Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях путем заражения животных, культур клеток и тканей. Культивирование вирусов производят в диагностических целях (выделение от больных и носителей), при экспериментальной работе (изучение вирусов), для производства вирусных вакцин и диагностикумов.
Гальтье (V. Galtier) впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Левенштейн (A. Lowenstein, 1919) первый опубликовал данные об успешной передаче вируса герпеса от человека кролику. Грютер (W. Gruter, 1920) доказал возможность культивирования вируса герпеса на кроликах. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем (F. Parker, В. N. Nye) в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф (А. М. Woodruff) и Э. Гудпасчер показали возможность К. в. на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).
Вирусы репродуцируются только в живых клетках, поэтому для их накопления заражают вирусами животных или культуры клеток и тканей. При этом происходит адаптация вируса, полученного из организма больного или носителя, к новым условиям. Чем меньше отличается искусственная система от естественной, тем легче осуществляется адаптация вируса.
Для оптимальной репродукции вируса необходимо использовать наиболее чувствительную систему и проводить заражение сильно разведенным свежим материалом, поскольку инактивированные вирусные частицы могут тормозить размножение инфекционных вирионов. Система, в к-рой вирус проходит полный цикл репродукции, носит название пермиссивной (разрешающей). В непермиссивной (неразрешающей) системе происходит неполный цикл репродукции вируса либо он вообще не репродуцируется. Пермиссивная для данного вируса система может стать для него непермиссивной при изменении условий культивирования, напр, при изменении температуры.
На животных культивируют те вирусы, которые вызывают у них четкую клиническую или патологоанатомическую картину (напр., развитие у мышей параличей при заражении вирусом бешенства или пневмонии при гриппозной инфекции). Многие вирусы лучше растут в мало-дифференцированных тканях эмбрионов птиц и новорожденных млекопитающих, чем в организме взрослых особей.
Для Культивирования вирусов используют мышей, крыс, морских свинок, кроликов, сирийских хомячков, африканских хорьков, обезьян, кур и др. На взрослых мышах культивируют вирусы гриппа, бешенства, многие тогавирусы; мыши-сосунки незаменимы при выращивании ряда вирусов Коксаки и тогавирусов ряда ареновирусов — возбудителей вирусных геморрагических лихорадок.
Сосунков белых крыс и сирийских хомячков часто используют для культивирования онкогенных вирусов. Морские свинки служат для выращивания вирусов ящура, марбургской болезни и др. Из обезьян наиболее часто используют зеленых африканских мартышек и разные виды макаки. Так, изучение вирусов полиомиелита и желтой лихорадки стало возможным после их адаптации к организму макак. Культивирование возбудителей некоторых медленных инфекций (куру, болезни Крейтцфельдта—Якоба), а также вирусов гепатитов А и В впервые удалось при заражении шимпанзе. Чувствительными к вирусу гепатита А также оказались южноамериканские обезьяны мармозеты.
Для получения стандартных результатов животные, используемые для работы с вирусами, должны быть генетически однородными. Этой цели служит инбредное скрещивание лаб. животных — братьев и сестер или родителей и детей, чем достигается возрастающая степень гомозиготности.
Для успешного К. в., помимо вида и возраста животных, имеет значение путь введения материала, что обусловлено тропностью вируса. Поэтому в большинстве случаев для размножения вируса в организме животного необходима его инокуляция в чувствительную ткань. Лишь некоторые вирусы патогенны для животных при любых способах инокуляции (напр., вирус венесуэльского энцефалита лошадей для мышей).
Большинство нейротропных вирусов культивируют путем введения их в полушария головного мозга животных. Этим путем заражают мышей различными тогавирусами, буньявирусами и другими арбовирусами. Вирус бешенства вводят таким же образом мышам, кроликам, овцам и собакам, вирус лимфоцитарного хориоменингита — мышам и морским свинкам. При культивировании вируса полиомиелита на обезьянках его инокулируют в спинной мозг или таламус головного мозга. Часто при культивировании нейротропных вирусов их вводят животным в брюшную полость, однако этот путь инокуляции уступает по чувствительности внутримозговому. Респираторные вирусы культивируют обычно путем интраназального заражения — их закапывают в нос наркотизированным животным или вводят в виде аэрозоля в специальной камере.
Аденовирусы инокулируют сирийским хомячкам подкожно или в слизистую оболочку защечных мешков, вирус герпеса обезьян — кроликам внутрикожно, а оспенные вирусы — на скарифицированную кожу (кроликам, телятам, курам). Вирусы оспы и герпеса можно культивировать на скарифицированной роговице кролика. Введение вирусов в мышцу, внутривенно, через рот и per rectum применяют редко. Внутривенное заражение морских свинок, хомячков и хорьков технически сложно, вместо этого материал чаще вводят в полость сердца.
Культивирование вирусов на животных очень затрудняется наличием в их организме различных бактерий, микоплазм и вирусов, которые могут загрязнить культивируемый вирус. Иногда вирус, находящийся в организме животного, создает иммунитет к культивируемому вирусу, напр, возбудитель эктромелии у мышей к вирусу вакцины.
Читайте также: Мебельная ткань шенилл в полоску
Для уменьшения риска загрязнения культивируемых вирусов посторонними возбудителями все чаще используют животных, выращенных в условиях изоляции. С этой целью получают животных, свободных от специфических для данного вида патогенных агентов,— SPF (specific pathogen free). У их матерей не должно быть инфекций, передающихся через плаценту. Детенышей извлекают при помощи кесарева сечения, вводят им в кишечник апатогенные бактерии, напр, молочнокислые, после чего они вскармливаются SPF самками. В дальнейшем эти животные размножаются обычным путем. Содержат их в закрытых помещениях, куда подается стерильный воздух, пища, вода и пр.
Животных, свободных от всяких возбудителей, содержат в специальных боксах в условиях еще более строгой изоляции (см. Стерильные животные).
Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Для получения оптимальных результатов имеет значение вид и возраст эмбрионов, путь заражения, введенная доза и температура инкубации. Чаще всего используют эмбрионы кур. Они наиболее чувствительны до 13-го дня инкубации. Инокулируют вирусы обычно на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную и амниотическую полость; в мозг эмбрионов и внутривенно (в сосуды оболочек) вирусы вводят редко. В желточном мешке культивируют многие тогавирусы; вирусы гриппа и инфекционного паротита хорошо культивируются в амниотической полости 10 —11-дневных эмбрионов, при этом вирус гриппа размножается не только в клетках амниона, но также в трахее и легких эмбриона. Вирусы оспенной группы и др. культивируют на хорион-аллантоисной оболочке, заражая 10—13-дневные эмбрионы через естественный воздушный мешок или через отверстие на боковой поверхности яйца после создания искусственного воздушного мешка. При заражении любым путем эмбрионы могут быть травмированы, поэтому их гибель в первые 24 часа расценивается как неспецифическая. Оптимальное количество вируса при заражении — 1000 — 10 000 инфекционных доз. К. в. в эмбрионах обычно происходит при t° 36—37°. Некоторые вирусы, напр, вирус вакцины, могут размножаться при температуре выше 40°, в то время как возбудитель натуральной оспы необходимо культивировать при температуре не выше 38,5°. Температурно-чувствительные мутанты вирусов, обладающие, как правило, сниженной патогенностью, культивируют при t° 25—28°.
При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (многие арбовирусы, вирус энцефаломиокардита и др.), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.
Большинство известных вирусов можно выращивать в культурах клеток и тканей (см.). Чаще всего используют однослойные первичные или перевиваемые клеточные культуры на стекле, реже применяют суспензионные культуры. К первичным культурам клеток вирусы адаптируются легче, чем к перевиваемым. Вирусы человека лучше всего размножаются в культурах человеческих клеток и почечных клеток обезьян.
Оптимальная доза вируса при заражении — 0,1—0,001 50% тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. Объем инокулята должен быть небольшим. Адсорбцию вируса проводят в течение 1—2 час. при t° 37°, после чего инокулят удаляют, если он токсичен для клеток. Питательная среда должна иметь pH 6,9 — 7,2. Если к ней прибавлена сыворотка, последняя не должна содержать антител или неспецифических ингибиторов по отношению к культивируемому вирусу. Наиболее интенсивная репродукция большинства вирусов происходит при t 36 — 37°; при более низкой температуре (33°) культивируют риновирусы.
При К. в. с целью их выделения из инфицированных органов весьма эффективно культивирование клеток самой исследуемой ткани после ее трипсинизации (напр., ткани миндалин для выделения аденовирусов).
Размножение большинства вирусов сопровождается цитопатическими изменениями. Максимальное количество вируса в культуре обычно наблюдается при дегенерации 75% клеток. Размножение вирусов, не обладающих цитопатической активностью, можно установить с помощью реакции гемадсорбции (многие миксо- и тогавирусы), методом иммунофлюоресценции, путем исследования культуральной жидкости на наличие гемагглютининов (напр., миксовирусы) или комплементсвязывающего вирусного антигена, а также в опытах на животных (вирус бешенства). Некоторые вирусы можно выявить по их способности подавлять размножение цитопатогенного вируса, т. е. по феномену интерференции (напр., в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкоза птиц, не размножается вирус саркомы Рауса). Некоторые вирусы образуют в клетках включения.
Большинство вирусов после размножения в клетках выходит в культуральную среду, ряд других остается связанным с клетками (вирусы оспы, аденовирусы), некоторые герпетические вирусы необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками, поскольку при разрушении клеток они инактивируются. Иногда при взаимодействии вируса и клетки развивается хроническая инфекция. Напр., инфицированные вирусом лимфоцитарного хориоменингита перевиваемые человеческие клетки могут продуцировать инф. вирус в продолжение многих поколений.
Для выращивания коронавирусов человека и некоторых других используют тканевые культуры, т. е. культивируемые вне организма тканевые фрагменты. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. О размножении вируса в этом случае судят по прекращению движения ресничек культуры ткани.
Следует учитывать возможность присутствия в культурах клеток и тканей различных вирусов и микоплазм. Они могут быть внесены вместе с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или используемой в качестве ингредиента питательной среды сыворотки.
Читайте также: Какие из перечисленных ниже названий обозначает ткань
Адаптация вируса к искусственным условиям размножения требует проведения нескольких пассажей, быстро следующих друг за другом при заражении небольшой дозой вируса. Обычно интенсивность репродукции вируса при этом значительно возрастает. Иногда вирус после адаптации к одной системе приобретает способность размножаться также в других системах. Свежевыделенные вирусы более пластичны, чем долго культивировавшиеся в каких-либо одних условиях. К. в. в искусственных условиях нередко приводит к снижению их патогенности для естественных хозяев, чем пользуются для получения вакцинных штаммов. В неблагоприятных условиях культивирования (малочувствительных системах или при заражении слишком большой дозой) могут формироваться дефектные вирусные частицы, содержащие лишь часть генома или не имеющие нуклеиновой к-ты. Некоторые вирусы вообще не удается культивировать в искусственных условиях или их репродукция прекращается после нескольких пассажей.
Сохранять вирусы в течение нескольких дней можно при t° 4° в среде с pH ок. 7,0. Устойчивость их возрастает при удалении клеточных фрагментов и прибавлении сыворотки (10%), глицерина (50%) или обезжиренного молока (50%). Все вирусы хорошо сохраняются при t° —70° и ниже в герметически закрытых сосудах; многие остаются жизнеспособными месяцы и даже годы. Оспенные вирусы и энтеровирусы хорошо сохраняются при t° —20°. Замораживание вируса должно происходить быстро. Для повышения устойчивости вируса прибавляют к среде сывороточный белок, куриный желток, пептон, сахарозу или глюкозу. Влияние стабилизаторов на разные вирусы неодинаково. Вирусы могут оставаться жизнеспособными длительное время и после лиофилизации. В качестве стабилизаторов при этом используют пептон (10%), молоко (50%), сахарозу с желатиной или куриным желтком (по 10 %). Лиофилизированный вирус должен сохраняться в вакууме или нейтральном газе (напр., азоте) при t° 4° или —15°.
Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; Соколов М. И., Синицкий А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Штарке Г. и др. Практическая вирусология, пер. с нем., М., 1970, библиогр.; Comparative diagnosis of viral diseases, ed. by E. Kurstak a. C. Kurstak, v. 1—2, N. Y. a. o., 1977.
Методы культивирования вирусов
Вирусы не способны культивироваться на питательных средах, т.к. являются внутриклеточными паразитами.
1. Метод культивирования в организме чувствительных экспериментальных лабораторных животных.
Ограничения:
1) не все вирусы человека размножаются в организме лабораторных животных;
2) в организме экспериментальных животных есть иммунная система, которая может оказывать влияние на размножение вирусов.
2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.
Куриные эмбрионы имеют двухслойную экто- и энтодермальную хорион-аллантоисную оболочку; желточный мешок построен из мезодермальных клеток. Т.о., куриный эмбрион содержит ткани любого происхождения.
Куриный эмбрион не обладает иммунологической активностью.
Дешевле по сравнению с лабораторными животными. После заражения куриных эмбрионов они погибают вследствие размножения вирусов. На оболочках эмбриона могут образовыватся бляшки – мелкие зернистые образования. Вирус накапливается в жидкости куриного эмбриона.
Но: в куриных эмбрионах размножаются не все вирусы человека.
3. Метод культивирования вирусов в культуре ткани:
– для культивирования вирусов вне организма; используют эмбриональные, опухолевые клетки, которые активно размножаются в питательных средах для культуры тканей.
Типы культур тканей:
1) перевиваемые тканевые культуры – культуры обычно опухолевых клеток. Они стандартные. Их нужно постоянно поддерживать, они одинаковы во всех лабораториях мира;
2) первично-трипсинизированные тканевые культуры — культуры эмбриональных тканей, которые готовятся каждый раз по мере надобности: эмбриональную ткань измельчают, затем подвергают обработке трипсином (чтобы разрушить межклеточные связи), центрифугируют отдельные клетки. Эти культуры ткани обладают хорошими ростовыми качествами, но они не стандартны.
Для поддерживания культур ткани служат специальные синтетические питательные среды.
Культивирование вирусов под агаровым покрытием (однослойные культуры тканей) дает возможность получить потомство отдельных вирионов.
Методы регистрации размножения вирусов
1. Организм животного:
— Изменения в организме животного (болезнь).
2. Куриный эмбрион:
3. Культура ткани:
При размножении вирусов проявляются изменения, которые не свойственны здоровым клеткам:
— ЦПЭ (цитопатический эффект);
— У культивируемых вирусов есть феномен гемадсорбции (в результате избыточного синтеза гемагглютинин экспрессируется на наружную поверхность клеток культуры ткани и они приобретают способность адсорбировать эритроциты);
— появление в клетках включений – морфологических структур, которые обнаруживаются только в зараженных вирусом клетках культуры ткани.
Виды включений:
2) По характеру окраски по Романовскому-Гимза:
Типы включений характерны для определенного вируса.
— Учет размножения вирусов в культуре ткани (метод цветной пробы – ориентировочный тест, который говорит о нарушении клеточного метаболизма):
Читайте также: Ветровки мужские из плащевой ткани
— если культура ткани не заражена, в клетках протекают процессы метаболизма, продукты метаболизма обнаруживаются в питательной среде, рН изменяется в кислую сторону, изменяется цвет индикатора;
— если культура ткани заражена вирусом, нарушения клеточного метаболизма, продукты метаболизма не обнаруживаются в питательной среде, рН не меняется, индикатор не меняет цвет.
Культуры тканей по чувствительности к вирусам делятся на 3 группы:
1) пермессивные (поддерживает вирусную инфекцию);
2) непермессивные (не способны поддерживать вирусную инфекцию);
3) полупермессивные (вирус поддерживается, но не размножается; такие клетки передают вирусную инфекцию при контакте с другими клетками).
Особенности противовирусного иммунитета
На вирус развивается полноценный иммунный ответ.
Вирус существует в организме в двух формах. В отношении внеклеточного вируса действуют те же механизмы противомикробной резистентности, что и в отношении бактерий.
Неспецифические механизмы:
— клеточная ареактивность – отсутствие специфических рецепторов для вирусов на клетках организма;
— выделительные механизмы: чихание, кашель;
— барьерная функция кожи и слизистых оболочек;
Его особенности: при бактериальных инфекциях – лейкоцитоз, при вирусных – лейкопения. Т.к. нейтрофильные лейкоциты фагоцитируют вирус, он в них размножается и они гибнут. Защитное значение имеет фагоцитоз клеток, пораженных вирусом – на поверхности таких клеток экспрессируются вирусные белки, что делает их объектом макрофагального фагоцитоза, отсюда – моноцитоз, характерный для вирусных инфекций.
— гуморальный иммунитет: система комплемента, пропердина и вирусные ингибиторы – это химические группировки и радикалы, тождественные вирусным рецепторам, и они их блокируют.
Специфические механизмы иммунитета
Роль антител особая. Уровень сывороточных антител и устойчивость к вирусам не идут параллельно. При вирусной инфекции важно не количество антител, а их локализация в организме – на месте входных ворот или на территории пораженных тканей.
Большую роль при вирусной инфекции играет клеточный иммунитет. Это связано с тем, что инфицированные вирусом клетки становятся мишенью для цитолитического действия Т-киллеров.
При заражении двумя разными вирусами одной ткани один подавляет другой. Это явление лежит в основе невосприимчивости к вирусным инфекциям. Это
Интерферон – индуцибельный белок клеток позвоночных, появляется под влиянием интерфероногенов. Один из них – вирусная инфекция. Основная функция интерферона: подавление размножения вирусов.
Виды (в зависимости от продуцирующей клетки):
Интерферон – важнейший фактор, обладающий многогранной биологической активностью: стимулирует фагоцитоз, киллерную функцию Т-лимфоцитов, подавляет синтез комплемента, снижает гемопоэз, снижает развитие реакций гиперчувствительности замедленного и немедленного типов.
Интерферон обладает активностью в отношении внутриклеточных вирусов. Он нарушает трансляцию иРНК на рибосомах, что ведет к прекращению синтеза вирусных белков.
Интерферон появляется в клетке уже через 2 часа после заражения вирусом. Защищает практически от всех видов вирусных агентов.
Особенности интерферона:
— подавляет репродукцию любых видов вирусов (т.е. не обладает специфичностью);
— Обладает видовой специфичностью (защищает только свой вид).
Универсальность интерферона делает его незаменимым в терапии вирусных инфекций.
Интерферон обеспечивает защиту на уровне нуклеиновой кислоты, т.е. поддерживает нуклеиновый гомеостаз, а антитела и Т-лимфоциты – белковый гомеостаз.
Индукторы синтеза эндогенного интерферона:
— естественные (бактерии, вирусы, ЛПС);
— синтетические (крупномолекулярные соединения: полифосфаты, поликарбонаты и т.п.)
Применение интерферона:
— средство антивирусной терапии.
Химиотерапия вирусных инфекций
С помощью химиотерапевтических препаратов воздействуют на различные этапы взаимодействия вируса с клеткой: тормозят адсорбцию вирусов на клетках.
Основные препараты:
– производные ремантадина строго специфичны (ремантадин – при вирусах гриппа А);
– производные марборана (онковирусы, вирус оспы и т.д.);
– структурные аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований (фтортимедин, фтордезоксиурацил, азидотимедин и т.п.);
Встраиваются в вирусную нуклеиновую кислоту → вирусы теряют инфекционность.
Специфическая профилактика вирусных инфекций
Вирусные вакцины: живые и убитые.
В настоящее время живые вакцины используется…, т.к. возможна реверсия аттенуированных штаммов.
Средство экстренной профилактики: иммунные сыворотки, интерферон.
Экстренная профилактика кори – коревой γ-глобулин. Чаще используются химические и генно-инженерные вакцины.
Принципы классификации вирусов
По типу нуклеиновой кислоты вирусы делятся на:
По размерам вириона на:
По типу симметрии нуклеокапсида на:
По наличию или отсутствию суперкапсидной оболочки.
По типу репликации нуклеиновой кислоты.
Главную роль в патологии человека играют РНКовые вирусы к ним относятся:
ДНКовые вирусы, патогенные для человека. Это:
— вирус папилломы, полиомы и бородавок;
— Аденовирусы (постоянные обитатели глоточного кольца), могут вызывать ОРВИ, ОРЗ;
— сем. Поксвирусов, включающее вирус натуральной оспы.
Происхождение вирусов
Происхождение вирусов – вопрос, который на протяжении многих лет составлял предмет дискуссий.
Было выдвинуто три гипотезы:
1. Вирусы – потомки бактерий и других одноклеточных организмов, претерпевших дегенеративную (регрессивную) эволюцию.
2. Вирусы – потомки древних доклеточных форм жизни, перешедших к паразитическому способу существования.
3. Вирусы – дериваты (производные) клеточных генетических структур, ставших относительно автономными, но сохранившими зависимость от клеток.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом
- Правообладателям
- Политика конфиденциальности
Мастерица © 2023
Информация, опубликованная на сайте, носит исключительно ознакомительный характер