Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3
4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
3. Культивирование вирусов
3. Культивирование вирусов
Основные методы культивирования вирусов:
1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;
2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7—10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах.
В результате заражения могут происходить и появляться:
2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;
3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);
4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).
Различают следующие типы культур тканей:
1) перевиваемые – культуры опухолевых клеток; обладают большой митотической активностью;
2) первично трипсинизированные – подвергшиеся первичной обработке трипсином; эта обработка нарушает межклеточные связи, в результате чего выделяются отдельные клетки. Источником являются любые органы и ткани, чаще всего – эмбриональные (обладают высокой митотической активностью).
Для поддержания клеток культуры ткани используют специальные среды. Это жидкие питательные среды сложного состава, содержащие аминокислоты, углеводы, факторы роста, источники белка, антибиотики и индикаторы для оценки развития клеток культуры ткани.
О репродукции вирусов в культуре ткани судят по их цитопатическому действию, которое носит разный характер в зависимости от вида вируса.
Основные проявления цитопатического действия вирусов:
1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;
2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;
3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;
4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);
5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).
Данный текст является ознакомительным фрагментом.
Читайте также
Инфекционная РНК и реконструкция вирусов
Инфекционная РНК и реконструкция вирусов Доказательства того, что РНК вирусов является генетическим материалом, предоставил нам все тот же ВТМ. Прежде всего ученым удалось изменить частицы ВТМ, устранив из их состава белковый компонент. В таком состоянии вирусы
Мутации вирусов в лаборатории
Мутации вирусов в лаборатории Мы говорили о мутантах ВТМ, созданных природой. Сегодня нам известны уже и его лабораторные мутанты. Первые из них увидели свет в лаборатории Г. Шрамма.Шрамм в своих опытах исходил из возможности замены аминогруппы (—NH2) в молекуле цитозина
Угроза вирусов
Угроза вирусов Одна из книг о вирусах очень метко названа «Вирусы — враги жизни». И не только у вирусов гриппа, но и у других вирусов, поражающих человека, «на совести» десятки тысяч, а может быть, и миллионы жизней.Небезопасной болезнью следует считать краснуху. Это
10. Морфология вирусов, типы взаимодействия вируса с клеткой
10. Морфология вирусов, типы взаимодействия вируса с клеткой Вирусы – микроорганизмы, составляющие царство Vira.Вирусы могут существовать в двух формах: внеклеточной (вириона) и внутриклеточной (вируса).По форме вирионы могут быть: округлыми, палочковидными, в виде
11. Культивирование вирусов. Противовирусный иммунитет
11. Культивирование вирусов. Противовирусный иммунитет Основные методы культивирования вирусов:1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает;2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные
2.4. Влияние вирусов на организм человека
2.4. Влияние вирусов на организм человека Большую группу паразитов человека, животных и растений образуют вирусы. Они могут вызывать ряд тяжелых заболеваний, таких как натуральная и ветряная оспа, полиомиелит и др. Вирусы изучаются специальной наукой –
1. Морфология и структура вирусов
1. Морфология и структура вирусов Вирусы – микроорганизмы, составляющие царство Vira.Отличительные признаки:1) содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК);2) не имеют собственных белоксинтезирующих и энергетических систем;3) не имеют клеточной
2. Взаимодействие вирусов с клеткой хозяина
2. Взаимодействие вирусов с клеткой хозяина Взаимодействие идет в единой биологической системе на генетическом уровне.Существует четыре типа взаимодействия:1) продуктивная вирусная инфекция (взаимодействие, в результате которого происходит репродукция вируса, а
Глава 10 Мир вирусов и его эволюция
Глава 10 Мир вирусов и его эволюция Пер. Г. ЯнусаВирусы были открыты как нечто совсем непримечательное, а именно необычная разновидность инфекционных агентов, а возможно, и особый род токсинов, вызывающих болезни растений, например табачную мозаику. Так как эти агенты
3.1. Генетический материал вирусов и прокариот
3.1. Генетический материал вирусов и прокариот Генетический материал вирусов представлен одной молекулой нуклеиновой кислоты (либо ДНК, либо РНК), окруженной защитной белковой оболочкой – капсидом. Функционирование вирусов происходит по-разному, в зависимости от их
Открытие фильтрующихся вирусов
Открытие фильтрующихся вирусов Вирусы… Живые существа, увидеть которые позволил лишь электронный микроскоп при увеличении в десятки тысяч раз, а тонкую структуру — в сто тысяч раз и более. Вирусология — наука о вирусах, расцвет которой стал возможным лишь в наш век
Сколько всего вирусов?
Сколько всего вирусов? Вирусами называют внеклеточные формы жизни, способные проникать в определенные живые клетки и размножаться только внутри них. Вирусы являются внутриклеточными паразитами на генетическом уровне. Впервые их (вирус табачной мозаики) открыл в 1892 году
Положение вирусов в системе живой природы
Положение вирусов в системе живой природы Спорным на протяжении истории биологии является положение в мегасистеме вирусов. Одни авторы считают вирусы особой «неклеточной» формой жизни, другие – что их нельзя относить к живым организмам в полном понимании этого слова,
Таблица 4. Морфологические классы вирусов (по Г. Шлегелю, 1987)
Таблица 4. Морфологические классы вирусов (по Г. Шлегелю,
Вопрос 40. Культивирование вирусов в культурах тканей
1. Для культивирования вирусов используют ряд методов. Этокультивирование в организме экспериментальных животных, развивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще —эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращивания клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бакт. загрязнения.
Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жизнеспособность клеток удается сохранить лишь временно, ирастущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедеятельность, но и активно делятся.
В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), ав суспензированных —взвешены в жидкой среде.
По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:
первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;
полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;
перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в течение неопределенно длительного срока в многочисленных генерациях.
Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.
2. О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци- топатическому действию (ЦПД):
формированию многоядерных симпластов или синтиция в результате слияния клеток.
• в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут образовываться включения — структуры, не свойственные нормальным клеткам.
Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофилъные.
По локализации в клетке различают:
Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы(тельца Гварниери и Лашена), бешенства(тельца Бабеша-Негри) и др.
О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу «бляшек» (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытиемна месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моно-сом — так называемые стерильные пятна, или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомством одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразования.
Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции. При культивировании вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретет спос-ть вызывать гемагглютинацию.
Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод «цветной пробы». При размножении в питательной среде с индикатором незараженных клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.