Следует иметь в виду, что при выращивании культур клеток необходимо исключить их контаминацию бактериями, грибами и вирусами. Для этого при работе с ними нужно соблюдать строжайшую стерильность, а от вирусной контаминации избавляются путем использования SPF доноров.
Культуры клеток из тех или иных тканей или органов получить несложно. Но эта технология требует скрупулезности, осторожности, определенных приемов и навыков. Клетки из тканей высвобождают путем размельчения и воздействием трипсина, папаина, коллагеназы, эластазы, муказы и т.д. Но наиболее пригоден для получения культур клеток очищенный трипсин. В размельченную ткань помещают очень слабо концентрированный (0,25 %) трипсин, который разрушает межклеточное вещество, что способствует разделению клеток. Применяя электромагнитную мешалку, центрифугу и многократно промывая клеточную суспензию, получают маточную основу живых клеток, которую помещают в соответствующую питательную среду. Затем выращивают культуру клеток в термостате при температуре 37°С и через 3-4 сут получают готовую культуру клеток. Наличие роста клеточной культуры определяют под микроскопом. Нормально растущая культура клеток под микроскопом будет представлять один слой клеток, вплотную прилегающих одна к другой, и имеющих типичную для данной культуры морфологию. При изменении температуры, рН среды рост клеток замедляется культура клеток может погибнуть.
Для получения культуры клеток применяются так называемые ростовые среды, содержащие белок сыворотки крови определенных животных, гидролизаты лактоальбумина и т.д.
Время генерации различных культур клеток составляет 15-50 ч. По достижении определенного, хорошего роста, дальнейшее их размножение прекращают. Такая культура клеток может использоваться для выращивания в ней вирусов (рис. 2).
| Ткань плода или взрослой особи |
| Нормальная ткань |
| Первичная культура |
| Первичная субкультура |
| Нормальная диплоидная |
| Трансформация |
| Постоянные (перевиваемые) линии |
Рис. 2. Получение клеточных линий при культивировании in vitro
соматических клеток (по Гриффитсу Дж. Б., 1989)
Приведем конкретный пример получения клеточной культуры из почек телят (ПТ), применяемой выращивания вакцинного авирулентного штамма ТК-А (ВИЭВ) вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Для получения культуры клеток ПТ используют почки от теленка в возрасте 1-1,5 месяца. С почек снимают капсулу, измельчают почечную ткань до кусочков величиной 3-5 мм, тщательно промывают раствором Хенкса с антибиотиками. Измельченную ткань переносят в стерильную колбу и заливают ее 0,25% раствором трипсина в соотношении 1:10 -1:15. Дезагрегацию ткани проводят дробно с применением магнитной мешалки при температуре 35-37 С до полного истощения ткани. Для этого проводят 7-8 циклов по 10-15 мин каждый. Выход клеток из одного грамма почечной ткани составляют 40-50 млн.
Для выращивания клеток ПТ используют ростовую среду из гидролизата лактоальбумина с добавлением 10% нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота. В данную среду вносят посевную дозу ПТ в концентрации 600-800 тыс. клеток/мл. Культивирование клеток ПТ осуществляется в матрасах при температуре 37 °С. Монослой клеток формируется на 5-е сутки. Смену ростовой среды проводят на 2 -3-й сутки. Контроль качества культуры осуществляют макро- и микроскопически.
После формирования монослоя культуру клеток отмывают раствором Хенкса дважды, удаляя тем самым сывороточный белок, препятствующий репродукции вируса после внесения его в культуру клеток.
В настоящее время все культуры клеток, используемые для выращивания и накопления вирусов можно разделить на следующие основные группы:
— первичная культура — такая культура клеток, для которой использованы клетки, органы или ткани, взятые непосредственно из организма;
Читайте также: Ткань ответ по маске
— субкультура — клетки «первичной культуры», подвергнутые субкультивированию;
— клеточная линия — культура клеток, полученная из субкультуры;
— диплоидная клеточная линия — линия клеток, 75 % которых имеют кариотип, свойственный нормальной клетке организма, из которого они выделены;
— перевиваемая (стабильная) клеточная линия — бессмертная культура диплоидных клеток, которая в результате трансформации приобрела способность к неограниченному количеству пассажей (не менее 70 раз с 3-дневным интервалом);
— гетероплоидная клеточная линия — линия клеток, которая содержит менее 75%) диплоидных клеток. Такие клетки не обладают признаками новообразований. В то же время они не имеют ограничений способности роста in vitro.
По частоте использования клеточных культур они подразделяются на первичные (периодические) и перевиваемые (постоянные). Первые используются, как правило, однократно, то есть в технологическом процессе они используются разово. Вторые являются непрерывными, постоянными клеточными линиями, которые в технологическом процессе используются многократно.
Все постоянные клеточные линии, в отличие от культур нормальных первичных клеток с ограниченным сроком жизни, являются трансформированными. Другими словами, они изменены по ряду признаков, главным из которых является «бессмертие» (Сергеев В.А., 1993). Другие категории трансформации (например, онкогенность, контактное торможение, приспособление к среде и т.д.) у различных линий проявляется неодинаково. Все они получены при спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие постоянные клеточные линии получены из опухоли животных.
Субкультивирование клеток, а затем и становление постоянной клеточной линии были успешными, когда первичную однослойную культуру получали путем посева механически измельченной суспензии трипсинизированных клеток.
Тканевые культуры: методы получения, классификация. Культивирование и индикация вирусов в тканевых культурах.
Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде (`матрасы’, флаконы, пробирки и др.). Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению. В зависимости от техники приготовления различают три вида культур клеток:
однослойные — клетки, способные прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя;
суспензионные — клетки, размножающиеся во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании;
органные — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются ограничено).
По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяются на:
первичные, способные размножаться только на первых генерациях, т.е. в нескольких пассажах после выделения из тканей;
перевиваемые, или стабильные, способные размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок посредством постоянного пассирования;
полуперевиваемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40 — 50 пассажей).
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчение ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующем суспендированием клеток в питательной среде.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготавливают из злокачественных или нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa , первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep — 3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.
Читайте также: Где создали шелковую ткань
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Для выращивания вирусов можно использовать культуры тканей любого типа. Доза заражения зависит от цели и назначения опыта. Тканевые культуры используют для выделения новых малоизученных вирусов, когда обычным методом (заражение животных, куриных эмбрионов) невозможно установить вирусную природу возбудителя. Выбор клеточных культур определяется их чувствительностью к отдельным группам вирусов.
Различают острую и хроническую инфекции. Острое течение инфекции характеризуется цитопатическим действием (деструктивными изменениями зараженных клеток, завершающихся их гибелью). Хроническая форма репродукции вируса не вызывает быструю гибель клеток, они долгое время остаются жизнеспособными и внешне могут не отличаться от зараженных.
Индикацию вирусов в культуре клеток проводят на основании следующих феноменов:
*Цитопатическое действие (ЦПД) — видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до их отторжения от стекла, которые возникают в результате внутриклеточной репродукции вирусов (рис. 5).
*Вирусные включения — скопление вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Включения различаются по величине, форме, численности. Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса, аденовирусами, гриппа, бешенства, оспы и др.
*Бляшки, или негативные колонии — ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток, которые вирусы способны образовывать в монослое клеток под агаровым покрытием Одна бляшка соответствует потомству одного вириона. Негативные колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме. Бляшкообразование используют для дифференциации, селекции вирусов, а также для определения их концентрации в исследуемом материале. Титр вируса, установленный этим методом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.
*`Цветная’ проба. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и цвета индикатора фенолового красного на желтый. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается, клетки гибнут, и среда сохраняет свой первоначальный (красный) цвет. Таким образом, красный цвет среды указывает на наличие вируса и прекращение жизнедеятельности клеток.
*Гемадсорбция — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты определенных видов животных и птиц. Гемадсорбция проявляется скоплением в виде гроздей эритроцитов, адсорбированных на инфицированных вирусом клетках.
*Интерференция — некоторые вирусы можно обнаружить в культуре ткани только по наличию интерференции. Испытуемый вирус вводится в культуру клеток первым, через несколько дней туда же вносят стандартную дозу вируса, обладающего выраженной цитопатической активностью или способностью вызывать гемадсорбцию. После определенного инкубирования проверяют наличие цитопатических изменений или гемадсорбции, подтверждающих размножение `выявляющего’ вируса. Отсутствие в культуре `выявляющего’ вируса говорит о наличии испытуемого вируса.
31.Классификация, строение и химический состав бактериофагов.
Бактериофаги [от бактерии, + греч. phagein, поедать] — группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Размножение и выход дочерних популяций вируса из бактерии сопровождается её гибелью и разрушением (лизисом). Бактериофаги широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще.
Читайте также: Устьице тип ткани выполняемые функции
В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклео-капсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. Бактериофаги устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Большинство из них без вреда переносит высокие температуры (50-70 °С), действие дезинфектаитов (за исключением кислот и формалина), прямой солнечный свет и УФ-облучение в низких дозах. Бактериофаги проявляют иммуногенные свойства, вызывая синтез специфических AT.
Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (рис. 5-10). Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании которых выделяют пять основных типов бактериофагов.
• К типу I бактериофагов относят ДНК-содержащие нитевидные фаги, лизирующие бактерии, содержащие F-плазмиды.
• Фаги типа II представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174 — однонитевой ДНК.
• Бактериофаги типа III имеют короткий хвост (например, Т-фаги 3 и 7).
• К типу IV относят фаги с несокращаюшимся хвостом и двухнитевой ДНК (например, Т-фаги 1 и 5).
• Фаги типа V имеют ДНК-геном, сокращающийся чехол хвоста, который заканчивается базаль-ной пластиной (например, Т-фаги 2 или 4).
Головка Т-фагов ( бактериофагов ) образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДИК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутренний белок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин).
Хвост Т-фагов ( бактериофагов ) может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает поль — стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120-140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са2+. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущен вниз, а у нечётных — загнуты вверх. У некоторых Т-фагов ( бактериофагов ) в дистальной части хвоста находит лизоцим (эндолизин).
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.