Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют осуществлять селекцию.
Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани.
Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов: 1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани; 2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.
На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани. Этого можно достичь путем обработки ткани пектиназами, что ведет к мацерации ее клеток. Однако не всегда после такой обработки клетки сохраняют способность к последующим делениям и образованию ткани. Лучше получать отдельные клетки из суспензионных культур или рыхлого каллуса. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.
Далее клетки изолируют либо при помощи микроманипуляторов, либо путем ряда последовательных разведений. При первых же попытках культивирования отдельных клеток возникла важная научная проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния других клеток популяции или тканей? Отдельные клетки вели себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды.
При ее решении возникла гипотеза о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество, стимулирующее деление отдельных клеток. Определено, что этот фактор имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен (М.К. Павлова, Р.Г. Бутенко, 1965), видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны, синергичен с брассиностероидами. Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток.
Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки» (рис. 12).
Рис. 12. Схема использования каллуса в качестве «ткани — няньки»
Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра размером 8 * 8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. Каллус должен находится в фазе активного роста. Можно также в качестве «няньки» использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В этом случае клетки растут и делятся. По мере старения каллуса – няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду.
Проводились также эксперименты по высаживанию клетки непосредственно на агаризованную среду, но обязательно рядом с фильтром, который в течение нескольких дней контактировал с молодой, интенсивно растущей каллусной тканью. Поскольку эти работы показали, что постоянный контакт клетки через фильтр с каллусной массой не является обязательным для деления клетки, то было предложено использовать старую культуральную среду для стимуляции одиночной клетки к делению.
Можно также использовать метод «кормящего слоя». Для этого берут суспензию клеток того же вида, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. В 1959 году Бергман предложил фильтровать суспензионную культуру (в его экспериментах это были табак и фасоль) стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3 * 0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с агаризованной питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла смотреть за их поведением под микроскопом.
Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл).
Все эти способы культивирования позволяют клетке «ощущать» фактор кондиционирования. Он либо вырабатывается в достаточном количестве клетками «кормящего слоя», «ткани – няньки», либо содержится в суспензии, где ранее культивировались клетки, либо не теряется в большом объеме среды. Таким образом, фактор, вызывающий деление клеток, вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, чтобы он не рассеивался в больших объемах питательной среды, или же уменьшая объем среды, в котором будет выращиваться клетка, можно заставить ее делиться.
Селекция методом культуры клеточных тканей и клеток
Введение культуры клеточных тканей и клеток (метод in vitro) может способствовать созданию лучших сортов, более быстрому использованию ценного материала и уникальных форм. В стерильную культуру тканей и клеток в принципе возможен перевод всех частей растений, однако для исследований в области селекции имеет значение культура только таких органов, в которых можно индуцировать органогенез. К ним можно отнести верхушки побегов (апикальная меристема и дифференцированные ткани побега); цветковые почки, завязи, семяпочки; пыльники, пыльца; зародыш; клетки; ткань каллуса.
Читайте также: Мятая ткань в карандаше
Применение метода охватывает следующие этапы работы: выбор подходящего для решения поставленной задачи сорта (генотипа) и нужной части растения для закладки культуры; закладка стерильной культуры; создание условий (питательная смесь, температура, освещение и др.) для стимуляции желательного процесса развития; регенерация жизнеспособных растений; перевод отобранных для селекции растений в грунтовую культуру для включенияих в дальнейший селекционный процесс.
Задачи, решаемые этим методом в селекции, можно сгруппировать в три взаимно связанные группы: 1) расширение генетической базы селекции растений путем получения нового исходного материала; 2) сохранение и размножение ценных элитных растений и линий; 3) получение и сохранение безвирусного материала растений. Ниже перечислены некоторые конкретные методы, которые можно использовать для решения этих задач.
Расширение генетической базы для селекции растений. Обычные методы селекции, основанные на внутривидовой гибридизации и отборе, как правило, ведут к обеднению генетической изменчивости и сужению генетической базы, что влечет за собой потерю устойчивости создаваемых генотипов и их популяций. Эффективность селекции в будущем можно обеспечить только путем постоянного расширения ее генетической базы, что можно осуществить методами культуры тканей и клеток. Для этого используют методы соматической межвидовой гибридизации, оплодотворения и эмбрио-культуры, культуры пыльников, пыльцы и отдельных клеток in vitro и сомаклональной селекции.
Сохранение и размножение in vitro ценных элитных растений и линий применяется с целью получения генетически идентичных клонов. При этом обеспечивается:
• сохранение и размножение отдельных генотипов как исходных форм для решения специфических селекционных задач;
• быстрое эффективное размножение новых ценных сортов;
• сохранение и эффективное размножение линий для производства гибридных семян растений;
• экономичное размножение высокопродуктивных генотипов лесных пород, декоративных древесных растений и подвоев плодовых культур;
• размножение в стерильных условиях при получении безвирусного материала;
• сохранение сортимента вегетативно размножающихся культур и важнейших перекрестноопыляющихся растений.
Для осуществления этих задач используются методы клонирования на основе меристем верхушек побегов в стерильных условиях, а также регенерации жизнеспособных растений из других органов (стеблей, кусочков листа, органов цветка, луковиц и др.).
Получение и сохранение безвирусного материала. Эти методы получили распространение в практике сельского хозяйства для освобождения от вирусов вегетативно размножаемых растений. Установлено, что концентрация вирусов в растении снижается по мере приближения к конусу нарастания. Сам конус нарастания часто бывает свободным от вирусной инфекции. Это и было использовано для оздоровления материала путем изолирования меристемы в стерильных условиях и доведения ее до дифференциации in vitro. Изоляция меристемы размером 0,05-0,1 мм очень сложна. И успех дифференциации растений из нее невелик. Поэтому вместе с ней изолируют первые листовые примордии и тогда говорят о верхушке побега, которая имеет размер 0,1-1 мм. Благодаря этому хотя и ограничивается надежность получения безвирусного материала, но зато повышается степень его дифференциации. Кроме того метод становится удобным для практического использования. Культивирование производят на питательных средах Мурасиге и Скуга (см. табл. 10.1), Байса, Уайта и Хеллера.
Кратко рассмотренные в настоящем разделе методы широко распространены в мире и продолжают совершенствоваться. Так,понекоторым данным (Г.П. Бутова, 1995 и др.), к началу 90-х годов в 15 странах Европейского сообщества работало более 250 лабораторий культуры in vitro, из которых примерно половина в коммерческих целях. Из 550 возделываемых in vitro видов значительное количество составляли древесные и кустарниковые. При этом розой занимались в 45 лабораториях, рододендроном — в 25, березой — в 19, дубом — в 18, тополем — в 12, сосной и елью — в 15.
В США насчитывается 270 промышленных лабораторий, в том числе и по древесным породам. В середине 80-х продукция растений, размноженная методом культуры тканей, составила: 50 млн. штук в США, 53 млн. штук в Голландии, 10 млн. штук в ФРГ, около 28 млн. штук в Италии.
В бывшем СССР и в России получением селекционного материала этими методами успешно занимались ряд научных лабораторий Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Мичуринска и др. Однако в последние годы масштабы исследований сократились, хотя перспективность их остается несомненной.
В целом, культура тканей предоставляет новые возможности для повышения эффективности селекции растений. Кроме того, с ее помощью можно создавать новые ценныесорта.
Методы селекции лесных древесных пород, описанные в настоящей главе, начали развиваться относительно недавно. Поэтому они и названы в отличие от отбора и гибридизации, нетрадиционными. Стартовые исследования для части из них были начаты в первой половине XX века, но основные успехи достигнуты во второй половине этого века. В последние годы получила развитие идея сочетания традиционных и нетрадиционных методов для более успешного выведения хозяйственно ценных форм.
Однако, несмотря на прогресс селекции, достигаемый этими методами, широкому их практическому использованию препятствует ряд проблем. Они заключаются в том, что эти методы довольно дорогие, требуют специально оборудованных лабораторий, приборов и расходных материалов. Кроме того, как и для новых гибридов и отдельно отобранных лучших деревьев, существуют трудности массового размножения ценных форм трудно черенкующихся видов. С другой стороны, использование метода культурыклеток и клеточных тканей позволит преодолеть и этот барьер. Например, успешные опыты по клеточной репродукции дуба проведены во Франции. Поэтому необходимы более активные усилия по разработке методов вегетативного и клонального микроразмножения трудно черенкующихся форм лесных древесных пород.
Читайте также: Гост ткани льняные общие технические условия
Одним из способов преодаления проблемы является также создание биклоновых семенных плантаций из диплоидных и тетраплоидных растений с целью получения хозяйственно ценных триплоидных форм. В будущем возможна разработка и других эффективных методов сохранания и размножения ценных генотипов лесных древесных пород, выведенных нетрадиционными методами селекции.
Вопросы для самопроверки
1. Охарактеризуйте виды мутаций, используемые в селекции.
2. Что такое полиплоидия и её возможности в селекции лесных древесных пород?
3. Дайте краткую характеристику метода культуры тканей и его использования в селекции лесных древесных пород.
4. Покажите возможности и направления экспериментального мутагенеза.
5. Опишите физические методы получения мутантов, ионизирующие и неионизирующие излучения.
6. Приведите результаты, полученные у лесных древесных пород при использовании физических методов мутагенеза.
7. Охарактеризуйте химические методы получения мутантов, приведите классификацию мутагенов и результаты их применения у лесных древесных пород.
8. Опишите экспериментальную полиплоидию лесных древесных пород. Приведите характеристики митотического, мейотического и зиготического методов получения полиплоидов.
9. Что такое спонтанные и индуцированные полиплоиды лесных древесных пород? Приведите примеры.
10. Охарактеризуйте селекцию методом культуры клеток и клеточных тканей in vitro:
11. Приведите некоторые результаты использования методов культуры тканей у лесных древесных пород.
12. Укажите основные проблемы практического использования нетрадиционных методов селекции и пути их преодоления.
Дата добавления: 2017-08-01 ; просмотров: 1960 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Клеточная инженерия
Клеточная инженерия
Клеточная инженерия — КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, конструирование специальными методами клеток нового типа. Клеточная инженерия включает реконструкцию жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, объединение двух целых клеток, принадлежащих различным видам
Клеточная инженерия связана с культивированием отдельных клеток или тканей на специальных искусственных средах|средах. Доказано, что если взять кусочки ткани и отдельные клетки из разных органов|органов, допустим|допустим, растений, хотя это возможно и у животных, и пересадить их на специальные среды|среды, содержащие минеральные соли|соли и другие вещества, то они способны расти. Это значит, что в таких изолированных от организма тканях и клетках продолжаются клеточные деления.
Новейшим методом клеточной селекции у растений, уже давшим огромный эффект, является метод|метод гаплоидов. Гаплоидные клетки имеют половинный набор хромосом. Пыльцевые зерна|зёрна (пыльца) имеют гаплоидный набор хромосом. Сейчас разработан метод|метод проращивания пыльцевых зёрен на искусственных средах|средах в пробирках и получения из них полноценных гаплоидных растений. Какое это имеет отношение к селекции? У полученных гибридов берут пыльцу, на питательных средах|средах в пробирках регенерируют из неё гаплоидные растения, а затем удваивают у них число хромосом и сразу получают полностью гомозиготные диплоидные растения. Так как мы берём пыльцу из гибридных растений и получаем через гаплоидные растения сразу гомозиготные диплоидные, то остаётся только оценить их и затем размножить лучшие.
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах|средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.
Начало|Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг., когда возник метод|метод гибридизации соматических клеток. К этому времени были усовершенствованы способы культивирования животных клеток и появились способы выращивания в культуре клеток и тканей растений. Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Удалось получить гибриды между клетками животных, далёких по систематическому положению, напр. мыши и курицы. Соматиче-ские гибриды нашли широкое применение как в научных исследованиях, так и в биотехнологии. С помощью гибридных клеток, полученных от клеток человека и мыши и человека и китайского хомячка, была проделана важная для медицины работа по картированию генов в хромосомах человека. Гибриды между опухолевыми клетками и нормальными клетками иммунной системы (лимфоцитами) – т. н. гибридомы – обладают свойствами обеих родительских клеточных линий. Подобно раковым клеткам, они способны неограниченно долго делиться на искусственных питательных средах|средах (т. е. они «бессмертны») и, подобно лимфоцитам, могут вырабатывать моноклональные (однородные) антитела|антитела определённой специфичности. Такие антитела|антитела применяют в лечебных и диагностических целях, в качестве чувствительных реагентов на различные органические вещества и т. п.
При гибридизации соматических клеток растений их предварительно освобождают от плотной клеточной оболочки, а затем проводят слияние изолированных протопластов. В этом случае, как и при гибридизации клеток животных, также удаётся преодолевать барьеры нескрещиваемости, которые существуют при обычной (половой|половой) гибридизации растений разных видов и родов|родов. Из гибридной растительной клетки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллюс, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями|стеблями и т. д. Такое гибридное растение можно высадить в землю и выращивать и размножать обычными способами. Эти методы, в отличие от традиционных, позволяют сравнительно легко и быстро получать достаточное количество генетически разнообразного исходного материала для селекции. Их применение привело, напр., к увеличению урожайности ряда культур – картофеля, цитрусовых и др.
Читайте также: Увеличение ткани под языком
Другое направление клеточной инженерии – манипуляции с безъядерными клетками, свободными ядрами и другими фрагментами, сводящиеся к комбинированию разнородных частей клетки. Эти эксперименты, а также микроинъекции в клетку хромосом, красителей и т. п. проводят для выяснения взаимных влияний ядра|ядра и цитоплазмы, факторов, регулирующих активность генов, и т. п.
Путём соединения клеток разных зародышей на ранних стадиях их развития выращивают мозаичных животных, или химер, состоящих из двух различающихся генотипами видов клеток. С помощью таких экспериментов изучают процессы дифференцировки клеток и тканей в ходе развития организма.
Ведущиеся уже не одно десятилетие опыты по пересадке ядер соматических клеток в лишённые ядра|ядра (энуклеированные) яйцеклетки животных с последующим выращиванием зародыша во взрослый организм с кон. 20 в. получили широкую известность как клонирование животных.
Преимущество клеточной инженерии в том, что она позволяет экспериментировать с клетками, а не с целыми организмами. Последнее гораздо сложнее, а иногда и невозможно, особенно в случае млекопитающих животных и человека или при получении отдалённых гибридов. Методы клеточной инженерии в медицине, сельском хозяйстве или биотехнологии часто применяют в сочетании с генной инженерией.
Видео по теме : Клеточная инженерия
Каждый живой организм состоит из клеток: начиная от бактерии, заканчивая высшими млекопитающими. Высшие организмы состоят из органов|органов, органы|органы состоят из тканей, ткани состоят из клеток. Всё|Все свойства любого организма определяются его геномом, который находится в клетке (в любой|любой из клеток данного организма).
По некоторым данным, геном|геном обыкновенной мухи и человека совпадают на три четверти. Ничего удивительного в этом нет. Основа генов — дезоксирибонуклеиновая кислота — ДНК — несёт всю информацию о построении всех белков и биохимии данного организма, а на долю «внешнего вида», размеров и веса|веса экземпляра биологического вида, по-видимому, отводится не так уж много. Короче говоря, Дарвин абсолютно прав, и эволюция на определённом узловом этапе связывает и муху и человека. И религии это нисколько не противоречит, поскольку она утверждает только факт создания жизни Богом, но никак не регламентирует саму технологию.
Генная и клеточная инженерия (это одно понятие) занимается вопросами связи между устройством ДНК и наследственными свойствами организмов. Конечно, она вооружена такими методами, о которых раньше, например, во времена Менделя, и мечтать не смели|смели.
Метод|Метод клеточной инженерии заключается на современном этапе в том, что специалисты получают фрагменты ДНК различных организмов и встраивают их в ДНК организма, выбранного как объект исследования. Этот метод|метод на языке учёных, обожающих специальные термины, называется экспрессией рекомбинантных ДНК. В качестве инструмента берутся рестриктазы — особые бактериальные ферменты, способные расщеплять ДНК. Их и называют образно — биологическими ножами.
Получив нужный ген (трансген), собранный из упомянутых фрагментов, встраивают его в молекулу ДНК, называемую вектором, и переносят её в клетку, где она реплицируется (размножается) самостоятельно или после объединения с «родной» хромосомой. Здесь возникают большие|большие сложности с аппаратурой, так как материал нужно ввести в микроскопическую клетку принудительно, но не нарушая её целостности. Для этого существует множество весьма изощрённых методов, поскольку естественными путями сделать этого нельзя. Разумеется, здесь нет никакой мистики, просто эволюция ничего такого не предусмотрела, напротив, поставила кучу препятствий в рамках естественного отбора.
Цель, которую несёт в себе клеточная инженерия: получение лекарств, выведение качественных сортов культурных растений, создание новых пород животных, и как высшая точка — избавление нашей цивилизации от всех болезней. Те, кто спорит (не хочется называть их мракобесами) должны иметь в виду, что один только синтетический инсулин спас и спасает миллионы диабетиков и продлевает им жизнь на десятки лет!
Опасения по поводу генной инженерии берут начало|начало с момента её рождения в 1972-ом году, когда группа П. Берга (США) синтезировала первую рекомбинантную ДНК из онкогенного вируса обезьян SV40 и E.coli. Последнее — это кишечная палочка, без которой человек не может жить. И в неё встроен вирус, вызывающий рак. Учёные в прямом смысле испугались, и даже не стали продолжать работы в тот момент. Наступил долгий период постановки исследований под строжайший контроль государства, сравнимый с контролем над работами по ядерному оружию.
К счастью, сложность и стоимость биологических генных работ сопоставима по сложности и стоимости с атомными исследованиями, и поэтому не по карману потенциальным террористам.
В действительности же клеточная инженерия это — палка о двух концах — она может дать человеку столько лет жизни, сколько он сам захочет, но может и посеять страшные несчастья для всего живого. Не спорьте, обратное не доказано, а «цена вопроса» известна. Всё|Все зависит от того, в чьих чистых или грязных руках находится клеточная инженерия. И по объективным причинам её нельзя ни запретить, ни подтолкнуть вперёд. Развитие науки подчиняется своим внутренним законам.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом