Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.
Сущность
Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.
В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).
История развития
Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.
В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.
К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.
Типы исследуемого материала
Различают 2 основных вида культур тканей растений:
- Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
- Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.
По способу выращивания выделяют следующие методы:
- на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
- с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
- применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
- выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.
Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.
Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.
Необходимые условия
Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:
- Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
- Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
- Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.
В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).
Читайте также: Теплопроводность кожи или ткань
Достоинства и недостатки
Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:
- хорошая воспроизводимость полученных результатов;
- регулирование межклеточных взаимодействий;
- небольшой расход реагентов;
- генетическая однородность клеточных линий;
- возможность механизации процесса выращивания;
- контроль над условиями содержания клеток;
- низкотемпературное хранение живых культур.
К недостатком данной биотехнологии относят:
- необходимость соблюдения строгих условий асептики;
- нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
- дороговизна химических реагентов;
- неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.
Применение
Метод культуры тканей используется для проведения исследований:
- процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
- межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
- взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
- результатов генетических манипуляций с клетками.
Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:
- получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
- направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
- клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
- выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
- криоконсервация генофонда;
- реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).
КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ — ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СЫРЬЯ
В самом общем смысле культура клеток и тканей (далее — культура тканей) — это искусственное in vitro индуцирование делений клеток или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.
Основоположниками культуры растительных тканей как новой области биологической науки считаются Ф. Уайт и Р. Готре (начало XX в.). В конце 30-х гг. XX в. был разработан метод выращивания растительных клеток в суспензионной культуре и получения биомассы от единичных клеток, что позволило выделять однородный в генетическом и физиологическом отношении материал.
В странах бывшего СССР освоение метода культуры тканей начато с конца 50-х гг. XX в. и связано с именем Р.Г. Бутенко. В 1967 г. по инициативе И.В. Грушвицкого в Ленхимфарминституте (ныне Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия) была создана первая в стране лаборатория культуры тканей лекарственных растений. Позже подобные лаборатории были созданы во Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) (Москва) и Томском медицинском институте (ныне Сибирский государственный медицинский университет).
Первоначально разрабатываемый в чисто теоретическом плане метод культуры тканей, начиная с середины 60-х годов XX в., входит в арсенал особого направления научно-производственной деятельности, известного под названием биотехнология. Технологии, основанные на методе культуры тканей, уже помогают создавать новые формы и сорта сельскохозяйственных растений и получать промышленным путём продукты растительного происхождения.
Все объекты, культивируемые in vitro, выращиваются стерильными. Стерилизуются исходные кусочки ткани растений (экспланты), питательная среда; антисептически в специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции по выращиванию объектов. Сосуды, в которых культивируются ткани и клетки, закрываются так, чтобы предотвратить инфицирование в течение продолжительного времени.
Читайте также: Итальянские ткани в ставрополе
В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления: получение недифференцированной каллусной массы, создание исходного генетического разнообразия форм растений, а также клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений.
В природе каллусообразование — естественная реакция на повреждение растений. В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т.е. фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу — каллус.
В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста. В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая на свежую питательную среду.
Каллусы легко образуются на эксплантах из различных органов и частей растений: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы, тканей клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т.д. Культивирование каллусных клеток проводят главным образом двумя способами: на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках (силикагель, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.) и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и даёт начало так называемой суспензионной культуре.
В разработке нетрадиционных клеточных технологий важное место занимают питательные среды. Они должны обеспечить потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для биосинтеза целевого продукта. В состав сред входят смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов), фитогормоны (регуляторы процессов клеточного деления и дифференциации), источники углерода в виде сахарозы. Имеют значение температура, освещение, содержание газов и другие условия.
Одна из важных особенностей культуры тканей — сохранение в ряде случаев способности к синтезу продуктов вторичного метаболизма, свойственных интактным растениям данного вида, — алкалоидов, гликозидов, компонентов эфирных масел, стероидов и др.
В культивируемых каллусных клетках, особенно при длительном выращивании in vitro, возникают, сохраняются в клеточных поколениях, а часто и селектируются, т.е. отбираются и начинают преобладать, многочисленные геномные вариации. Эта изменчивость представляет собой основу для отбора клеточных линий и штаммов с высокой биосинтетической способностью (суперпродуцентов). Хотя использование сырья, получаемого при культуре тканей и клеток in vitro, выгодно пока только для тех продуктов, рыночная стоимость которых достаточно высока на международном рынке, тем не менее, биотехнологические программы уже созданы в СНГ и многих странах мира.
Переход от научных разработок к промышленному получению продуктов с использованием клеточных культур только начинается. Однако этим методом уже получают некоторые высокоценные вещества и продукты. В Японии из культивируемых тканей воробейника краснокорневого получают шиконин с широким спектром антисептического действия и убихинон-10 из клеток табака, в Германии — кислоту розмариновую из колеуса. В нашей стране биохимические заводы выпускают клеточную биомассу женьшеня, а также получены высокоаймалиновые штаммы раувольфии змеиной.
Каллусные клетки в культуре тканей in vitro подвержены значительной генетической изменчивости. Изменчивость геномов может приводить к генетическим изменениям у растений-регенерантов, полученных из культуры каллусных клеток, клеточных суспензий или изолированных протопластов. Такие растения получили название сомаклональных вариантов. Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто выгодно отличаются от него устойчивостью к болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько изменённой биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью.
Читайте также: Как клеить тканями стену
Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез (обработка мутагенными веществами), а также селективные условия культивирования клеток. Спонтанно возникшие или индуцированные мутанты в популяции отбираются на устойчивость к созданным жёстким условиям: высоким концентрациям солей, экстремальным температурам, гербицидам, токсинам и др. В результате проведения многих экспериментов удаётся отобрать действительно устойчивые линии и получить растения-регенеранты из стабильной клеточной линии.
В СНГ методом клеточной селекции получены клоны: сорта картофеля, устойчивые к высоким концентрациям хлорида натрия, низким температурам, раку картофеля, а также патогену и токсину, вызывающим кольцевую гниль клубней; рис, устойчивый к низким температурам и засолению, и др.
Клеточная селекция — одна из наиболее полезных клеточных технологий для создания сортов не только важнейших сельскохозяйственных, но и лекарственных растений. Работы А.Г. Воллосовича в 70-80-х гг. XX в. с культурой тканей раувольфии змеиной привели к созданию высокопродуктивных аймалинсодержащих штаммов.
В настоящее время интенсивно развиваются работы по созданию высокопродуктивных штаммов и растений-регенерантов методами гибридизации соматических (неполовых) клеток путём слияния протопластов и генной инженерии. Методы соматической гибридизации и генной инженерии пока не получили промышленного развития. Однако учёные считают, что за ними будущее, и генная инженерия станет естественным приёмом при создании нужных человеку форм полезных растений.
Велико значение культуры тканей высших растений для быстрого клонального микроразмножения растений. Клональным микроразмножением называют неполовое размножение растений in vitro, строго идентичных исходному. Этот процесс «миниатюрен» в сравнении с традиционной техникой вегетативного размножения черенками, отводками, усами, прививками, но идёт очень быстро и с высоким выходом посадочного материала. Например, от одной генициали можно получить 10 5 -10 6 растений в год.
В зависимости от условий клетки в культуре in vitro могут делиться анархически, образуя неорганизованную массу, либо менять программу своего поведения и делиться организованно с образованием зачатков корней, стеблей, зародышей, из которых затем можно регенерировать растения.
Легче всего вызвать морфогенез (образование органов и тканей) и регенерацию растения в целом, используя зародыши, почки, а также стеблевые меристемы. Но для получения растений, даже из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития, или апикальных меристем стебля очень маленьких размеров нужны дополнительные условия, например, очень богатые питательные среды. Обычно в каждом случае разрабатываются особые условия культивирования и соответствующие питательные среды.
Стеблевая меристема (особенно самая её верхушка), как правило, свободна от вирусной инфекции, микоплазм и возбудителей других инфекций. Поэтому клонирование клеток меристематических верхушек, а затем быстрое клональное размножение здоровых растений — основа технологии получения безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лекарственных растений.
Велико значение технологии клонального микроразмножения в селекции растений. Можно быстро размножить уникальный генотип или новый сорт, что ускоряет его практическое использование. В настоящее время найдены условия размножения более 500 экономически важных или исчезающих видов дикорастущих растений. Многие из них размножаются уже в производственных условиях. Что касается лекарственных растений, технологии клонального микроразмножения разработаны в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН для мандрагоры туркменской, кирказона маньчжурского, женьшеня, в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии — для ряда видов раувольфии, в ВИЛАРе — для стефании гладкой.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом