1 Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 о С в течение 1,5-2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 о С и давлении 0,75- 1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 о С.
Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому проводится поверхностная стерилизация. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Время стерилизации зависит от объекта, стерилизующего материала. По Бутенко Р.Г. сухие семена в среднем – время стерилизации 10-20 минут, семена набухшие – 6-10 минут, листья – 3-5 минут.
После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружные слои клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.
Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Поэтому, кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, которые и убивают микробы внутри ткани. Следует, однако, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик.
На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы – свет, температура, аэрация, влажность.
Свет.Большинство каллусных тканей могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процесс вторичного синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света.
Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 о С. Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров.
При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.
Влажность.Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70 %.
2 Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток. Пролиферация – это новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих. Каллус (от лат. callus – «толстая кожа», «мозоль») – особый тип ткани, образующийся на целом растении в результате его ранения. Он защищает место травмы, накапливает питательные вещества и способствует регенерации специального защитного слоя или утраченного органа. Подобные клетки возникают и в культуре клеток и тканей. Фрагмент ткани или органа, так называемый эксплант, помещенный на подходящую по составу питательную среду, через некоторое время начинает расти и превращается в массу недифференцированных клеток – каллус. Этот процесс называется каллусообразованием, или каллусогенезом.
Специализированные неделящиеся клетки возобновляют клеточные деления, то есть вновь возвращаются к меристематическому состоянию. Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации называется дедифференциацией. Дифференциация — это комплекс процессов, приводящих к различиям между материнскими и дочерними клетками, а также между дочерними клетками. В результате дифференциации клетки, казавшиеся до того сходными, приобретают морфологические различия и начинают выполнять разные физиологические функции. При дедифференциации и образовании каллуса наблюдается обратное: клетки теряют структуры, характерные для их специфических функций, и возвращаются к состоянию делящейся клетки, т.е. они как бы обезличиваются, становятся одинаковыми.
Читайте также: Производство льняной ткани в ярославле
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определяют, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной.
Получение культуры каллуса, суспензионных культур и одиночных клеток
Основным типом поверхностно культивируемых растительных клеток является каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений.
Классическая каллусная культура, выращиваемая поверхностным способом, (первичный каллус) представляет собой аморфную, рыхлую массу сильно оводненных дедифференцированных клеток, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. Такая рыхлая каллусная ткань легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и поэтому может быть использована для получения суспензионной культуры. Под влиянием фитогормонов клетки первичного каллуса могут претерпевать процессы вторичной (обратно) дифференцировки и органогенеза, что существенно сказывается на внешнем виде и консистенции (плотности) каллуса. Так каллусная культура средней плотности уже характеризуется хорошо выраженными меристематическими очагами. В ней легко инициируются процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов, которые могут дать начало целым растениям.
Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им неограниченный рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе органогенеза, т.е. не являются тотипотентными. Каллусные клетки в культуре иногда могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов. Потеря гормонозависимости приводит к тому, что такие клетки не могут претерпевать вторичную дифференцировку, что не позволяет использовать такие клеточные культуры для получения вторичных метаболитов
В естественных условиях каллусная ткань может возникнуть у растений в результате механических повреждений. Она функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса.
Методика искусственного получения каллусной культуры у растений хорошо отработана и не вызывает затруднений. Для того чтобы получить культуру ткани, из любой части растения (стебель, лист, элемента цветка, корень и т.д.), вычленяют эксплантат (кусочек ткани размером 0,5 — 1,0 см), стерилизуют его и помещают на питательную среду определенного состава.
Важнейшую роль в индуцировании каллусообразования на эксплантатах является наличие в питательных средах специфических фитогормонов – ауксинов и цитокининов. Функции этих двух групп фитогормонов в каллусогенезе различны, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки и последующей вторичной дифференцировки клеток и подготавливают их к делению, а цитокинины инициируют деление. Во время процесса дедифференцировки, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные, индивидуальные черты исходной ткани (потерять некоторые органеллы, в частности хлоропласты и некоторые запасные вещества, такие как крахмал, некоторые белки и липиды).
Различные типы фитогормонов, и, прежде всего их соотношение в среде культивирования, играют определяющую роль и во вторичной дифференцировке каллусных клеток.
Через несколько дней на изолированном кусочке ткани растения образуется первичный каллус. Периодически в асептических условиях его отделяют и переносят на свежую питательную среду для дальнейшего роста. Такую ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически расчленяя ее и пересаживая на свежую питательную среду. Рост пересаженных тканей происходит в контролируемых условиях при температуре 24-28°С.
Читайте также: Waxed canvas ткань это
Формирование каллуса длится обычно 1-2 месяца. Периодичность субкультивирования тканей зависит от скорости роста биомассы. Внешне такая ткань совершенно не похожа на растение, от которого она была получена, но ее клетки несут генетическую информацию, свойственную данному виду. Процессы, происходящие в культивируемых тканях, в принципе не отличаются от идущих в тканях целого растения. Сохранение способности к синтезу специфических вторичных метаболитов — алкалоидов, эфирных масел, карденолидов, стероидов и др. — определяет практическую ценность культур растительных тканей для создания технологий промышленного выращивания биомассы клеток в качестве принципиально нового вида лекарственного сырья. Кроме того каллусные клетки сохраняют свойство тотипотентности, что используется в технологии моноклонального размножения растений.
Другим вариантом культивирования растительных клеток является суспензионная культура, которую выращивают в жидкой питательной среде, по аналогии с процессом глубинного культивирования в промышленной микробиологии.
Культивирование клеток растений в жидкой среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием поверхностным способом каллусных культур. В условиях глубинного культивирования значительно легче контролировать метаболизм и рост клеточных популяций с помощью различного рода экзогенных факторов. Суспензионные культуры намного удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов, процессов экспрессии генов, изолирования и характеристик получаемых мутантов и т. п.
Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для получения суспензионных культур пред-почтительнее брать каллусы рыхлого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са 2+ . С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2-4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-D) или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добавлении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно получить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном автоматическом перемешивании. Дедифференцированные клетки отрываются от экспланта, образуя в питательной среде суспензию, состоящую из клеточных агрегатов различного состава. Качество суспензии определяется степенью агрегированности. Агрегаты должны содержать не более 10-12 клеток. Состояние клеточных суспензий характеризуется плотностью клеточной популяции. За 14 — 16 дней (средняя длительность культивирования) плотность обычно повышается от 5•10 4 до 5х10 6 кл/мл.
Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирования клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в присутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следовательно, можно сказать, что суспензионные культуры представлены разными агрегатами каллусных клеток.
Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехнологии. Их культивируют в больших количествах для получения вторичных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить максимальный выход продукта.
Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Однако культивирование одной или нескольких клеток связана с определенными трудностями, состоящими в том, что одиночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые разработаны для нормального роста и размножения клеток каллусной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток потребовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего фактора» — совокупности метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или небольшое их количество, они не делятся, так как выделяемого кондиционирующего фактора не хватает для индукции деления. Следовательно, необходимо повысить концентрацию фактора в питательной среде. Этой цели служат следующие методы:
Читайте также: Какая ткань составляет у человека основу мышц конечностей ответ
1. Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки» (рис. ).
2. Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. ).
3. Кондиционирование среды — осуществляется путем добавления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.
4. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (-20 мкл) богатой питательной среды.
Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно. Согласно исследованиям), этот фактор водорастворим, термостабилен, не заменяется фитогормонами, включает низкомолекулярные вещества. Химическая природа кондиционирующего фактора доказывается с помощью довольно простого эксперимента. Если разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной пластиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин поместить микропористый целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление одиночных клеток (рис. ).
Клетки животных так же способны расти либо в виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату (твердой поверхности). Такие клетки как, HeLa (клетки, происходящие из опухоли человека) могут расти в любом из этих состояний неограниченно долго; лимфобластомные клетки растут в суспендированных культурах; а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности и в виде монослоя (монослойное культивирование). Как только вся поверхность будет покрыта клетками, развитие культуры резко тормозится (контактное торможение), снижается синтез целевых метаболитов и происходит перерождение или отмирание клеток. Для предотвращения этих нежелательных процессов приходится периодически проводить пересев (перевивку) культуры на свежую питательную среду и новую поверхность. При этом нормальные (неопухолевые) клетки могут выдерживать от 20 до 50 делений и далее подвергаются дегенерации и погибают.
Монослойное культивирование животных клеток во многом определяется доступностью поверхности для их прикрепления, вследствие чего многие конструкторские разработки направлены на создание методов увеличении возможной площади прикрепления. Ранние технологии основывались преимущественно на использовании вращающихся пробирок или флаконов с целью лучшего обеспечения растущих клеток питательными веществами и воздухом.
Создаваемые в последнее время системы предназначаются для поддержания роста клеток на свернутых в виде «бухт» проницаемых для газов тефлоновых трубочках, каждая из которых имеет поверхность около 10 000 см 2 (а общее их число в реакторе более 20). В таких условиях многие типы клеток культивируются довольно хорошо. Еще одним перспективным способом культивирования клеток животных является способ, основанный на использовании небольших бусин (шариков, микроносителей), к которым прикрепляются клетки. Шарики могут изготавливаться из сефадекса (химически модифицированный крахмал) и обладать поверхностью в 7 см 2 на 1 мг. Шарики способны плавать в суспендированном состоянии и на них могут расти клетки различных типов. Таким путем уже получают человеческий интерферон. Данный способ, полагают, способен заменить метод монослойных культур.
В отличии растений культивирование фрагментов или целых органов животных представляет значительно более сложную задачу. Это связано с тем, что очень сложно создать для них необходимые условия из — за повышенной потребности в питательных веществах и кислороде. Так кусочки печени растут в питательной среде при содержании в газовой фазе 95% О2 и 5%СО2. Длительное культивирование целых взрослых органов пока представляет собой неразрешимую задачу. Гораздо легче удается культивировать различные эмбриональные органы и их фрагменты. Особенно перспективным представляется в настоящее время культивирование так называемых стволовых клеток (аналоги меристемных клеток растений).
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом