Выделение ДНК: первый этап генетического анализа
Рассказываем, как устроен первый этап генетического исследования — выделение геномной ДНК из крови, слюны и других биологических образцов.
Что такое ДНК
ДНК — это длинная молекула с отрицательным зарядом: она кодирует инструкцию по сборке отдельных белков, клеток, тканей и целых организмов. ДНК содержится во всех клетках за редкими исключениями: например, зрелые эритроциты млекопитающих теряют ядро с генетическим материалом, чтобы лучше переносить кислород. Поэтому выделить ДНК можно из любой ткани живого или мертвого организма — вопрос только в том, сколько усилий придется затратить.
Сотрудники лаборатории Genotek успешно справлялись с иголками сосны, стволовыми клетками, йогуртами, зародышами лягушек, сердцами мышей и золотистым стафилококком, а автор этой статьи на студенческом практикуме выделяла ДНК из консервированной кукурузы. Но чаще всего источником генетического материала для анализа становится кровь или слюна человека.
Зачем выделять ДНК?
Обработка биоматериала и выделение ДНК — это первый этап молекулярно-биологического исследования. Генетический материал хранится в ядрах клеток, которые нужно разрушить, иначе ДНК не выйдет в раствор и будет недоступна для анализа. Из клеток животных часть ДНК можно высвободить простым нагреванием, а вот с клетками растений это не пройдет: они защищены прочной клеточной стенкой из целлюлозы.
Чтобы анализ прошел успешно, важно очистить ДНК от примесей. Примеси ингибируют активность ферментов, которые нужны для подготовки образка к анализу на секвенаторе или чиповом анализаторе.
Самые распространенные ингибиторы в биологических тканях — это гем (компонент эритроцитов, который позволяет им переносить кислород), коллаген в костях и других соединительных тканях, меланин в волосах и коже, ароматические соединения в растительных образцах, миоглобин в тканях мыщц (1, 2). В слюне анализу мешают остатки пищи и консервант, который используется для хранения и перевозки образца: он содержит SDS, ингибирующий работу ферментов. При перевозке SDS защищает ДНК от разрушения, но при попадании в реакционную смесь нарушает работу ДНК-полимеразы.
Кто выделил ДНК первым
Открыл ДНК швейцарский врач Фридрих Мишер, когда изучал лейкоциты из гноя на хирургических повязках. В 1869 году Мишер заметил, что при выделении белков из лейкоцитов в осадок выпадает вещество с кислотными свойствами, которое он назвал «нуклеином». Позднее Мишер использовал для получения нуклеина молоки лососевых рыб, которых собственноручно ловил в Рейне, и писал о роли вещества в оплодотворении. Однако роль ДНК в передаче наследственной информации еще долго не замечали: ученые считали, что она слишком просто устроена для вещества, в котором записаны наследственные признаки. Только через 83 года генетическую роль нуклеиновой кислоты установили исследователи Херши и Чейз.
В 1952 году Херши и Чейз доказали, что наследственная информация содержится в ДНК, а не белках, как считали до этого. Ученые работали с бактериофагом Т2 — вирусом, заражающим кишечную палочку.
Бактериофаг состоит из белковой оболочки и молекулы ДНК внутри нее. Оболочка содержит атомы серы, а ДНК аккумулирует 99% фосфора. Херши и Чейз кормили бактериофагов радиоактивными изотопами фосфора и серы, чтобы меченые атомы включились в состав оболочки и ДНК.
Радиоактивными фагами ученые заражали бактерий и изучали вирусное потомство. Так они выяснили, что дочерние фаги наследуют 30% меченого фосфора и менее одного процента серы.
При заражении белковая оболочка вируса остается прикрепленной к мембране клетки, а внутрь нее попадает только ДНК. Херши и Чейз отмыли оболочки с поверхности клеток, чтобы проверить, нужны ли они для размножения фагового потомства. Оказалось, что без белковых «теней» фаги размножаются так же эффективно, как с ними.
Результаты эксперимента А. Херши и М. Чейз стали решающим доказательством роли ДНК в передаче наследственной информации.
Как выделяют ДНК в лаборатории
В лаборатории Genotek выделение ДНК полностью автоматизировано: робот не ошибается и не устает. Процесс выделения происходит в несколько шагов:
- Разрушаем мембраны клеток и клеточных ядер, чтобы все содержимое клетки — ДНК, белки, липиды и сахара — вышло в раствор. Для этого используем лизисный буфер с детергентом SDS (для слюны) или тиоцианатом гуанидина (для крови). Детергент разрушает мембраны, а буферный компонент раствора поддерживает pH на оптимальном для ДНК уровне. Лаурилсульфат натрия (SDS) входит в состав обычного шампуня, а вот тиоцианат гуанина токсичен и вызывает щелочные ожоги при попадании на кожу. Его агрессивные денатурирующие свойства используют при изучении испанского гриппа: инактивированные вирусные частицы становятся безопасными для исследователей.
- Избавляемся от белков. Вышедшую в раствор ДНК нужно освободить от связанных с ней белков. Одновременно с этим необходимо инактивировать ДНКазы — ферменты, которые атакуют «оголенную» ДНК. За разрушение клеточных белков отвечает еще один компонент лизисного буфера — протеина К, фермент, который получают из микроскопических грибов рода Engyodontium album. Буква К в названии указывает на способность расщеплять кератин, белок ногтей и волос.
- Отделяем ДНК от примесей. Центрифугируем раствор в пробирках с кремниевой мембраной, которая связывается с ДНК и пропускает остальные органические компоненты клетки. Центрифугирование многократно увеличивает скорость фильтрации сквозь мембрану. Мембрану со связанной ДНК несколько раз промывают спиртом — изопропанолом или этанолом.
- Растворяем ДНК в буфере для хранения. Связанную с мембраной ДНК отмывают буфером для элюции (элюцией называют процесс выведения в раствор адсорбированного вещества). Растворенная в буфере ДНК может храниться при −20°С в течение нескольких лет.
Читайте также: Новогодние скатерти своими руками из ткани
Как оценить качество ДНК
При неправильном сборе, некорректном или слишком долгом хранении биологических образцов ДНК в клетках разрушается. Такие образцы подходят для анализа небольших фрагментов генома (например, при установлении отцовства), но непригодны для исследований, где важно прочитать всю генетическую последовательность (секвенирование) или проанализировать одновременно сотни тысяч нуклеотидов в разных участках ДНК (генотипирование на микрочипах).
Отсутствие деградации геномной ДНК проверяют электрофорезом в агарозном геле. Под действием тока отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся к аноду со скоростью, пропорциональной их размеру. Геномная ДНК хорошего качества выглядит на форезе четкой полоской, а некачественная ДНК «шмерит» — формирует градиент из фрагментов разных длин. Такой образец нельзя брать на анализ.
Что делать, если контроль не пройден
Важно, чтобы ДНК не разрушилась при перевозке и хранении биообразца. Для этого в пробирку добавляют консервант. Если слюны больше, чем требуется, консервант не сработает. Если слюны мало, ДНК не хватит для анализа. Поэтому все поступившие в лабораторию пробирки оценивают визуально и в случае проблем сразу отправляют на перезабор.
Иногда не получается выделить качественную ДНК из внешне пригодного образца. Тогда лаборатория делает вторую попытку, используя оставшуюся порцию слюны, чтобы исключить технические ошибки. Если она тоже оказывается неудачной, мы приглашаем клиента на перезабор и просит внимательно соблюдать правила сдачи биоматериала: важно, чтобы в слюне оказалось достаточно клеток эпителия щек и не было посторонних примесей.
К сожалению, в слюне некоторых людей от природы содержится слишком мало ДНК. Поэтому, если на «пересдаче» человек проваливается, мы предлагаем ему сдать кровь.
ДНК, прошедшую контроль качества, направляют на секвенирование или генотипирование на микрочипах.
Методы выделения нуклеиновых кислот. Часть 1: выделение ДНК из образца ткани
Современная молекулярная биология (на слэнге – «молекулярка», «мокрая» биология) выросла из классической биохимии, генетики и цитологии.
Областью интересов молекулярных биологов стали матричные процессы в клетке – механизмы передачи генетической информации от молекулы носителя – ДНК/РНК до функциональных молекул – РНК и белков.
Сегодня мы становимся свидетелями взрывного развития этой области знаний, а разрабатываемые исследователями методы и подходы выходят за пределы университетов и НИИ, проникая во многие сферы нашей жизни, в том числе и в клиническую практику.
Началом молекулярной биологии можно считать первый успешный опыт по выделению ДНК из лейкоцитов гноя на хирургических повязках, осуществлённый еще в 1868 году швейцарским биохимиком Фридрихом Мишером.
В те далёкие годы еще ничего не было известно о структуре молекулы ДНК, а рассуждения о её возможной роли носителя генетической информации не принимались научным сообществом (считалось, что генетическая информация сокрыта в сложно устроенных белках, а ДНК «слишком просто устроена» для выполнения такой важной роли).
Читайте также: Изготовление кукол из ткани история
Сегодня методы выделения ДНК являются базой, с которой начинается практически любое молекулярно-биологическое исследование.
Первые шаги
Итак, с чего же стоит начать, если вы на досуге решите повыделять ДНК из себя или своих родных и близких?
Первым делом вам нужно разрушить образец ткани, чтобы ДНК вышла из повреждённых клеток в раствор. Этот процесс называется лизирование. В качестве источника ДНК можно использовать практически любой биологический образец – слюну, кровь, волосы, ногти, биопсийный материал и т.д.
В зависимости от природы образца степень ваших усилий по его разрушению будет варьировать – если к слюне или крови можно просто добавить лизирующий агент, то в случае крупных кусочков ткани придется сначала «поработать ручками» и хорошенько диспергировать ткань (порвать ножницами или подавить браншами пинцета, растереть в жидком азоте, при необходимости предварительно декальцинировать ткань или депарафинизировать блок).
ЧТО ВАЖНО ПОМНИТЬ! При простом лизировании клеток в раствор попадает ВСЯ ДНК, содержащаяся в клетке – и геномная ДНК из ядра, и митохондриальная ДНК, и ДНК внутриклеточных эндосимбионтов. Такую выделяемую ДНК мы называем тотальной (или суммарной). Для большинства молекулярно-биологических исследований этого вполне достаточно. Тем не менее, если вам требуется получить именно геномную ядерную ДНК, то вам следует предварительно изолировать из клеток ядра.
После того, как ДНК выходит в раствор, она оказывается в очень агрессивном окружении – из цитоплазмы разрушающихся клеток в раствор также выходят ДНКазы (экзо- и эндонуклеазы) – ферменты, расщепляющие свободные нуклеиновые кислоты. На этом этапе нам важно тем или иным образом их инактивировать.
После уже можно заняться решением следующего вопроса – каким-то образом отделить ДНК от мешанины клеточных остатков и белков, а затем собрать её для хранения и дальнейшего использования.
На настоящий момент существует множество протоколов выделения ДНК из различных тканей. Для начала я предлагаю подробнее рассмотреть метод фенол-хлороформной экстракции. Это один из старейших методов выделения ДНК, настоящая «классика», которую возможно реализовать практически в любой лаборатории.
Фенол-хлороформная экстракция
В состав лизирующего буфера, как правило, входит:
— додецилсульфат натрия (SDS) – детергент, разрушающий клеточные мембраны;
— протеиназа K – для разрушения выходящих в раствор белков;
— собственно, сам буфер (например, STE) – для поддержания pH
Примечание! В качестве детергентов могут быть использованы и другие вещества. Например, для относительно мягкого лизирования с сохранением структуры белков часто используют Triton X-100, а во многих протоколах по экстрации ДНК из крови в качестве детергента используется тиоцианат гуанидина.
ОТСЮДА ВЫВОД: универсальных протоколов нет, старайтесь подобрать оптимальный под ваш образец ткани.
После инкубации и образования лизата в пробирку добавляют смесь фенола с хлороформом (1:1). Такая смесь позволяет отделить белки от ДНК и денатурировать их. К несчастью, РНКазы могут инактивироваться не до конца. Если это критично, то лучше использовать смесь фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1).
Из-за разницы в плотности воды и органических растворителей мы получаем эмульсию в пробирке – теперь осталось её только центрифугировать. В результате наша смесь подразделяется на несколько чётко различимых фаз —сверху располагается водная фаза с растворённой ДНК, далее идёт тонкий диск интерфазы с белыми нитями осаждённых белков, и последней – органическая фаза с липидами. Теперь мы можем аккуратно с помощью микродозатора отобрать верхнюю фазу с ДНК в отдельную пробирку, стараясь не захватывать белок.
Если у нас всё получилось, то мы молодцы, ибо это был самый тяжёлый этап в работе, требующий большой концентрации. Дело в том, что нити белка очень легко захватываются автодозатором при попытке отобрать водную фазу, загрязняя ДНК. Если это всё-таки произошло, то нам придётся еще раз осадить белки с помощью смеси фенол-хлороформ.
Читайте также: Во что объединяются проводящие ткани
Всё, что теперь осталось – осадить ДНК из водного раствора, несколько раз её промыть и растворить для хранения.
1-2,5 объёмов холодного 96% этанола или изопропанола. Процесс удобно контролировать «на глазок», так как выпадающая в осадок ДНК формирует в растворе белёсые «медузоиды». После центрифугирования ДНК осядет на дне пробирки, и мы можем слить супернатант. Для дополнительного обессоливания ДНК отмывают в нескольких сменах 70% этанола, после чего её можно высушить на воздухе. Для хранения ДНК растворяют в TE-буфере или деионизированной воде и замораживают на -20◦С.
ПЛЮСЫ этого метода: универсальность, получение ДНК в высокой концентрации, хорошо работает со «старым» материалом, относительная не дороговизна, возможность оптимизировать метод на различных этапах.
МИНУСЫ: токсичные реагенты, высокая трудоёмкость, возможно загрязнение ДНК, сложно автоматизировать.
Поиск идеального метода
С привлечением молекулярно-биологических методов к клинической диагностике наиболее остро встала проблема уменьшения затрат времени на проведение исследования, повышения количества одновременно обрабатываемых образцов, постепенной автоматизация процесса и снижения фактора «человеческих рук». Всё это касается и методов выделения ДНК.
Сегодня на рынке можно найти несколько возможных подходов по оптимизации этого процесса. Естественно, все такие коммерческие наборы (KITs) значительно дороже классической фенольной экстракции. К сожалению, для многих даже практикующих лаборантов-исследователей такие «КИТы» становятся своеобразными «чёрными ящиками» — что-то капнул, что-то получил, а что случилось – непонятно. Постараемся разобраться…
Выделение ДНК методом сорбции на носителе
В основе этих методов лежит способность молекул ДНК связываться с определёнными веществами-носителями. В качестве такого фильтра-носителя может выступать:
— силика SiO2 (silica matrices);
Присоединение молекулы ДНК к матрице происходит за счёт электростатического взаимодействия между отрицательно-заряженным остовом молекулы ДНК (вспоминаем про фосфатные группы) и положительным зарядом на ионах Na+.
Для удобства такие фильтры располагаются в микроколонках. После внесения лизата в колонку при pH 7,0 (например, TE-буфером).
ПЛЮСЫ: быстро, просто, а еще и автоматизировать можно
МИНУСЫ: возможность потери части ДНК при многочисленных отмывках и необратимой сорбции.
Выделение ДНК с помощью магнитных микрочастиц (magnetic beads)
К лизату добавляются специальные намагниченные шарики (на основе оксидов железа и никеля), несущие на своей поверхности лиганды, позволяющие связывать ДНК. В результате молекулы ДНК буквально облепляют магнитные шарики. Очевидно, что такую ДНК очень легко собрать – просто с помощью подведения магнита к стенке микропробирки. Для элюции ДНК с магнитных носителей используют низкосолевые буферы.
ПЛЮСЫ: очень быстро, до безобразия просто, позволяет сорбировать большое количество ДНК
МИНУСЫ: увы, но цена на такие наборы кусается
Выделение ДНК на бумажных фильтрах (FTA-карты, Whatman)
В данном случае используются специальные целлюлозные фильтры, УЖЕ пропитанные всеми необходимыми буферами, способными и лизировать образец, и связать ДНК, и денатурировать белки. Всё что требуется от нас – просто нанести каплю образца на фильтр и высушить его. При желании такой фильтр мы можем разрезать на небольшие фрагменты и поместить прямо в пробирку для последующей ПЦР.
ПЛЮСЫ: очень быстро и просто, длительное хранение образцов при комнатной температуре, просто автоматизировать.
МИНУСЫ: пригодно только для жидких образцов, невозможно точно оценить количество выделенной ДНК (например, методом qPCR), низкая стабильность выделяемой ДНК.
Выделение ДНК с помощью ионообменных смол (например, Chelex 100)
Данный метод принципиально отличается от всех остальных тем, что в его основе лежит не сорбция ДНК из раствора, а сорбция примесей. Смола за счёт отрицательных зарядов на своей поверхности связывает ионы металлов из активных центров многих ферментов, в том числе и нуклеаз. Исследуемый образец помещают в микропробирку с 5% ионообменной смолой, с которой его инкубируют в течение 30 минут при 56◦С. После этого раствор кипятят, в результате чего происходит лизис клеток в образце. После центрифугирования собирают супернатант с очещенной ДНК.
ПЛЮСЫ: достаточно быстро, относительно дёшево, можно использовать для всех типов образцов (кроме костей).
МИНУСЫ: низкая степень очистки ДНК, возможность загрязнения ДНК самой смолой.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом