Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3
4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Р.Я. Подчерняева, М.В. Мезенцева, И.А. Суетина, О.А. Лопатина. Г.Р. Михайлова,
А.Д. Петрачев, Л.А. Потапова, О.В. Бакланова, Е.Л. Фирсова, О.М. Гринкевич,
Т.Н. Притчина, М.Н. Щетвин, Л.И. Руссу
ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, Москва, cells@rambler.ru
В Лаборатории культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского создана Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных, которая входит в состав Российской коллекции клеточных культур. Для каждой клеточной линии разработан паспорт, согласно международным требованиям. Проводится постоянная работа по улучшению условий хранения и культивирования клеток в зависимости от различных сред, сывороток или их заменителей, а также постоянный мониторинг микоплазм, вируса бычьей диареи и других возбудителей инфекций. Проведен поиск клеточных линий, чувствительных к различным ДНКи РНК-содержащим вирусам, включая вирусы гриппа. На моделях клеточных культур изучалась эффективность различных антивирусных препаратов — амантадина, ремантадина, арбидола, тамифлю, ингаверина, циклоферона, ридостина, неовира, амиксина и 15 нейротропных пептидов, обладающих иммуномодулирующей и противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса, гриппа человека и птиц. На моделях культур клеток проводилось изучение закономерностей синтеза регуляторных цитокинов в зависимости от условий культивирования клеток. Совместно с контрольным Институтом им. Л.А. Тарасевича (Москва) была получена вакцинная линия клеток Vеrо(В), охарактеризованная по требованиям ВОЗ. Линия применяется не только для научных исследований, но и для получения первой в стране противогерпетической отечественной вакцины «Витогерпавак». Ключевые слова: клеточные культуры, сыворотки, бессывороточная среда, вирусы, цитокины, вакцина. В настоящее время клеточные культуры находят широкое применение в различных областях биологии, медицины, ветеринарии и биотехнологии. Использование клеточных культур позволяет исследовать биологические процессы, которые сложно, а подчас невозможно, изучить на уровне организма. Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии при производстве многих вакцин, тест-систем и биологически активных веществ. Культуры клеток применяют для диагностики заболеваний различной этиологии, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических, лечебных и косметических средств, а также пищевых добавок. Все это требует стандартизации работы с клеточными культурами в специально оборудованных лабораториях. Для успешного сохранения исходных или направленно измененных свойств клеточных линий, а также для получения воспроизводимых экспериментальных результатов необходимо зафиксировать данное состояние культивируемых клеток. Функцию поддержания исходных свойств клеток и проведения контроля за их состоянием осуществляют Коллекции клеточных культур, сохраняющие эталонные клеточные линии, которые содержатся в криоконсервированном состоянии.
Еще в 1989 г. в нашей стране были разработаны методические указания: «Аттестация перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (РД42-28-10-89), выполнению которых и по сей день придерживаются в работе с культурами клеток. В нашей Лаборатории культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского подготовлены методические рекомендации: «Работа с клеточными культурами (культивирование первичных и перевиваемых клеток)» (1) и «Технологический процесс криоконсервации перевиваемых клеточных линий» (2), которые были утверждены на Ученом совете института и на Лабораторном Совете Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. На базе нашей лаборатории имеется Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных. Фонды коллекции представлены в «Каталоге Всесоюзной коллекции клеточных культур» (3), в «Human and Animal cell lines Catalogue» (4) и в «Каталоге Российской коллекции клеточных культур (РККК)» (5). Для каждой клеточной линии разработан паспорт, согласно международным требованиям, где, в частности, подробно описаны условия культивирования. Одним из ингредиентов, наиболее нестабильных при культивировании клеток, является сыворотка. Ее свойства существенно зависят от источника получения. Учитывая нестандартность сывороток, по рекомендации ВОЗ мы использовали малосывороточные питательное среды из гидролизатов соевой и рисовой муки, разработанные в НПО «Вектор» под руководством Л.П. Сандахчиева.
Оптимизированный состав этих сред представляет собой определенные концентрации ферментативных гидролизатов, растворенных в сбалансированных растворах Эрла или Хенкса, в которые дополнительно добавлены витамины, микроэлементы и отдельные аминокислоты. Показано, что для пролиферации клеток МДСК (клетки почки собаки) при культивировании с соевой средой достаточно добавление только 2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), а для пролиферации клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) требуется добавление 5% FBS. Таким образом, использование соевой среды позволяет снизить количество сыворотки, необходимой для успешного культивирования этих клеток с 10% до 2—5%. Надо отметить, что морфология и кариология клеток МДСК и Vero не менялась при использовании соевой среды (6—8). Для проведения биотехнологических исследований на современном уровне желательно для культивирования клеток применять полностью бессывороточные среды. Список таких сред, как правило, широко представлен во многих каталогах, но, к сожалению, их цена слишком высока. Поэтому мы провели работу с применением отечественной бессывороточной среды «Гибрис-2» производства ООО «ПанЭко».
Адаптация клеток к этой среде проводилась поэтапно. Так, для получения адаптированной линии клеток МДСК к среде «Гибрис-2» было проведено 4 пассажа с 3% FBS, 3 пассажа с 2% FBS, 5 пассажей с 1% FBS и 6 пассажей без сыворотки. Показано, что индекс пролиферации (ИП), идентичный контрольным значениям, был отмечен только в присутствии 1—2% FBS, а культивирование без сыворотки не приводило к контрольным показателям. Возможно, требуется большее количество пассажей для полной адаптации клеток к бессывороточной среде (9,10). С целью оптимизации работы с нативными сыворотками было исследовано влияние сывороток северных оленей, суягных овец, свиней и морских котиков на пролиферативную активность 2-х клеточных линий — ЛЭЧ (клетки легких эмбриона человека) и Vero. Контролем служили эксперименты с использованием сыворотки FBS.
Было показано, что сыворотки из крови северных оленей можно успешно использовать для культивирования клеток Vero, которые наиболее часто применяются для биотехнологических целей. Однако вопрос стандартизации условий культивирования клеток в зависимости от наличия доброкачественных сывороток или их заменителей не утрачивает своего значения. Поэтому, были проведены исследования по получению и применению так называемых ростстимулирующих белков (РБ), выделенных из сывороток северных оленей, суягных овец и свиней с помощью водного раствора полиэтиленгликоля с M.м. 4000—8000 Д, который способствует также удалению ряда контаминирующих агентов. РБ представлены главным образом альбуминовой и α-глобулиновой фракциями, которые являются белковыми факторами роста, влияющими на пролиферацию клеток.
Изучена пролиферативная активность 7 клеточных линий после 5-ти последовательных пассажей в среде с РБ из сывороток свиней, суягных овец и оленей без добавления сыворотки FBS и с 2% FBS. Показано, что для получения показателей индекса пролиферации (ИП), равнозначных с контролем, все же необходимо добавление 2% сыворотки FBS. Показатели ИП разных клеточных линий различались незначительно. Лучшие показатели ИП наблюдались в экспериментах с РБ из сывороток оленей и свиней (11,12). При работе с культурами клеток не менее важным является применение ферментов для диспергирирования или отделения клеток от субстрата при их пересевах. Для этих целей, как известно, можно применять трипсин или химопсин.
Недостатком этих ферментов является то, что сырье для их получения не стандартизовано и не исключает наличия в них патогенных примесей. Поэтому, совместно с сотрудниками НПО «Вектор», мы провели изучение полученного ими препарата «Коллаза», который представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью, выделенных из экологически чистого гепатопанкреаса Камчатского краба с помощью хроматографической очистки и ультрафильтрации. При применении этого фермента по сравнению с трипсином количество жизнеспособных клеток было в 2—2,5 раза больше и требовалось более короткое время воздействия. При этом морфология культивируемых клеток 10 изученных линий оставалась без изменения. Таким образом, использование «Коллазы» при культивировании оказалось более эффективным, чем использование трипсина. Существенной проблемой при работе с клеточными культурами является микробная контаминация клеток, т.к. она влияет на метаболизм клеток, вызывает хромосомные аберрации и изменяет клеточные функции.
Частым контаминантом клеточных культур оказывается вирус бычьей диареи (ВД), относящийся к роду Pestivirus семейства Flaviviridae и являющийся возбудителем вирусной диареи — болезни слизистых крупного рогатого скота. Этот вирус может проникать в клетки из нативных сывороток крупного рогатого скота и даже FBS, добавленных в ростовую среду (13). Так, с помощью метода ПЦР было выявлено наличие ВД в коммерческих FBS, полученных из различных фирм (ПАНЭКО, ООО Биолот, Gibco, Biowest, HyClone, Amimed, Sigma). В сыворотках FBS фирмы ПАНЭКО ВД обнаруживается как до, так и после прогревания в водяной бане при 56°С в течение 30 и даже 60 минут (14). Мы проводили определение ВД с помощью метода ПЦР в клеточных линиях из нашей коллекции.
Иследовались диплоидные клетки легкого и фибробласты эмбриона человека, клетки онкогенных и лимфобластоидных линий человека, перевиваемые клетки обезьян, крупного рогатого скота, собаки, свиньи, крыс, мышей, хомячка, кролика, кошки, овцы, хорька и кур. Клетки хранились в жидком азоте в течение различного периода. Было показано, что диплоидные клетки человека и ряд перевиваемых клеток барана, свиньи, хомячка, обезьян и человека не были контаминированы ВД. Однако в 30% клеточных линий из 83-х изученных был выявлен ВД, причем чаще всего в более поздних закладках. Очевидно, при культивировании этих клеток использовались сыворотки, содержащие этот вирус (15). Одним из пунктов паспорта клеточной линии является чувствительность к репродукции вирусов. Изучение чувствительности разных клеточных линий к определенным вирусам крайне важно для приготовления противовирусных вакцин.
Вирусам свойственен определенный круг хозяев, узкий для одних видов и очень широкий для других. Генетический аппарат вирусов представлен как ДНК, так и РНК в одно- или двунитевой, линейной или циркулярной, моно- или фрагментарной формах. К РНК- содержащим вирусам позвоночных относятся 20 видов вирусов (арена, артери, астро, бирна, борна, бунья, геле, дельта, калици, корона, нода, ортомиксо, парамикса, рабдо, рео, ретро, тога, фило и флави вирусы), включая субвирусные агенты вероиды, сателлиты и прионы. К ДНК-содержащим вирусам позвоночных относятся 11 видов вирусов (адено, анелмо, асфар, гепадна, герпес, иридо, паппилома, парво, покс, полиома и цирко вирусы). Название этих видов вирусов связано либо с их морфологией, либо с местом их изоляции. Интерес к проблеме поиска клеточных линий, чувствительных к различным ДНК- и РНК-содержащим вирусам, позволил нам суммировать различные данные и представить их в виде таблиц 1—4 (16,17).