Исследование клеток в культуре ткани это

Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.

Сущность

Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.

В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).

История развития

Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.

В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.

К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.

Типы исследуемого материала

Различают 2 основных вида культур тканей растений:

• Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
• Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.

По способу выращивания выделяют следующие методы:

• на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
• с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
• применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
• выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.

Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.

Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.

Необходимые условия

Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:

• Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
• Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
• Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.

В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).

Достоинства и недостатки

Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:

• хорошая воспроизводимость полученных результатов;
• регулирование межклеточных взаимодействий;
• небольшой расход реагентов;
• генетическая однородность клеточных линий;
• возможность механизации процесса выращивания;
• контроль над условиями содержания клеток;
• низкотемпературное хранение живых культур.

К недостатком данной биотехнологии относят:

• необходимость соблюдения строгих условий асептики;
• нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
• дороговизна химических реагентов;
• неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.

Применение

Метод культуры тканей используется для проведения исследований:

• процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
• межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
• взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
• результатов генетических манипуляций с клетками.

Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:

• получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
• направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
• клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
• выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
• криоконсервация генофонда;
• реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).

Читайте также: Пошив клатча из ткани

Культура клеток тканей и органов растений в биологии: что это за метод

Для правильного решения задания по определению метода культуры тканей необходимо знать, что это такое, в каких отраслях биологии используется. Полное название метода — «Культура клеток, тканей и органов» растений и животных. В основе лежит выращивание клеток, кусочков тканей и даже зачатков органов вне организма. Латинское название этого процесса — in vitro.

Культура тканей — метод биотехнологии

Метод культуры тканей в биологии — длительное сохранение и/или искусственное выращивание клеток и тканей в лабораторных условиях с использованием специальных питательных сред. Культура тканей — это одно из двух направлений культивирования (выращивания и улучшения). Первое — культура клеток. Кусочек ткани извлекают из организма, обрабатывают для разрушения межклеточного вещества. Получится суспензия из отдельных клеток, которую помещают в питательную среду в пробирку.

Метод культуры тканей — это второе направление культивирования. При использовании метода не разрушается межклеточное вещество, сохраняются структура ткани и биохимические процессы. Для культуры тканей растений характерны некоторые отличия от животных. Из одной растительной клетки в определенной питательной среде может развиться росток, а затем полноценное молодое растение.

Использование метода

Метод культуры тканей — это в биологии передовое направление, получившее название «Биотехнология». Производятся необходимые человеку продукты и материалы с использованием живых организмов, развивается культивирование изолированных клеток и тканей в условиях in vitro.

Клеточная инженерия растений — направление не только биотехнологии, но и селекции. Культура тканей растений — это метод, широко применяемый в клеточной инженерии для того чтобы получать и размножать ценные растения. Культивирование растительных клеток, тканей и органов in vitro на питательных средах дает возможность ускорить селекционный процесс и вегетативное размножение.

Значение культуры клеток и тканей — создание высококачественного посадочного материала и размножение генетически однородных растений, получение генетически модифицированных объектов (ГМО, трансгенных организмов). Культивирование клеток животных используется для изучения влияния препаратов на клетки, создания антител к вирусам.

В исторически первых опытах по культивированию тканей в качестве питательного субстрата использовались лимфа, плазма крови, вытяжки из тканей зародышей. Затем были разработаны среды, содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, соли, антибиотики. Питательная среда поддерживает жизнедеятельность культивируемых клеток и тканей точно так же, как это происходит в организме.

Рисунок поможет быстро повторить этапы развития метода культуры клеток и его результаты. Рекомендуем обратить внимание на роль открытия клетки и создания клеточной теории для развития метода культуры тканей. Важнейшие этапы — открытие и получение стволовых клеток, производство вакцин в культуре клеток.

Методы исследования живых клеток и тканей

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности — проследить движение, процессы деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их жизненного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов.

Прижизненные исследования клеток в организме (in vivo).Одним из при­жизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме. С помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюми­наторов, например, можно изучать в динамике циркуляцию крови в мик­рососудах. После проведения анестезии у животного объект исследования (например, брыжейка кишечника) выводят наружу и рассматривают в мик­роскопе, при этом ткани должны постоянно увлажняться изотоническим раствором натрия хлорида. Однако длительность такого наблюдения огра­ничена. Лучшие результаты дает метод вживления прозрачных ка­мер в организм животного.

Наиболее удобным органом для вживления таких камер и последующего на­блюдения является ухо какого-либо животного (например, кролика). Участок уха с прозрачной камерой помещают на предметный столик микроскопа и в этих услови­ях изучают динамику изменения клеток и тканей в течение продолжительного вре­мени. Таким образом могут изучаться процессы выселения лейкоцитов из кровенос­ных сосудов, различные стадии образования соединительной ткани, капилляров, нервов и другие процессы. В качестве естественной прозрачной камеры можно ис­пользовать глаз экспериментальных животных. Клетки, ткани или образцы органов помещают в жидкость передней камеры глаза в угол, образованный роговицей и радужкой, и могут наблюдаться через прозрачную роговицу. Таким образом была произведена трансплантация оплодотворенной яйцеклетки и прослежены ранние стадии развития зародыша. Обезьянам были пересажены небольшие кусочки матки и изучены изменения слизистой оболочки матки в различные фазы менструального цикла.

Читайте также: Как украсить открытку тканью

Широкое применение нашел метод трансплантации клеток кро­ви и костного мозга от здоровых животных-доноров животным-реципиен­там, подвергнутым смертельному облучению. Животные-реципиенты после трансплантации оставались живыми вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток. Исследова­ние числа колоний и их клеточного состава позволяет выявлять количество родоначальных кроветворных клеток и различные стадии их дифференци­ровки. С помощью метода колониеобразования установлены источники раз­вития для всех клеток крови.

Витальное и суправитальное окрашивание.При витальном (прижиз­ненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм жи­вотного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточное вещество. Например, с помощью трипанового синего или литиевого кармина выявляют фагоциты, а с помощью ализа­рина — новообразованный матрикс кости.

Суправитальным окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом выявляют молодые фор­мы эритроцитов — ретикулоциты крови (краситель бриллиантовый крези-ловый голубой), митохондрии в клетках (краситель зеленый янус), лизосомы (краситель нейтральный красный).

Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro).Этот метод является одним из самых распространенных. Выделенные из организма че­ловека или животных клетки, маленькие образцы тканей или органов по­мещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду, — плазму крови, эмбриональный экстракт, а так­же искусственные среды. Различают суспензионные культуры (клет­ки взвешены в среде), тканевые, органные и монослойные культуры (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечи­ваются стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют ос­новные показатели жизнедеятельности — способность к росту, размноже­нию, дифференцировке, движению. Такие культуры могут существовать многие дни, месяцы и даже годы, если обновлять среду культивирования и пересаживать жизнеспособные клетки в другие сосуды. Некоторые виды клеток благодаря изменениям в их геноме могут сохраняться и размножать­ся в культуре, образуя непрерывные клеточные линии. В разработку методов культивирования клеток и тканей большой вклад внесли А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. Г. Хлопин, А. Д. Тимофеевский, Ф. М. Лазаренко. В на­стоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпи-телиоцитов, макрофагов и др., которые существуют многие годы.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд зако­номерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, клеточных взаимодействий, взаимодействий клеток с вирусами и микроба­ми. Показана возможность хрящевых клеток формировать в культуре меж­клеточное вещество и способность клеток надпочечников продуцировать гормоны. Культивирование эмбриональных тканей и органов дало возмож­ность проследить развитие кости, кожи и других органов. Разработана мето­дика культивирования нервных клеток.

Особую значимость метод культуры тканей имеет для проведения эк­спериментальных наблюдений на клетках и тканях человека. Взятые из организма человека клетки при пункции или биопсии могут в культуре тканей использоваться для определения пола, наследственных заболева­ний, злокачественного перерождения, выявления действия ряда токсич­ных веществ.

В последние годы клеточные культуры широко применяются для гиб­ридизации клеток.

Разработаны методы разделения тканей на клетки, выделение отдельных типов клеток и их культивирования.

Вначале ткань превращают в суспензию клеток путем разрушения межклеточных контактов и межклеточного матрикса с помощью протеолитических ферментов (трип­син, коллагеназа) и соединений, связывающих Са 2+ (с помощью ЭДТА — этиленди-аминтетрауксусной кислоты). Далее полученную суспензию разделяют на фракции клеток различных типов с помощью центрифугирования, позволяющего отделить более тяжелые клетки от легких, большие от малых, или путем прилипания клеток к стеклу или пластмассе, способность к которому у различных типов клеток неодина­кова. Для обеспечения специфического прилипания клеток к поверхности стекла ис­пользуют антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа. Прилип­шие клетки затем отделяют, разрушая матрикс ферментами, при этом получают взвесь однородных клеток. Более тонким методом разделения клеток является мече-ние антителами, связанными с флюоресцирующими красителями. Меченые клетки отделяются от немеченых с помощью сортера (электронного флюоресцентно-активи­руемого клеточного анализатора). Клеточный анализатор сортирует в 1 с около 5000 клеток. Выделенные клетки можно изучать в условиях культивирования.

Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, раз­множение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками, влияние гор­монов, факторов роста и др.

Читайте также: Мышечная ткань растения особенности строения

Культуры обычно готовят из суспензии клеток, полученной вышеописанным методом диссоциации ткани. Большинство клеток неспособны расти в суспензии, им необходима твердая поверхность, в качестве которой используют поверхность пластиковой культуральной чашки, иногда с компонентами внеклеточного матрик-са, например коллагена. Первичными культурами называют культуры, приготовлен­ные непосредственно после первого этапа фракционирования клеток, вторичны­ми — культуры клеток, пересаженные из первичных культур в новую среду. Можно последовательно перевивать клетки в течение недель и месяцев, при этом клетки сохраняют характерные для них признаки дифференцировки (например, клетки эпителия образуют слои). Исходным материалом для клеточных культур обычно слу­жат эмбриональные ткани и ткани новорожденных.

В качестве питательных сред используют смеси солей, аминокислот, витами­нов, лошадиной сыворотки, экстракт куриных эмбрионов, эмбриональную сыво­ротку и др. В настоящее время разработаны специальные среды для культивирова­ния различных типов клеток. Они содержат один или несколько белковых факторов роста, необходимых клеткам для жизнедеятельности и размножения. Например, для роста нервных клеток необходим фактор роста нервов (ФРН).

У большинства клеток в культуре наблюдается определенное число делений (50-100), а затем они погибают. Иногда в культуре появляются мутантные клетки, которые размножаются бесконечно и образуют клеточную линию (фибробласты, эпителиоциты, миобласты и др.). Мутантные клетки отличаются от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, но могущих расти без прикрепления к твердой поверхности. Раковые клетки в культуральных чашках образуют более плот­ную популяцию, чем популяции обычных клеток. Аналогичное свойство можно вызвать экспериментально у нормальных клеток путем трансформации их опухоле-родными вирусами или химическими соединениями, при этом образуются неопла-стически трансформированные клеточные линии. Клеточные линии нетрансформи-рованных и трансформированных клеток можно длительно сохранять при низких температурах (-70 °С). Генетическую однородность клеток усиливают клонировани­ем, когда из одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию однородных клеток. Клон — это популяция клеток, происходящих из од­ной клетки-предшественника.

Клеточные гибриды.При слиянии двух клеток различных типов образу­ется гетерокарион — клетка с двумя ядрами. Для получения гетерока-риона суспензию клеток обрабатывают полиэтиленгликолем или инактиви-рованными вирусами для повреждения плазмолемм клеток, после чего клет­ки способны к слиянию. Например, неактивное ядро эритроцита курицы становится активным (синтез РНК, репликация ДНК) при слиянии кле­ток и переносе в цитоплазму другой клетки, растущей в культуре ткани. Ге­терокарион способен к митозу, в результате чего образуется гибридная клет­ка.Оболочки ядер у гетерокариона разрушаются, и их хромосомы объеди­няются в одном большом ядре.

Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома. Например, в гибридной клеточной линии «мышь — человек» установлена роль хромо­сомы 11 человека в синтезе инсулина.

Гибридомы.Клеточные линии гибридом используют для получения мо-ноклональных антител. Антитела вырабатываются плазмоцитами, которые образуются из В-лимфоцитов при иммунизации. Определенный вид анти­тел получают при иммунизации мышей конкретными антигенами. Если клонировать такие иммунизированные лимфоциты, то можно получить большое количество однородных антител. Однако время жизни В-лимфоци­тов в культуре ограничено. Поэтому производят их слияние с «бессмертны­ми» опухолевыми клетками (В-лимфомы). В результате образуются гибридо мы (гибрид-клетка, с геномом от двух разных клеток; ома — окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Каждый клон гиб­ридомы является источником моноклональных антител. Все молекулы анти­тел данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания анти­генов. Можно получать моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке, и использовать их для установления локализации белков в клетке, а также для выделения белка из смеси (очистка белков), что позволяет исследовать структуру и функцию белков. Моноклональные антитела применяют также в технологии клонирования генов.

Антитела можно использовать для изучения функции различных моле­кул, вводя их через плазмолемму непосредственно в цитоплазму клеток тонкой стеклянной пипеткой. Например, введение антител к миозину в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки морского ежа останавливает раз­деление цитоплазмы.

Технология рекомбинантных ДНК.Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных орга­низмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы гибридизации широко используют в современной биологии для изучения структуры генов и их экспрессии.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

• Свежие записи
  • Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
  • Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
  • Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
  • Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
  • Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом