Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3
4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Как обнаружить наличие вируса в организме?
В сложный период информируем о том, как с помощью лабораторных исследований можно обнаружить вирусную и/или бактериальную инфекции в организме.
Наличие в организме вируса приводит к воспалению. Воспаление характеризуется повышением уровня воспалительных маркеров. С помощью лабораторного теста вы можете узнать о воспалении в организме.
Маркёры и воспаления:
- С-реактивный белок ультра-чувствительный
- ОАК ( общий анализ крови)
- ОАМ ( общий анализ мочи )
- IL-6
- Фибриноген
- Ферритин
- Прокальцитонин
Скачать полный список анализов
Узнайте о наличии вируса или бактерии в организме всего за 4 шага:
Если у вас нет карты Биоцентр — оставьте заявку на получение. Это бесплатно.
Скачайте список анализов, которые могут сигнализировать о воспалении в организме.
Сдайте анализы со скидкой 15% по программе БИОЦЕНТР.
На основании анализов, получите от специалистов БИОЦЕНТР рекомендации
Почему для выявления вируса или бактерии в организме необходимо сдавать именно эти анализы?
Белки острой фазы и маркеры воспаления необходимы для мониторинга течения заболеваний и контроля лечения. К ним относятся:
- С-реактивный белок повышается сразу после возникновения заболевания (в первые 6-12 часов, максимум – на 2-е сутки); при наличии воспалительного процесса увеличивается в десятки и сотни раз, что делает тест очень чувствительным. Показатель этого белка позволяет определить вирусную и бактериальную инфекцию по степени концентрации. При эффективном лечении уровень белка быстро снижается уже на 2-е сутки, что позволяет контролировать течение болезни. Измерение уровня СРБ широко применяется для мониторинга эффективности терапии бактериальных, вирусных инфекций, при обострении хронических воспалительных заболеваний.
- Антистрептолизин-О (АСЛО) — маркер острой стрептококковой инфекции. Антитела к АСЛО могут быть обнаружены через 1-3 недели после инфицирования и достигать максимальных значений на 3-6 неделе.
- Прокальцитонин повышается в течение 6-12 часов при воспалительном процессе.
- Фибриноген. Определение концентрации фибриногена в плазме крови наиболее широко используемый тест, применяющихся не только при диагностике нарушений гемостаза, но и при распознавании и оценке тяжести воспалительных, иммунных, деструктивных и неопластических процессов, при которых возникает гиперфибриногенемия как острофазовая реакция. Концентрация ферритина резко возрастает при инфекциях, при воспалительных реакциях или при раке.
- Интерлейкин-6 (ИЛ-6) – провоспалительный цитокин, оказывающий влияние на многие органы и системы организма: кровь, печень, иммунную и эндокринную системы, обмен веществ. Он синтезируется активированными моноцитами/макрофагами, фибробластами, эндотелиальными клетками при воспалении, травмах, гипоксии, бактериальных инфекциях. Биологическая роль ИЛ-6, в первую очередь, заключается в индукции восстановительных механизмов и активации иммунной защиты (активация и дифференцировка Т-клеток, созревание В-клеток, синтез С-реактивного белка в печени, усиление гемопоэза). Является маркером острых системных воспалений. Избыточная продукция интерлейкина-6 вызывает повреждение тканей вследствие аутоиммунной реакции.
Сколько длится инкубационный период COVID‑19?
Инкубационный период – это период времени между заражением и появлением клинических симптомов болезни. Согласно большинству оценок среднее время инкубации нового коронавируса составляет 5,1 дня; в течение 11,5 дней симптомы проявляются у 97,5 процентов заболевших.
При этом особенностью нового коронавируса является то, что его латентный период — время от передачи до начала инфекционной активности — может быт даже короче, чем инкубационный период. То есть, инфицированный человек может представлять опасность для окружающих, даже если у него еще не начали проявляться симптомы заболевания.
Сделать выводы о предполагаемом диагнозе можно исходя из жалоб пациента. Главный момент в диагностике – использование фонендоскопа для прослушивания дыхательных путей.
Однако если воспалительный процесс локализуется где-то глубоко, то врач может просто ничего не услышать. На сегодняшний день выделяют два вида диагностики: инструментальная и лабораторная.
Диагностика и клиническая классификация COVID-19
По возможности следует проводить раннюю диагностику, лечение и изоляцию. Для раннего выявления пациентов, у которых может развиться тяжелая и критическая форма заболевания, целесообразно наблюдение в динамике за параметрами лабораторных исследований ,визуализации легких, индексом оксигенации и уровнем цитокинов.
Коэффициент смерти Германии для коронавируса до сих пор-0.5 % — самый низкий в мире. Эксперты сообщают, что это потому, что тестируют рано и часто: около 120,000 человек в неделю.
Ранняя диагностика с помощью простых, доступных тестов лабораторных исследований позволит Вам обнаружить вирусную и/или бактериальную инфекцию на РАННЕЙ СТАДИИ РАЗВИТИЯ!
2.Культивирование вирусов в культуре ткани
Характеристика культур тканей. Культуры тканей (или культуры клеток)- это клетки тканей, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др., а также культуры клеток злокачественных опухолей). Для выращивания культур клеток наибольшее распространение получили синтетические и полусинтетические среды, которые содержат все необходимые вещества (соли, витамины, аминокислоты и т.д.). Например, среда 199, среда Игла, раствор альбумина бычьей плазмы, солевой раствор Хенкса с сывороткой.
Однослойные первичные культуры тканей — это взвесь клеток, полученная путем обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папаин и др.). Трипсинизацией достигается разделение клеток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду, растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани.
Перевиваемые клетки — это культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях мира имеется много перевиваемых культур, полученных из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Hela- клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер -2- клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штаммы клеток Детройт 6- клетки, выделенные из костного мозга человека больного раком легких;
4) штаммы клеток А-О и А-I- клетки амниона человека; 5) штаммы клеток СОЦ- клетки сердца обезьяны и др.
Техника заражения культур клеток состоит в следующем. Берут пробирку с заранее выращенной монослойной культурой клеток. Вирус (например, вирус вакцины) разводят средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой клеток стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят 1 мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают помещают в термостат в горизонтальном положении.
3.Обнаружение вирусов в культуре клеток
а) Изучение внутриклеточных включений. Универсальным методом окраски внутриклеточных включений является окраска по Манну. Внутриклеточные включения при бешенстве (тельца Негри) обнаруживается в нервных клетках аммонова рога и в клетках Пуркинье мозжечка. При окраске по Манну- тельца Негри красного цвета на голубом фоне цитоплазмы.
б) Цитопатический эффект (или цитопатическое действие)- это дегенерация клеток, возникающая под воздействием вируса размножающегося в культуре ткани. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток.
в) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности поврежденных вирусом клеток.
г) Метод бляшек предложен Дюльбеком для получения изолированных колоний вируса. Метод заключается в следующем. В специальном флаконе выращивают на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор- нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.
д) Метод флюоресцирующих антител.
Основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флюоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препараты промывают физ.раствором, подсушивают и фиксируют ацетоном. Затем обрабатывают специфической сывороткой. Просмотр препарата производят с помощью люминисцентного микроскопа. В местах локализации вируса появляется специфическое свечение под воздействием флюоресцирующих антител.
е) Обнаружение вируса в культуре ткани методом «цветной пробы».
В основу «цветной реакции» положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, сдвигающие рН среды в кислую сторону. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, метаболизм их подавляется и не происходит изменения рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7- оранжевый, рН ниже 7- желтый. Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой) рН питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. Если вирус размножается, то клетки дегенерируют и среда сохраняет исходный красный цвет.