21 000 ppm. То есть содержание ДДТ в тканях птиц, не подвергшихся непосредственному воздействию пестицида, было в миллион раз выше, чем в воде, и в 20 раз выше, чем в организме рыб — первом звене пищевой цепи.
Приведенные примеры касались различных животных, но не стоит забывать, что человек — это тоже биологический вид, который подчиняется общим природным законам. Вся наша пища имеет растительное или животное происхождение, и нужно понимать, что чем больше химических реагентов используется в сельском хозяйстве, тем больше нежелательных соединений попадает в наш организм. Конечно, их концентрации не столь высоки, однако ежедневно они пополняются, и мы подвергаемся их хроническому воздействию.
Но, пожалуй, самая страшная опасность химической промышленности заключается в самих заводах. Помимо постоянных выбросов отходов производства в окружающую среду, которые отражаются на здоровье работников и местных жителей, такие заводы могут стать причиной техногенных катастроф. Самая страшная из них произошла в 1984 году в индийском городе Бхопал на химическом заводе, принадлежащем американской компании «Юнион карбайд». Авария привела к смерти по крайней мере 18 тысяч человек, из которых 3 тысячи погибли непосредственно в день аварии, а 15 тысяч — в последующие годы [16].
Другой известный случай произошел в 1971 году в Ираке. Правительством этого государства была закуплена большая партия зерна в качестве посевного материала. Посевное зерно с целью борьбы с грибками подвергалось обработке метилртутью. Однако эта партия зерна случайно попала в продажу и была использована для выпечки хлеба. В результате отравление получили более 6,5 тысяч человек, из которых около 500 погибли [15].
Скрещивание возможно не для всех растений
Низкая продуктивность, опасность для здоровья экспериментатора
- бактериофагами — против бактериальных болезней,
- «полезными» микроорганизмами — против насекомых
- насекомыми, питающимися насекомыми-вредителями (например, божьи коровки питаются тлей)
Итак, цисгенные растения, главной целью создания которых является перенесение генов устойчивости в коммерчески успешные сорта, экономят время селекционеров, не требуют применения пестицидов, не нарушают экосистему, затраты на их выращивание минимальны, а урожай максимальный. В 2012 году Европейское агентство по безопасности продуктов питания (EFSA) опубликовало доклад, в котором сравнивался потенциальный вред растительных продуктов, полученных различными способами. В результате был сделан вывод о том, что риски, связанные с употреблением цисгенных растений и сортов, полученных методами классической селекции, сопоставимы [17].
Однако формально цисгенные растения подходят под определение генетически модифицированных организмов. В России правовое регулирование данной области базируется на Федеральном законе от 05.07.1996 № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности». В 2015 году правительство приняло законопроект об отказе от применения технологий генетической модификации при производстве продуктов питания. Если ситуация изменится, использование этой технологии приведет к бурному развитию сельского хозяйства.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом