Методы выращивания изолированных тканей растений были разработаны Ф. Уайтом и Р. Готре. Сущность метода заключается в том, что выделенные кусочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях.
Если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться, и затем из нее может развиться целый растительный организм. Так, из одной полностью дифференцированной клетки флоэмы, выделенной из корнеплода моркови, из клетки сердцевинной паренхимы табака и других можно получить целое, полностью развившееся растение. В опытах Р.Г. Бутенко с клетками флоэмы моркови при выращивании на питательной среде в стерильных условияхсначала клетки быстро делились. Получалась недифференцированная массамелких клеток — каллюс меристематической структуры (увеличенное число рибосом, митохондрий и т. д.) с интенсивным синтезом РНК и белка. При этом возрастала интенсивность дыхания и увеличивалась доля пентозофосфатного пути. Затем в массе однородных клеток возникали очаги дифференциации, клетки дифференцировались вторично.
Процесс вторичной дифференцировки можно разделить на две фазы. Первая фаза — это образование в массе однородных клеток очагов регенерационной меристемы и возникновение зародышевых структур (эмбриоидов), которые напоминают настоящие и имеют зачаточную почечку и зачаточный корешок. На второй фазе происходит рост этих зародышевых структур. При этом в зависимости от соотношения фитогормонов (ауксинов и цитокининов) происходит преимущественный рост тех или иных органов. В настоящее время ведутся исследования с изолированными протопластами, которые выделяют путем разрушения клеточных стенок специальными ферментами. Изолированные протопласты при помещении их на подходящую питательную среду образуют новую оболочку, т. е. превращаются в клетки. Вместе с тем протопласты способны сливаться вежду собой и образовывать клеточную оболочку. Таким образом, можно получить гибридную клетку, а из нее растение. Рост и дифференциация и в этом случае зависят от соотношения физических и гормональных веществ в питательной среде.
Метод выращивания изолированных тканей, клеток, протопластов позволяет решать многие теоретические вопросы, связанные с раскрытием механизмов дифференцировки (морфогенеза), регуляции физиологических процессов и др. Этот метод получил также широкое практическое применение в области сельского хозяйства, биотехнологической промышленности.
Биотехнология— наука, использующая биологические принципы в практических целях. Эта отрасль науки охватывает очень широкий круг вопросов. Ряд из них решается с помощью клеточных культур. Так, все более важное значение приобретает клональное размножение. Клон — ряд поколений генетически однородных потомков одной исходной особи, образующейся в результате бесполого размножения. Клонирование позволяет получать большое количество посадочного материала, полностью идентичного исходной особи.
При клональном микроразмножении в большинстве случаев в качестве исходного материала используются фрагменты верхушечной апикальной меристемы. Верхушечные меристемы не содержат патогенных микроорганизмов, поэтому растения, полученные от них, являются здоровыми. Изолированные меристемы выращивают в стерильных условиях на ряде последовательно меняющихся питательных сред. В результате получаются растения с корневой системой, пригодные для посадки в почву. Этим методом от клеток меристемы одного растения можно получить практически неограниченное число потомков. Метод широко применяется для размножения декоративных, ягодных и других растений. Все большее значение в селекции приобретает метод изолированных клеток. Здесь возможны разные направления: направленный отбор клеток, оказавшихся устойчивыми к тем или иным неблагоприятным условиям среды или болезням, и выращивание из них устойчивых растений (клеточная селекция).
Читайте также: Как сшить маску из ткани схема
Важное значение имеет получение гаплоидных растений, содержащих одинарный набор хромосом. Этот метод предполагает получение растений из мужских либо из женских гамет. Гаплоидные растения после обработки колхицином имеют два набора идентичных хромосом, полностью соответствующих материнскому растению. Большие надежды возлагаются на соматическую гибридизацию, заключающуюся в слиянии двух протопластов. Таким путем были получены гибриды между картофелем и томатами, названные «помато». Преимущества такой гибридизации заключаются в том, что наследуются признаки, не только закодированные в ядре, но и в органеллах цитоплазмы. Следовательно, можно управлять такими важными процессами, как фотосинтез, дыхание и др. Наконец, нельзя не отметить широкое использование культуры изолированных тканей для промышленного получения ряда важнейших лекарственных и пищевых препаратов. В качестве примера можно привести получение тонизирующих веществ из клеток женьшеня, стероидных сапонинов из клеток дискореи дельфитовидной и др.
Необходимо в заключение отметить, что для всех направлений применения метода изолированных тканей необходимо знание физиологических особенностей используемого объекта. Из опытов с культурой изолированных тканей, клеток и протопластов можно сделать несколько выводов:
1. Все клетки действительно имеют одинаковые потенциальные возможности.
2. Клетка, находящаяся в окружении других клеток, и клетка, выделенная из ткани, проявляют эти возможности по-разному.
3. Проявление потенциальных возможностей клеток определяется внутренними и внешними условиями. Большое значение имеют гормоны.
4. В основе регуляции дифференциации клетки лежит дифференциальная активность генома.
5. Не все клетки могут полностью проявить свои возможности. В некоторых случаях гены настолько репрессированы, что эти возможности не проявляются.
В процессе развития клетка может также потерять способность реализовать имеющуюся информацию.
Понятие культуры изолированных клеток и тканей
Процесс выращивания клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) называется методом получения культуры изолированных тканей. Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями (рис. 3.1. и 3.2).
Культуры изолированных клеток и тканей.
| Каллусные Рис. 3.1. Каллусная ткань, выращенная из одной клетки на питательной среде | Опухолевые Рис. 3.2.Патологическое разрастание качественно изменившихся растительных клеток |
| Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях. Её также можно вырастить в стерильной культуре на питательной среде. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дифференцированных клеток. | Растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение. Превращение растительных клеток в опухолевые связано с проникновением в них ДНК бактериальной клетки, так называемой Ti-плазмиды, которая значительно изменяет свойства клетки. |
Использование культуры изолированных клеток и тканей.
Культуры изолированных тканей широко используются в сельском хозяйстве и промышленном производстве. Они обладают преимуществами по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущими и выращиваемыми на плантациях растениями), а именно:
1. Независимостью от внешних условий.
2. Оптимизацией условий выращивания.
3. Автоматизацией и компьютеризацией процессов.
4. Возможностью выращивать исчезающие виды растений.
5. Возможностью массового клонального микроразмножения плодоовощных и декоративных растений.
6. Оздоровлением от вирусных и других инфекций.
7. Возможностью, с помощью культуры in vitro, расширения направлений селекционной работы, то есть — получить клоны клеток, затем и растения с запрограммированными свойствами.
Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты, возникла новая отрасль промышленности, осуществляющая биологический синтез веществ, необходимых человеку.
Условия культивирования тканей и клеток.
Читайте также: Ткань для обшивки крыла самолета
Культивирование фрагментов ткани или одного растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток, требует соблюдения полной асептики.
Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, тормозящие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому все манипуляции с клетками и тканями при культивировании in vitro проводят с соблюдением определенных правил асептики в ламинар-боксе или в асептических комнатах. Асептика достигается подачей пропущенного через фильтры стерильного воздуха, направленного из ламинар-бокса наружу. На поверхности растительных тканей всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которая достигается путем обработки участков растений, из которых будут выделять экспланты, дезинфицирующими веществами (перекись водорода, сулема).
Для работы с биологическим материалом необходимы следующие составляющие:
— чистая посуда и биореактор (ферментёр);
— стерильная питательная среда;
Чистая посуда и ферментёр. Предварительно завернутые в бумагу или фольгу инструменты и вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 о С в течение 1,5-2 часов.
При использовании разных типов ферментеров было установлено, что физиологические свойства культур могут меняться, поэтому синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре следует проводить при подаче воздуха снизу. В этих условиях синтез протекает намного активнее (рис. 3.3).
При выращивании клеток в малых объемах, например, в колбах, нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.
Питательные среды. Культивирование изолированных клеток и тканей происходит в многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако в состав всех сред обязательно входит и компонентная основа, к которой добавляют необходимые растениям группы веществ: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны. Такой компонентной основой служит агар-агар – полисахарид морских водорослей, способный образовывать в воде гели, затвердевающие при 45°С. В питательную среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосового ореха, конского каштана), патока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой), томатный сок. Введение их в среду дает положительный результат. Однако каждый действующий компонент имеет свойственные только ему технологические характеристики.
Рис. 3.3. Биореактор (ферментер) для выращивания микроорганизмов, клеток или тканей
Дедифференцировка – основа процесса образования каллуса.
Дедифференцировка– это возвращение специализированных клетокв меристематическое состояние, когда они получают способность к делению.
Органы и ткани растений служат исходным материалом для получения культур клеток и тканей, однако, чаще для этого используют листья растений.
Предварительно отработанный стерильный фрагмент листа помещают на твердую питательную среду. Листья состоят из разных тканей, клетки которых дифференцированы и синтезируют различные, характерные для этих клеток молекулы белков, углеводов, липидов и др. веществ. Данные дифференцированные клетки не обладают способностью к делению.
В процессе механическом повреждении листа происходит выделения экспланта, а под действием добавленных в среду растительных гормонов ауксинов и цитокининов клетка дедифференцируется. Она теряет запасные вещества – крахмал, белки, липиды, специализированные органеллы хлоропласты и др. В результате этого все клетки приобретают новые близкие морфологические и физиологические свойства, т.е. становятся каллусными (делящимися) клетками. На листовом экспланте формируется каллусная ткань.
Типы клеточных культур. В зависимости от способа и условий культивирования существуют несколько типов культур клеток и тканей:
— культура одиночных клеток.
Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четкой структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определяют, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной.
Читайте также: Ткань трикотажная с рисунком
Общие характеристики каллусных клеток. Каллусная клетка обладает целым рядом свойств, общих со всеми растительными клетками. Это онтогенез клеток, устойчивость к тем или иным неблагоприятным факторам внешней среды и другие свойства. Вместе с тем, у каллусных клеток во время их культивирования появляются свои индивидуальные особенности, такие как физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность и некоторые другие.
Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее физиологическое старение всей популяции каллусных клеток принято оценивать по состоянию большинства клеток (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Каллусные клетки вРис. 3.5. Выход протопласта через
Дата добавления: 2016-05-28 ; просмотров: 4109 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ
Методы выращивания изолированных тканей были разработаны Ф. Уайтом и Р. Готре. Сущность метода заключается в том, что выделенные кусочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях. Если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться и затем из нее может развиться целый растительный организм. Так из одной, полностью дифференцированной клетки флоэмы, выделенной из корнеплода моркови или из клетки сердцевинной паренхимы табака, можно получить целое, полностью развившееся растение. В опытах советского физиолога Р. Г. Бутенко с клетками флоэмы моркови при выращивании на питательной среде в стерильных условиях сначала удалось заставить их делиться и получить недифференцированную массу клеток — каллюс. Затем в этой массе клеток возникли очаги дифференциации. Процесс вторичной дифференциации можно разделить на две фазы. Первая фаза — это образование в массе однородных клеток очагов регенерациониой меристемы и возникновение зародышевых структур, которые напоминают настоящие и имеют зачаточную почечку и зачаточный корешок. Для того чтобы зародышевые структуры появились, необходимо добавление фитогормонов цитокининов. На второй фазе происходит рост этих зародышевых структур, но для этого необходимо добавить в питательную среду ауксины. При этом в зависимости от соотношения ауксинов и цитокининов происходит преимущественный рост тех или иных органов.
В настоящее время ведутся исследования с изолированными протопластами, которые выделяют путем разрушения клеточных стенок специальными ферментами. Из протопласта, изолированного из дифференцированной клетки мезофилла листа, получают целый растительный организм. Рост и дифференциация и в этом случае зависят от соотношения гормонов в питательной среде.
Из этих опытов можно сделать несколько выводов: 1. Все клетки действительно имеют одинаковые потенциальные возможности. 2. Клетка, находящаяся в окружении других клеток, и клетка, выделенная из ткани, проявляют эти возможности по-разному. 3. Проявление возможности клетки определяется внутренними и внешними условиями. Большое значение имеют гормоны. 4. В основе регуляции дифференциации клетки лежит дифференциальная активность генома. 5. Не все клетки могут полностью проявить свои возможности. В некоторых случаях гены клетки настолько репрессированы, что эти возможности не проявляются. В этой связи гены клетки делятся на активные, потенциально активные и неактивные.
Рис. 62. Один из возможных способов взаимосвязи элементов генетической системы переключения, обеспечивающих определенный путь развития (по Боннеру).
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом