Илья бозо регенерация костной ткани

Росздравнадзор зарегистрировал первый в мире ген-активированный материал для костной пластики

Росздравнадзор по результатам клинических исследований выдал регистрационное удостоверение на первый в мире ген-активированный материал для костной пластики. Разработка российских ученых позволяет отказаться от необходимости забирать и использовать собственную костную ткань пациента.

Материал под названием «Гистографт» представляет собой гранулы октокальциевого фосфата с нанесенной на них кольцевой ДНК с геном VEGF. Гранулы служат матрицей для формирования костной ткани, а ДНК усиливает кровоснабжение и ускоряет регенерацию костных дефектов. Он предназначен для более эффективного лечения пациентов с повреждениями костей скелета и для наращивания костной ткани перед установкой дентальных имплантатов.

По словам генерального директора компании «Гистографт», практикующего челюстно-лицевого хирурга Ильи Бозо, разработанный материал стал первым в мире из класса ген-активированных, разрешенным для клинического применения. Его внедрение в практику здравоохранения открывает новые возможности в развитии костной пластики и выводит Россию на передовые позиции в регенеративной медицине.

«Для нас стало открытием, что материал формирует костную ткань не только вблизи стенок костного дефекта, но и вне контакта с ними. То есть регенерация происходит сразу во всем объеме имплантированного материала. Так как изделие абсолютно новое и не имеет аналогов, зарегистрированных в России или за рубежом, мы провели клинические испытания с участием 20 пациентов, которых оперировал профессор Алексей Дробышев. Через 6 месяцев у всех пациентов в зоне имплантации сформировался костный регенерат необходимого объема», – отметил Илья Бозо.

ИСКЧ инвестировал 38 млн рублей в стартап по регенерации костной ткани

Пилотная разработка «Гистографт» предназначена для наращивания костной ткани перед установкой дентальных имплантатов и для лечения пациентов с повреждением костей. По словам разработчиков, материал представляет собой гранулы октакальциевого фосфата с нанесенными на них молекулами плазмидной ДНК с геном сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Гранулы служат матрицей для формирования костной ткани, а ДНК усиливает кровоснабжение и регенерацию костной ткани в зоне операции. Материал упрощает выполнение костной пластики, позволяет минимизировать использование собственной костной ткани пациента.

«Гистографт» получил регистрационное удостоверение на медизделие в 2019 году, и в апреле 2020 года компания начала его производство и внедрение в клиническую практику. «Рынок остеопластических материалов в мире оценивается в $2,68 млрд ежегодно. В России он составляет порядка 1,5 млрд рублей со значительным потенциалом к росту. На рынке представлено более ста наименований изделий для различных вариантов костной пластики, но только «Гистографт» обладает способностью стимулировать регенерацию костной ткани», – рассказал генеральный директор компании Илья Бозо.

В настоящее время «Гистографт» в сотрудничестве с ИСКЧ и Институтом металлургии и материаловедения РАН продолжает разработку материалов, содержащих ДНК факторов роста, и планирует внедрение в клиническую практику ген-активированных изделий в виде геля, мембраны и персонализированных имплантатов, изготовленных с использованием технологий 3D-печати. У ИСКЧ и «Гистографта» есть ряд совместных патентов и лицензионный договор на их использование.

В декабре 2020 года ИСКЧ инвестировал 47,6 млн рублей в компанию «Развитие БиоТехнологий», разрабатывающую вакцины от COVID-19, гриппа и вируса папилломы человека. Компания планирует внедрять платформу для разработки противовирусных вакцин-кандидатов на основе рекомбинантных белков на наночастицах.

По данным СПАРК-Интерфакс, долями почти в 30% ООО «Гистографт» владеют ООО «Биомединвест» и Роман Деев, 14% – у Артура Исаева, 15% – у Ильи Борозо, еще 11% принадлежит ИСКЧ. Выручка компании в 2019 году составила 13,5 млн рублей.

Илья Бозо: головокружение от успехов было, но старшие товарищи мне помогли

— Давайте начнем с прошлого года. Вы получили премию «Технопрорыв». За что?

— У нас все-таки медицинская тематика. Мы получили премию за разработку ген-активированного материала: мы разрабатываем материалы для улучшения регенерации костей. Такие специальные изделия могут применяться в разных областях хирургии: челюстно-лицевой хирургии, травматологии и ортопедии, нейрохирургии. Собственно, у нас в разработке новый класс таких изделий. Большинство костнопластических материалов, доступных для клинической практики, не способны стимулировать регенерацию костной ткани; они просто «механически» восполняют дефекты и оптимизируют процесс. А наши материалы содержат в себе особую фармацевтически-активную субстанцию, которая как раз усиливает регенерацию через запуск роста сосудов. Название, конечно, получилось громкое «Первый в мире ген-активированный материал», потому что по факту реально с таким классом фармацевтических субстанций доступных для клинической практики больше нет; есть только у нас — в России.

— А этот материал уже на рынке, да?

— Да. Еще в 2019 году мы получили регистрационное удостоверение и где-то с 2020 года, прямо в пандемию самую, начали его активно применять в практической хирургической работе.

— Вы упомянули страшное слово «ген-активированный», что это значит?

— Это тактический местный вариант генной терапии. Мы используем фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты как бы с «чистым геном» — в нашем случае геном сосудистого эндотелиального фактора роста.

— Это ДНК. Кольцевая молекула ДНК — плазмида. Мы размещаем их в самых различных биорезорбируемых материалах-матрицах. Для самых разных показаний. Это могут быть твердые материалы, или это могут быть гели, мембраны и т.д. Первый вариант изделия сделан на основе гранул октакальциевого фосфата, созданного коллегами из ИМЕТ РАН.

— А выход на мировой рынок планируете?

— Планируем, мы как раз сейчас находимся в стадии формирования бизнес-плана по американскому, европейскому и ближневосточному рынкам… Для нас это очень серьезный шаг, совсем другие деньги, необходимые для процедуры регистрации. Поэтому взвешиваем, смотрим.

— Сама по себе разработка такой штуки была сделана сегодня исключительно «Гистографтом» или это какой-то консорциум компании?

— В биотехе что-то сделать в одиночку вообще сложно. Основной сценарий для таких стартапов как «Гистографт» – это эффективные кооперации, позволяющие синергировать компетенции самых разных участников. В работе участвует ПАО «Институт стволовых клеток человека», владеющее технологией создания и производства ген-терапевтических препаратов, являющееся, кроме этого, и соинвестором проекта. Важная составная часть технологии – это работа наших партнеров, которые занимаются матриксами. Ключевая роль здесь, конечно, принадлежит Институту металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова – ИМЕТ РАН.

Основная технология «Гистографта» — это способ контролируемого по дозировке совмещения плазмидной ДНК с матриксом. И эта технология конечно запатентована.

— Получается, здесь работа трех абсолютно разных типов человеческой деятельности. Вот у нас есть классическая биология (работа с плазмидами), у нас есть конкретная область медицины, которая в принципе в классике далека от какой-то молекулярной биологии. У нас есть металлургия – наука о материалах, совсем далекая штука и от медицины, и от «молекулярки», да? Насколько сложно такой коллаборации говорить на одном языке? Есть кто-то кто «переводит» для всех?

— Сложности определенно есть, это совершенно точно. Очень сложный коллектив: в работе участвуют представители классической клинической медицины, академической науки, бизнес-сообщество и индустриальное сообщество. Все обсуждения обычно идут на уровне хедлайнеров — руководителей научных подразделений, научных групп. Те, кто за собой ведет вот эти дочерние коллективы. Поэтому выстроить коммуникацию среди вот этих хедлайнеров нам удалось.

Для академических ученых было интереснее не столько имплементировать это в практику, сколько провести качественное научное исследование, подготовить и выпустить хорошие публикации. Нашим инвесторам важно, чтобы разработка была внедрена в практику.

Наш коммерческий потенциал, конечно, не реализован. В биотехе цикл монетизации уходит за горизонт. Мы только-только делаем первые шаги на рынке.

— Я думаю, что вы хорошо знаете ситуацию в вот таких коллаборациях в России. Они часты, или ваш случай уникальный?

— Надеюсь, что наш опыт не уникальный. В прошедшем году на очень многих мероприятиях года науки поднималась тема индустриально-академического партнерства.

— Премия «Технопрорыв», насколько я знаю, она очень плотно связана, если даже не полностью завязана, как принято модно говорить на экосистему национальной технологической инициативы. А как вы с связаны с этой экосистемой?

— С НТИ у нас довольно тесные дружественные взаимодействия, прежде всего с проектным офисом. У нас были попытки в рамках НТИ получить прямую финансовую поддержку на реализацию отдельных проектов, но не получилось по разным причинам. В целом мы участвовали даже в определённой степени еще на этапе формирования дорожной карты. И даже в рамках этой дорожной карты, например, Хелснету обозначен как один из важных результатов именно ген-активированный материал – этот класс материалов там звучит как термин. «Гистографт» по этому направлению работает в рамках этой дорожной карты. И что важно – мы не одни, этот класс материалов разрабатывается и исследуется рядом дружественных научных коллективов и в Москве, и в Казани. Конечно, было приятно быть отмеченным у «Технопрорыва». Это было неожиданно на самом деле. Здорово, что это случилось и стало заметно нашей основной целевой аудитории – стоматологам и хирургам; это та аудитория, которая ценит такие награды.

— Ваше дальнейшее развитие, если вы будете расти, масштабироваться, вырастать из какого-то маленького офиса. Дальнейшая модель научного поиска того, что вы делаете, она останется такой же? То есть коллаборация широким фронтом с разными учреждениями, или же вы попытаетесь сконцентрировать все в своих стенах?

— Я думаю, что в горизонте ближайших 3-5 лет, мы — «Гистографт», будучи реально малым предприятием, не можем рассчитывать на то, чтобы сгенерировать внутри себя исчерпывающую научно-производственную базу для закрытия всей нашей технологической платформы. Более того, это экономически будет неэффективно. Поэтому, на наш взгляд, коллаборация – это более эффективная стратегия. С нашим партнером – ИМЕТ РАН мы сейчас в рамках гранта Фонда содействия инновациям (спасибо им за серьезную поддержку!) дооборудуем контрактную производственную площадку, что позволит масштабировать производство основного продукта. Такая работа строится на взаимопонимании.

— Насколько я знаю, в начале своей карьеры вы были «чистым» фундаментальным ученым. Не скучаете по тем временам?

— Действительно, на старте самостоятельной работы я был увлечен фундаментальными исследованиями. Но сейчас действительно положительные эмоции я получаю все-таки от внедрения нового и полезного в практику. Фундаментальная наука здесь – это необходимое основание, но без прикладной тематики для практикующего врача может стать скучно. Поэтому больше драйва, больше энергии я получаю именно от научно-практической работы.

— Ну и последний вопрос. Прошлый год – год науки, был богат для вас на различные события – премии, научно-популярные лекции, и прочее. Голова не закружилась?

— Я «головокружения» не замечал. Но мои Учителя, менторы, взглянув со стороны, некоторую симптоматику диагностировали и вовремя помогли с лечением.

Читайте также: Биоэлектрические явления в возбудимых тканях мембранный потенциал

Разработка и применение ген-активированного остеопластического материала для замещения костных дефектов Бозо Илья Ядигерович

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Бозо Илья Ядигерович. Разработка и применение ген-активированного остеопластического материала для замещения костных дефектов: диссертация . кандидата Медицинских наук: 03.03.04 / Бозо Илья Ядигерович;[Место защиты: ФГБНУ Институт экспериментальной медицины], 2017

Глава 1. Обзор литературы 22

1.2. Особенности репаративного остеогенеза при использовании ординарных и активированных остеопластических материалов

1.2.1. Тканеинженерные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез 35

1.2.2. Остеопластические материалы с факторами роста и их влияние на репаративный остеогенез .47

1.2.3. Ген-активированные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез 50

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .60

2.1. Дизайн исследования 60

2.2. Создание прототипов ген-активированных остеопластических материалов .60

2.2.1. Характеристика генной конструкции .60

2.2.2. Характеристика матриксов-носителей 61

2.2.3. Совмещение матриксов-носителей и генных конструкций 62

2.3. Методы оценки цитотоксичности, пролиферативной активности, экспрессии мРНК гена VEGFA, продукции белка VEGF ММСК in vitro под влиянием разработанных ген-активированных остеопластических материалов .64

2.3.1. Получение культур ММСК человека .64

2.3.2. Оценка цитотоксичности ген-активированных остеопластических материалов 65

2.3.3. Оценка пролиферативной активности клеток под влиянием ген-активированных остеопластических материалов 67

2.3.4. Определение продукции мРНК гена VEGFA культурами ММСК 67

2.3.5. Определение продукции белка VEGF-A165 культурами ММСК .70

2.4. Анализ ген-активированных остеопластических материалов in vivo .72

2.4.1. Имплантация ген-активрованных остеопластических материалов в краниальные дефекты кроликам 72

2.4.2. Конусно-лучевая компьютерная томография .74

2.4.3. Гистологическое и гистоморфометрическое исследования .75

2.5. Статистический анализ 78

ГЛАВА 3. Результаты лабораторного этапа исследования и их обсуждение 82

3.1. Выбор матриксов-носителей для создания ген-активированных остеопластических материалов .82

3.2. Цитотоксичность и влияние ген-активированных остеопластических материалов на пролиферативную активность клеток 84

3.3. Специфическая активность разработанных ген-активированных остеопластических материалов in vitro 91

3.4. Обсуждение результатов лабораторного этапа исследований 99

ГЛАВА 4. Результаты экспериментального исследования in vivo и их обсуждение 102

4.1. Специфическая активность плазмидной ДНК с геном VEGFA при ортотопической имплантации ген-активированных остеопластических материалов .102

4.2. Особенности влияния ген-активированных остеопластических материалов на репаративный остеогенез и их эффективность в замещении костных дефектов..

4.2.1. Результаты конусно-лучевой компьютерной томографии 109

4.2.2. Результаты гистологического анализа

4.3. Рекомендации к проведению клинических исследований ген-активированных остеопластических материалов .136

4.4. Обсуждение результатов экспериментальных исследований in vivo .138

Практические рекомендации .154

Актуальность темы. Исследования репаративной регенерации костной ткани и возможностей оптимизации восстановительного процесса являются актуальными задачами как фундаментальных медицинских наук, так и различных клинических областей медицины.

В изучение репаративной регенерации и, в частности, репаративного остеогенеза внесли весомый вклад отечественные ученые, заложившие основы для понимания этого процесса. Это, прежде всего, труды А.А. Максимова и его теория «мезенхимального резерва» (Maximow A.A., 1927), А.А. Заварзина – основателя эволюционной гистологии (теория параллельных рядов тканевой эволюции) (Заварзин А.А., 1945), Н.Г. Хлопина, разработавшего концепцию дивергентного развития тканей (Данилов Р.К., 2009), которая с определенными оговорками может быть применена к учению о дивергентной дифференцировке клеток в ходе онтогенеза, профессоров А.А. Клишова (1984), Р.К. Данилова (2009, 2012), И.А. Одинцовой (2004) о репаративном гистогенезе вообще и остеогенезе, в частности, детально описанным В.Г. Гололобовым (1997, 2011). Существенный прогресс в понимании закономерностей репаративного остеогенеза был достигнут после выявления клеток, находящихся в начальной части остеобластического дифферона, в качестве которых ранее рассматривались различные клеточные элементы, что подробно описано в обзоре В.Г. Гололобова и Р.В. Деева (2003).

Систематизация и анализ накопленных к настоящему времени данных привели к становлению концепции «остеогенной недостаточности» (Гололобов В.Г., 2011), объясняющей, почему стандартные методы лечения пациентов с повреждениями костей скелета далеко не всегда эффективны, а результаты костной пластики, зачастую, трудно прогнозируемы. В целом, фундаментальные труды отечественных ученых-гистологов создали предпосылки для разработки материалов и методов для индукции репаративных процессов в костной ткани, создали условия для формирования современной системы реконструктивно-восстановительного лечения, которая применительно к хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии изложена в трудах Л.А. Кулакова, Т.Г. Робустовой, А.Ю. Дробышева, А.И. Неробеева и др. (Кулаков Л.А. и др., 2010; Робустова Т.Г., 2010; Дробышев А.Ю. и др., 2012).

Так, проф. В.Г. Гололобов (1997) в своей монографии писал о необходимости выполнения сберегающей первичной хирургической обработки костных фрагментов при огнестрельных травмах в связи с наличием в крупных отломках жизнеспособных клеточных элементов, способных принимать участие в репаративном остеогенезе. В дальнейшем было показано, что повышение оксигенации области регенерации экзогенными факторами стимулирует репаративный остеогенез (Гололобов В.Г. и др., 2000; Matsuda T. et al., 1993), а причины такого эффекта связаны с увеличением функциональной активности клеток остеобластической линии под действием повышенного парциального напряжения кислорода

(Kawada S. et al., 2013; Okubo Y. et al., 2003). В этой связи, стали разрабатываться и «эндогенные» способы увеличения оксигенации в зоне костного дефекта, т.е. методы индукции ангиогенеза для стимуляции репаративного остеогенеза (Saran U. et al., 2014). Важно, что вновь образованная сосудистая сеть не только увеличивает обеспечение метаболически активного регенерата кислородом, необходимым в том числе для остегенной диффренцировки костных клеток-предшественниц, но и обеспечивает доставку в область репаративного остеогистогенеза камбиальных клеток, мигрирующих как из состава сформированного периваскулярного микроокружения, так и с кровотоком из системных источников (Kuznetsov S.A. et al., 2001). Оба механизма, взятые вместе, предопределяют индуцирующее влияние ангиогенеза на репаративную регенерацию костной ткани.

Актуальность проблемы подчеркивается тем фактом, что распространенность заболеваний и патологических состояний с вовлечением костей челюстно-лицевой области, крайне велика (Дробышев А.Ю., 1999; Кулаков Л.А. и др., 2010; Робустова Т.Г. и др., 2010). В этой связи, количество пациентов, нуждающихся в реконструктивно-восстановительных операциях на костях скелета, ежегодно остается весьма значительным.

Степень разработанности темы исследования. Особенности репаративной

регенерации тканей и, в частности, репаративного остеогенеза под действием генных индукторов, влияющих на белок-синтетическую функцию клеток, остаются малоизученными в связи с малым количеством проведенных экспериментальных исследований. При этом, работы, объединяющие в себе комплексную оценку ген-активированных материалов от изготовления до оценки биологического действия in vitro и in vivo единичны.

Цель исследования – разработать ген-активированный остеопластический материал, состоящий из матрикса-носителя и биологически активного компонента – плазмидной ДНК, несущей ген сосудистого эндотелиального фактора роста-А165 (VEGF-A165); определить биологическое действие ген-активированного материала и влияние на репаративный остеогенез в ортотопических условиях.

Задачи исследования

Создать прототипы ген-активированных остеопластических материалов, состоящих из различных матриксов-носителей и плазмидной ДНК с геном VEGFA.

Оценить механизм действия генных конструкций (молекул плазмидной ДНК с геном VEGFA) и его реализацию ими в составе ген-активированных остеопластических материалов in vitro.

Охарактеризовать биологический эффект генных конструкций в составе ген-активированных остеопластических материалов в ортотопических условиях in vivo.

4. Оценить эффективность разработанных ген-активированных остеопластических

материалов в оптимизации репаративного остеогенеза в эксперименте.

Научная новизна. Новизна разработанных в результате исследования технологий и ген-активированных остеопластических материалов подтверждена тремя патентами РФ на изобретение: №2519326 от 14.04.2014 (патент Украины №112450, патент Европы №2797633, патент США № US 9,730,959 B1), №2597786 от 24.08.2016, №2623171 от 22.06.2017. По всем патентам ведется зарубежное патентование. Настоящее исследование стало первым в России в рамках создания технологической платформы ген-активированных материалов. Одно из разработанных медицинских изделий находится на этапе клинических испытаний в рамках государственной регистрации (разрешение Росздравнадзора №610/2016 от 05 июля 2016, заключение №12 от 29.12.2016 Этического совета МЗ РФ в сфере обращения медицинских изделий). Указанные клинические испытания (протокол на сайте clinicaltrials.gov: NCT03076138) стали первыми в мире для данного класса остеопластических материалов. Кроме того, в качестве матрикса-носителя для генных конструкций впервые был использован ОКФ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в ходе исследования экспериментальные данные о генной индукции ангиогенеза и репаративного остеогенеза расширили представления о возможностях влияния на данные процессы с использованием инструментов и методов геннотерапевтического подхода.

Результаты работы сформировали научно-техническую основу биотехнологической платформы для дальнейших исследований и разработок в области ген-активированных остеопластических материалов, что позволит осуществить создание и внедрение других медицинских изделий данного класса, состоящих из иных генных конструкций и матриксов-носителей.

Одно из трех разработанных изделий, показавшее высокую репаративную эффективность, находится на этапе внедрения в клиническую практику: пройден первый этап регистрационных действий, проводятся клинические испытания, разрешенные Росздравнадзором, результаты которых могут позволить начать применение первого в классе ген-активированных материалов медицинского изделия в рутинной клинической практике.

Методология и методы исследования. Исследование включало экспериментальные этапы
in vitro и in vivo, в ходе которых для решения поставленных задач использовались адекватные
контрольные группы, современные методы исследований (фуориметрия, сканирующая
электронная микроскопия, полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ, проточная
цитофлуориметрия, дентальная компьютерная томография, гистохимические,

иммуногистохимические и гистоморфометрические методы) и статистической обработки полученных данных.

Основные положения, выносимые на защиту

Оптимизированные условия для образования химических связей между матриксом-носителем, содержащим кальций, и плазмидной ДНК позволяют создать единый комплекс – ген-активированный остеопластический материал.

Влияние плазмидной ДНК с геном VEGFA, входящей в состав ген-активированных материалов, на культуру ММСК in vitro проявляется в повышении экспрессии гена VEGFA и продукции белка VEGF-A165 при незначительном снижении пролиферативной активности ММСК и отсутствии цитотоксичности.

Активизация репаративного остеогенеза обусловлена эндогенной индукцией ангиогенеза в зоне костного дефекта, вызванной повышением продукции клетками реципиентного ложа белка VEGF-A165; оптимизирующее влияние ангиогенеза опосредовано улучшением оксигенации и пополнением пула остеогенных клеток-предшественниц из состава периваскулярного микроокружения и системных источников с индукцией их дифференцировки в остеобластическом направлении.

Объем вновь образованной ретикулофиброзной и пластинчатой костной ткани в периферической и центральной зонах костных дефектов у животных экспериментальных групп превышает показатели контрольных групп в связи с выраженным остеоиндуктивным действием ген-активированных остеопластических материалов, благодаря которому они индуцируют образование костного регенерата не только со стороны костных опилов, но и в центре костного дефекта.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности полученных результатов обусловлена использованием адекватных поставленным задачам методов исследования с применением сертифицированного современного оборудования, корректным выполнением статистической обработки полученных данных и воспроизведением результатов в достаточном числе независимых экспериментов. Диссертационная работа не содержит некорректных заимствований.

Читайте также: Чем закрыть шов ткани

Основные положения диссертации были представлены и обсуждены 12 сентября 2017
года на совместном заседании кафедр челюстно-лицевой и пластической хирургии; детской
челюстно-лицевой хирургии; гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУВО «Московский
государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова»

Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №3 от 12.09.2017).

Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на 12 международных и 14 всероссийских научных конференциях. Результаты исследования были отмечены научным сообществом:

Диплом лауреата «Конкурса на лучшую инновационную медицинскую технологию по хирургии 2012 года» (II место) по итогам участия в первой всероссийской научной конференции молодых ученых медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (6-7 декабря 2012, Москва).

Включение доклада в ТОП-20 постеров и допуск к очному участию в конкурсе в рамках 4rd Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Symposium — World Congress (8-11 сентября 2015, Бостон, США).

Диплом победителя и памятная Юбилейная медаль «95 лет Кубанскому государственному медицинскому университету» по итогам участия в Российско-китайском фестивале вузовской науки (19-20 ноября 2015, Краснодар).

выдано 3 патента РФ на изобретения; на один из патентов РФ через стадию международной патентной заявки получены патенты Европы, Украины и решение о выдаче патента США;

опубликовано 12 научных статей, из которых 4 в международных журналах, индексирующихся в Web of Science (наивысший импакт-фактор — 7,145), 6 в журналах, включенных в список ВАК;

опубликовано 33 тезиса докладов, из которых 21 были представлены на российских и 12 — на зарубежных научных конференциях (доложены на английском языке).

Вклад автора в проведенное исследование. Автор лично сформировал рабочую гипотезу, научно обосновал возможность оптимизации репаративного остеогенеза за счет активизации ангиогенеза под действием плазмидной ДНК, несущей ген VEGFA, входящей в состав разработанных ген-активированных материалов. Автор лично выполнил лабораторные исследования по оценке связывания плазмидной ДНК различными матриксами-носителями для создания ген-активированных остеопластических материалов, участвовал в организации и выполнении экспериментальных исследований в культурах клеток, лично прооперировал всех лабораторных животных (52 кролика), осуществлял их послеоперационное наблюдение, последующее выведение из эксперимента, извлечение фрагментов свода черепа, организовывал проведение компьютерной томографии и гистологических исследований.

Автор провел качественную и количественную оценку данных компьютерной томографии, гистологических препаратов, включая гистоморфометрический анализ, выполнил статистическую обработку полученных данных, участвовал в их интерпретации, написал тезисы научных работ, научные статьи (оригинальные исследования и обзоры), заявки на выдачу патентов на изобретения, диссертацию и автореферат.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертационного исследования изложены на 191 странице, представлены следующими разделами: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты выполненных экспериментальных исследований in vitro и in vivо и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, приложения и список литературы. Работа содержит 40 рисунков, 15 таблиц. Библиографический указатель включает 301 источник литературы, из них 48 отечественных и 253 зарубежных.

Тканеинженерные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез

Описаны различные варианты классификации остеопластических материалов: по происхождению, химическому составу, физическим свойствам и прочим основаниям [70]. Предложена хронологическая классификация, разделяющая все разработанные остеопластические материалы на 5 поколений: 1) ксено-, алло- и аутогенные костные фрагменты, не подвергавшиеся специальной обработке; 2) консервированные аллокостные материалы; 3) аналоги костной ткани синтетического и натурального происхождения, в том числе с факторами роста; 4) тканеинженерные костные графты; 5) ген-активированные остеопластические материалы [18]. Однако для определения места ген-активированных материалов в общей системе медицинских изделий для костной пластики более подходящей является современная прикладная классификация, основанная на составе и механизме действия. Согласно ей, все остеопластические материалы подразделяются на две категории: ординарные и активированные [103].

Репаративный остеогенез под влияние ординарных и активированных материалов протекает по-разному в связи с отсутствием у ординарных и наличием в составе активированных – стандартизированных по качественным и количественным параметрам биологически активных компонентов: факторов роста (белков), клеток или генных конструкций, кодирующих факторы роста (Рисунок 1). Ординарные материалы, не содержащие биологически активных компонентов, призваны лишь оптимизировать репаративную регенерацию для ускорения и увеличения объема вновь образованной костной ткани, а вторые – индуцировать, поддерживать на высоком уровне до полного гистотипического восстановления.

К категории «ординарных» относятся: аллогенный и ксеногенный костный матрикс различных технологий обработки (деминерализованный, депротеинизированный) [38]; фосфаты кальция (-трикальция фосфат [63, 203, 274], октакальциевый фосфат [166] и др.); натуральный или синтетический гидроксиапатит [290]; синтетические (PLGA и т.д.) [115] и натуральные (коллаген, хитозан) органические полимеры [128, 158]; силикаты [273]; композитные изделия из вышеперечисленных материалов [285] и др. Апеллируя общепринятой терминологией, абсолютное большинство ординарных остеопластических материалов обладают, главным образом, остеокондукцией [103]. Некоторые из них (например, деминерализованный костный матрикс, полученный различными технологиями обработки нативной кости; фосфаты кальция и пр.) характеризуются также умеренным остеоиндуктивным действием, вероятно, за счет оптимальных физико-химических свойств и (или) наличия в составе матрикса неопределенного, не стандартизированного по качественным и количественным параметрам спектра биологически активных веществ [62]. В этой связи, основной механизм их действия обусловлен направлением формирующегося костного регенерата, а предел эффективности ограничивается оптимизацией естественного хода репаративного процесса, что обеспечивает заживление при замещении костных дефектов с высоким уровнем активности эндогенных остеоиндуцирующих факторов, но не достаточно для восполнения протяженных (объемных) костных дефектов.

Основной проблемой данной категории остеопластических материалов является недостаточный остеоиндуктивный потенциал, что ограничивает показания к их применению и делает результаты костной пластики в определенной степени непредсказуемыми, что можно проиллюстрировать следующими клиническими случаями.

Клинический случай №1. Пациентке Б. через 1 год после щадящей верхнечелюстной синусотомии справа с пластикой оро-антрального сообщения, проведенной по поводу хронического перфоративного верхнечелюстного синусита справа, был выполнен открытый синус-лифтинг справа с использованием ксеногенного депротеинизированного костного матрикса, а также винирная костная пластика в области отсутствующего зуба 1.4 кортикальным костным аутотрансплантатом с ветви нижней челюсти справа аналогичным остеопластическим материалом. За 6 мес. после операции воспалительных явлений и соответствующей им патологической клинической симптоматики в области правого верхнечелюстного синуса не наблюдалось. Однако на контрольном рентгенографическом исследовании было выявлено отсутствие интеграции имплантированного материала с внутренней кортикальной пластиной дна правого верхнечелюстного синуса. Важно, что выполненный до этого открытый синус-лифтинг слева с применением остеопластического материала той же торговой марки и одномоментной установкой дентального имплантата оказался эффективен (Рисунок 2).

Оценка цитотоксичности ген-активированных остеопластических материалов

Определение уровня белка VEGF-A165 в среде, кондиционированной ММСК, со-инкубированными с образцами ген-активированных остеопластических материалов, использовали как для оценки уровня трансляции генных конструкции разработанного изделия, так и для оценки его специфической активности.

По 1,5105 ММСК человека помещали в лунки 6-луночного планшета, куда после прикрепления клеток добавляли ген-активированные остеопластические материалы, генные конструкции без носителей, либо матриксы без генных конструкций. На сроках 1, 3, 5, 7, 10 и 12 сут. забирали образцы среды (100 мкл) для последующего анализа. Измерения проводились в четырех повторениях на каждом сроке.

Определение количества VEGF-A165 проводили в супернатанте с использованием набора для иммуноферментного определения концентрации VEGF-А DuoSet ELISA Development System (R&D Systems, США). Метод определения основан на твердофазном «сэндвич»-варианте ИФА, в котором специфические иммобилизованные первичные антитела к VEGF-А165, адсорбированные на поверхности лунок микропланшета, связываются с VEGF-А165 в образце. Прореагировавший VEGF-А165 взаимодействовал при инкубации с антителами к VEGF-А165 мыши, связанными с биотином. На третьей стадии биотин на связавшихся антителах взаимодействовал с комплексом стрептавидина с пероксидазой хрена. Количество прореагировавшего стрептавидина определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – тетраметилбензидина (ТМБ). Реакцию останавливали стоп-реагентом (2N H2SO4) и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волне 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце VEGF-A165. Образцы супернатантов хранили при -20о С. Перед началом работы с реагентом его прогревали до комнатной температуры (18-25оС). Непосредственно перед работой супернатанты размораживали.

На первом этапе планшет промывали 3 раза промывочным раствором (0,05% Tween20 в ФБС, pH 7.2-7.4) с помощью автоматического промывателя планшетов. При этом в каждую лунку вносили не менее 400 мкл раствора для промывки. Время между промыванием и аспирацией лунок составляло не менее 30 сек. По окончании промывки остатки влаги из лунок тщательно удаляли, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Далее вносили по 300 мкл раствора для блокирования (1% БСА в ФСБ рН 7.2-7.4) в каждую лунку и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Промывку проводили 3 раза. На подготовленном планшете производили дальнейший анализ.

На втором этапе в лунки А-1, B-1, C-1, D-1, E-1, F-1, G-1, Н-1 вносили по 100 мкл стандартного образца (от 4 нг/мл в серии последовательных разведений), в остальные по 100 мкл исследуемых проб. Плашку закрывали плотно липкой пленкой и инкубировали в течение 2 ч. при комнатной температуре. Промывали 3 раза с помощью автоматического промывателя. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл антител, меченных биотином. Плотно заклеивали планшет новой клейкой пленкой и инкубировали 2 ч. при комнатной температуре. Промывку проводили 3 раза на автоматическом промывателе, как описано выше.

На третьем этапе в лунки с помощью 8-канального дозатора вносили по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, в рабочей концентрации (готовый концентрированный раствор из набора разводили раствором для разведения реагентов в соотношении 1:200). Инкубировали 20 мин. при комнатной температуре без воздействия прямых солнечных лучей, промывали 3 раза, как описано выше. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл ТМБ, инкубировали в темноте 20 мин. или до достижения достаточно интенсивного окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп реагента в каждую лунку. Оптическую плотность измеряли на микропланшетном спектрофотометре EL340 Microplate Reader Biokinetik (Bioech Instruments, США) при длине волны 450 нм, с референсной длинной волны 490 нм. Построение калибровочной кривой и обсчет данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm5.

Исследование выполнено на кроликах-самцах породы Шиншилла (n=52), массой 2,5-3,0 кг, с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными [54]. Каждому животному выполнялись два одинаковых симметричных полнослойных дефекта (без повреждения твердой мозговой оболочки) обеих теменных костей, диаметром по 10 мм. В дефекты правых теменных костей имплантировали ген-активированные остеопластические материалы №1, №2 и №3 (экспериментальные группы 1, 2 и 3, соответственно), в дефекты левых теменных костей (контрольные группы 1, 2 и 3) вносили аналогичные матриксы-носители без плазмидной ДНК. В четырех случаях дефекты левых теменных костей оставлялись без имплантации каких-либо материалов (естественное заживление, контрольная группа 4), а в дефекты правых теменных костей при этом имплантировали ген-активированный материал, состоящий из матрикса-носителя №1 и двухкассетной плазмидной ДНК, несущей гены VEGFA и Gfp (Таблица 6).

Читайте также: Ткань муслин тянется или нет

Цитотоксичность и влияние ген-активированных остеопластических материалов на пролиферативную активность клеток

Изначально, в ходе лабораторного этапа исследования из 10 различных остеопластических материалов были выбраны три – наиболее подходящие в качестве матриксов-носителей плазмидной ДНК, несущей ген VEGFA. Для дальнейших экспериментов in vivo, направленных на оценку безопасности и специфической активности разработанных прототипов ген-активированных материалов, были выбраны два изделия, содержащие наименьшую и наибольшую концентрации генных конструкций. Кроме того, выбранные ген-активированные материалы «Кол/Га + pl-VEGFA» и «ОКФ + pl-VEGFA» имели набольшие перспективы для регистрации и внедрения в клиническую практику в организационном аспекте, так как в качестве матриксов-носителей содержали отечественные остеопластические материалы.

Было установлено, что ни матриксы, ни ген-активированные материалы не обладали цитотоксичностью, лишь в некоторой степени снижали пролиферативную активность клеток в культуре. Результаты оценки специфической активности оказались несколько более сложными для интерпретации. Несмотря на низкий уровень поступления «голой» плазмидной ДНК в клетки, указанные генные конструкции, высвобождаясь из структуры ген-активированных материалов, поступали в ММСК in vitro, приводя к продукции мРНК трансгена и повышению секреции белка VEGF-A165. Максимальное увеличение наблюдалось на 5 сут.: на этой отметке уровень мРНК гена VEGFA в случае ген-активированных материалов «Кол/ГА + pl-VEGFA» и «ОКФ + pl-VEGFA» был больше на 51,6 и 134,3%, соответственно, чем в группах с матриксами-носителями без генных конструкций. Однако концентрация белка VEGF-A165 в средах, кондиционированных ген-активированными материалами, была сопоставима с таковой в случае интактной кульутры ММСК. Детальный анализ полученных данных с учетом результатов определения цитотоксичности и влияния на пролиферативную активность, а также понимание особенностей изменения морфофункциональной активности клеток, эпигенетических механизмов регуляции продукции белков позволяют объяснить полученные результаты.

Во-первых, клетки, находящиеся в течение 12 сут. в культуре под влиянием матриксов-носителей, содержащих фосфаты кальция и гидроксиапатит, могли начать дифференцировку в остеобластическом направлении. В этом случае, по некоторым данным, синтезированный белок VEGF-A165 мог быть использован для нужд самих клеток, как интракринный остеоиндуцирующий фактор [65, 188], что привело бы к снижению его секреции в культуральную среду.

Во-вторых, в части оценки специфического действия генных конструкций определение мРНК трансгена имеет наибольшее значение, нежели определение концентрации терапевтического белка. Это обусловлено тем фактом, что плазмидная ДНК содержит в своем составе ряд регуляторных последовательностей, повышающих эффективность транскрипции трансгена, т.е. в некоторой степени побуждает клетку к экспрессии, что закономерно приводит к повышению продукции мРНК. Максимальный уровень мРНК гена VEGFA был выявлен на 5 сут. со-инкубирования культур ММСК с ген-активированными материалами, статистически значимо превышал показатель интактных культур. В то же время особенностью геннотерапевтического воздействия на клетки-мишени является «мягкость» влияния – клетки сохраняют нормальную реакцию на стимулы микроокружения и при отсутствии необходимости в терапевтическом белке могут нивелировать воздействие генной конструкции за счет посттранскрипционных механизмов регуляции времени жизни мРНК [103]. В результате, несмотря на поступление плазмидной ДНК с геном VEGFA в ММСК, клетки, находящиеся в гипероксических, по сравнению с физиологическими, условиях культивирования могли разрушить синтезированную мРНК трансгена. Это является наиболее очевидной причиной тому, что пик продукции мРНК гена 101 VEGFA на 5 сут. культивирования не привел к ожидаемому пику секреции белка VEGF-A165 на 7 или 10 сут.

В-третьих, учитывая влияние матриксов-носителей на жизнеспособность и морфофункциональную активность клеточных культур, в наибольшей степени проявляющееся, очевидно, в условиях «без замены среды», оценка специфической активности ген-активированных материалов по уровню продукции терапевтического белка в виде сравнения параметра с интактной культурой ММСК недостаточно объективна. Наиболее корректным является сравнение с культурами, со-инкубированными с соответствующими матриксами-носителями. В этой связи, именно данному аспекту было уделено основное внимание при анализе результатов эксперимента. Максимальная, статистически значимая разница в накопленной концентрации белка VEGF-A165 в 25,3 и 33,9 % наблюдалась на сроках в 7 сут. и 10 сут. в случаях ген-активированных материалов «Кол/Га + pl-VEGFA» и «ОКФ + pl-VEGFA», соответственно, при их сравнении с матриксами-носителями без генных конструкций.

Таким образом, с учетом повышения уровня мРНК гена VEGFA под действием ген-активированных материалов с пиком на 5 сут. со-инкубирования с культурами ММСК, а также существенное повышение концентрации белка VEGF-A165 в среде, по сравнению с матриксами без генных конструкций, свидетельствует о реализации специфического действия плазмидной ДНК с геном VEGFA в составе ген-активированных материалов. Иными словами, генные конструкции в условиях in vitro высвобождались из матриксов-носителей, поступали в ММСК и экспрессировались с продукцией мРНК трансгена и терапевтического белка. Ген-активированный материал «ОКФ + pl-VEGFA», несмотря на меньшее содержание генных конструкций, показал более выраженное биологическое действие, что может быть обусловлено повышением эффективности поступления плазмидной ДНК в клетки в составе высвобождающихся из ОКФ микрочастиц фосфатов кальция.