кт – участки клеточного роста в спец пит среде ин витро. Можно получить из любого органа и ткани животного и человека, поэтому можно не исп дорогостоящ лаб и естественно восприимч животных. Исп органы молодых жив-х и эмбрионы, тк вирусы лучше размножаются в молодых и интенсивно раст орг.
Цели: выделение вирусв из патмат, поддерж вир в усл лаб, наработка вакцин, биомодель для пост РН и РГАд, титрование вирусов, изуч взаимод вируса с клеткой.
Требования: макс стерильность, пасуда нейтральная, поддерж и ростовые среды (в составе – ср Игла, 199, р Хенкса, гидролизат лактатальбумина; в ростовой – сыв крови; индикатор фенолрот: красный цве – пш среды нейтральна, жёлтая мутная – бакпророст, жёлтая прозрачная – гибель клеток, малинов – зещелач посуда)
Классификация: Переживающие, Растущие (плазменные, монослойные: первично-трипсинизир, субкультуры, диплоидные, перевиваемые)ю
Техника приготовления: Переживающие: готовят из орг и тк, кот измельч, отм от ФЭК ФБР, залив в спец пит среду, клетки во взвеш сост (Живые, но тер спос к пролиферации). Исп редко, против ящура)
1 Плазменные: орг и тк измельч, отм от ФЭК ФБР, во флакон внос плазму крови кур, пинцетом расп клетки в виде островков, для прикрепл – экстракт из кур эмбр (плазма сворачивается) или подогр дно до 45 град, залив рост среду, пом в термостат при т 37, через 2 суток – рост в виде пучков.
2 Монослойные : расп в 1 слой. В частности:
1.Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам
2.Субкультуры получ из перв трипс. Удал рост среду, сним монослой при пом р-ра версена, отмыв от р-ра путём Ц, к осадку доб трипсин, далее см. перв трипсин.
3 Диплоидные: из перв трипс путём многократн пересевов на пит сред, клетки сохр жизнеспособн в теч 10 мес, потом – дегенерат измен и гибель
4.Перевиваемые: из опухол или дипл после обр УФЛ и ультразвуком, дипл приобр св-ва злокач опухолей.
35.Превично-трипсинизированные кт. Цпд вирусов.
Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам.
ЦПД : после формирования монослоя удал рост среду, внос поддерж и доб вирус, помещ в термостат. Или с целью устран токсичности вируссод мат сначала могут внести вирус, ост на 1-2 часа, удалить вирус и внести поддерж среду. Флаконы – в термостат, кажд день – микроскопия под мал увел. через 2-3 суток в монослое обр пустоты, связ с ЦПД вируса. Флакон вынимают из термостата, удал поддерж среду, помещ в морозильн кам, где они сохр. При необходимости получ вируса флаконы 3 раза замор и размораж, доб ФБР и Ц, вирус – в надосад жидкости.
ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Р.Я. Подчерняева, М.В. Мезенцева, И.А. Суетина, О.А. Лопатина. Г.Р. Михайлова,
А.Д. Петрачев, Л.А. Потапова, О.В. Бакланова, Е.Л. Фирсова, О.М. Гринкевич,
Т.Н. Притчина, М.Н. Щетвин, Л.И. Руссу
ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, Москва, cells@rambler.ru
В Лаборатории культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского создана Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных, которая входит в состав Российской коллекции клеточных культур. Для каждой клеточной линии разработан паспорт, согласно международным требованиям. Проводится постоянная работа по улучшению условий хранения и культивирования клеток в зависимости от различных сред, сывороток или их заменителей, а также постоянный мониторинг микоплазм, вируса бычьей диареи и других возбудителей инфекций. Проведен поиск клеточных линий, чувствительных к различным ДНКи РНК-содержащим вирусам, включая вирусы гриппа. На моделях клеточных культур изучалась эффективность различных антивирусных препаратов — амантадина, ремантадина, арбидола, тамифлю, ингаверина, циклоферона, ридостина, неовира, амиксина и 15 нейротропных пептидов, обладающих иммуномодулирующей и противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса, гриппа человека и птиц. На моделях культур клеток проводилось изучение закономерностей синтеза регуляторных цитокинов в зависимости от условий культивирования клеток. Совместно с контрольным Институтом им. Л.А. Тарасевича (Москва) была получена вакцинная линия клеток Vеrо(В), охарактеризованная по требованиям ВОЗ. Линия применяется не только для научных исследований, но и для получения первой в стране противогерпетической отечественной вакцины «Витогерпавак». Ключевые слова: клеточные культуры, сыворотки, бессывороточная среда, вирусы, цитокины, вакцина. В настоящее время клеточные культуры находят широкое применение в различных областях биологии, медицины, ветеринарии и биотехнологии. Использование клеточных культур позволяет исследовать биологические процессы, которые сложно, а подчас невозможно, изучить на уровне организма. Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии при производстве многих вакцин, тест-систем и биологически активных веществ. Культуры клеток применяют для диагностики заболеваний различной этиологии, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических, лечебных и косметических средств, а также пищевых добавок. Все это требует стандартизации работы с клеточными культурами в специально оборудованных лабораториях. Для успешного сохранения исходных или направленно измененных свойств клеточных линий, а также для получения воспроизводимых экспериментальных результатов необходимо зафиксировать данное состояние культивируемых клеток. Функцию поддержания исходных свойств клеток и проведения контроля за их состоянием осуществляют Коллекции клеточных культур, сохраняющие эталонные клеточные линии, которые содержатся в криоконсервированном состоянии.
Еще в 1989 г. в нашей стране были разработаны методические указания: «Аттестация перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (РД42-28-10-89), выполнению которых и по сей день придерживаются в работе с культурами клеток. В нашей Лаборатории культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского подготовлены методические рекомендации: «Работа с клеточными культурами (культивирование первичных и перевиваемых клеток)» (1) и «Технологический процесс криоконсервации перевиваемых клеточных линий» (2), которые были утверждены на Ученом совете института и на Лабораторном Совете Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. На базе нашей лаборатории имеется Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных. Фонды коллекции представлены в «Каталоге Всесоюзной коллекции клеточных культур» (3), в «Human and Animal cell lines Catalogue» (4) и в «Каталоге Российской коллекции клеточных культур (РККК)» (5). Для каждой клеточной линии разработан паспорт, согласно международным требованиям, где, в частности, подробно описаны условия культивирования. Одним из ингредиентов, наиболее нестабильных при культивировании клеток, является сыворотка. Ее свойства существенно зависят от источника получения. Учитывая нестандартность сывороток, по рекомендации ВОЗ мы использовали малосывороточные питательное среды из гидролизатов соевой и рисовой муки, разработанные в НПО «Вектор» под руководством Л.П. Сандахчиева.
Оптимизированный состав этих сред представляет собой определенные концентрации ферментативных гидролизатов, растворенных в сбалансированных растворах Эрла или Хенкса, в которые дополнительно добавлены витамины, микроэлементы и отдельные аминокислоты. Показано, что для пролиферации клеток МДСК (клетки почки собаки) при культивировании с соевой средой достаточно добавление только 2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), а для пролиферации клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) требуется добавление 5% FBS. Таким образом, использование соевой среды позволяет снизить количество сыворотки, необходимой для успешного культивирования этих клеток с 10% до 2—5%. Надо отметить, что морфология и кариология клеток МДСК и Vero не менялась при использовании соевой среды (6—8). Для проведения биотехнологических исследований на современном уровне желательно для культивирования клеток применять полностью бессывороточные среды. Список таких сред, как правило, широко представлен во многих каталогах, но, к сожалению, их цена слишком высока. Поэтому мы провели работу с применением отечественной бессывороточной среды «Гибрис-2» производства ООО «ПанЭко».
Адаптация клеток к этой среде проводилась поэтапно. Так, для получения адаптированной линии клеток МДСК к среде «Гибрис-2» было проведено 4 пассажа с 3% FBS, 3 пассажа с 2% FBS, 5 пассажей с 1% FBS и 6 пассажей без сыворотки. Показано, что индекс пролиферации (ИП), идентичный контрольным значениям, был отмечен только в присутствии 1—2% FBS, а культивирование без сыворотки не приводило к контрольным показателям. Возможно, требуется большее количество пассажей для полной адаптации клеток к бессывороточной среде (9,10). С целью оптимизации работы с нативными сыворотками было исследовано влияние сывороток северных оленей, суягных овец, свиней и морских котиков на пролиферативную активность 2-х клеточных линий — ЛЭЧ (клетки легких эмбриона человека) и Vero. Контролем служили эксперименты с использованием сыворотки FBS.
Было показано, что сыворотки из крови северных оленей можно успешно использовать для культивирования клеток Vero, которые наиболее часто применяются для биотехнологических целей. Однако вопрос стандартизации условий культивирования клеток в зависимости от наличия доброкачественных сывороток или их заменителей не утрачивает своего значения. Поэтому, были проведены исследования по получению и применению так называемых ростстимулирующих белков (РБ), выделенных из сывороток северных оленей, суягных овец и свиней с помощью водного раствора полиэтиленгликоля с M.м. 4000—8000 Д, который способствует также удалению ряда контаминирующих агентов. РБ представлены главным образом альбуминовой и α-глобулиновой фракциями, которые являются белковыми факторами роста, влияющими на пролиферацию клеток.
Изучена пролиферативная активность 7 клеточных линий после 5-ти последовательных пассажей в среде с РБ из сывороток свиней, суягных овец и оленей без добавления сыворотки FBS и с 2% FBS. Показано, что для получения показателей индекса пролиферации (ИП), равнозначных с контролем, все же необходимо добавление 2% сыворотки FBS. Показатели ИП разных клеточных линий различались незначительно. Лучшие показатели ИП наблюдались в экспериментах с РБ из сывороток оленей и свиней (11,12). При работе с культурами клеток не менее важным является применение ферментов для диспергирирования или отделения клеток от субстрата при их пересевах. Для этих целей, как известно, можно применять трипсин или химопсин.
Недостатком этих ферментов является то, что сырье для их получения не стандартизовано и не исключает наличия в них патогенных примесей. Поэтому, совместно с сотрудниками НПО «Вектор», мы провели изучение полученного ими препарата «Коллаза», который представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью, выделенных из экологически чистого гепатопанкреаса Камчатского краба с помощью хроматографической очистки и ультрафильтрации. При применении этого фермента по сравнению с трипсином количество жизнеспособных клеток было в 2—2,5 раза больше и требовалось более короткое время воздействия. При этом морфология культивируемых клеток 10 изученных линий оставалась без изменения. Таким образом, использование «Коллазы» при культивировании оказалось более эффективным, чем использование трипсина. Существенной проблемой при работе с клеточными культурами является микробная контаминация клеток, т.к. она влияет на метаболизм клеток, вызывает хромосомные аберрации и изменяет клеточные функции.
Частым контаминантом клеточных культур оказывается вирус бычьей диареи (ВД), относящийся к роду Pestivirus семейства Flaviviridae и являющийся возбудителем вирусной диареи — болезни слизистых крупного рогатого скота. Этот вирус может проникать в клетки из нативных сывороток крупного рогатого скота и даже FBS, добавленных в ростовую среду (13). Так, с помощью метода ПЦР было выявлено наличие ВД в коммерческих FBS, полученных из различных фирм (ПАНЭКО, ООО Биолот, Gibco, Biowest, HyClone, Amimed, Sigma). В сыворотках FBS фирмы ПАНЭКО ВД обнаруживается как до, так и после прогревания в водяной бане при 56°С в течение 30 и даже 60 минут (14). Мы проводили определение ВД с помощью метода ПЦР в клеточных линиях из нашей коллекции.
Иследовались диплоидные клетки легкого и фибробласты эмбриона человека, клетки онкогенных и лимфобластоидных линий человека, перевиваемые клетки обезьян, крупного рогатого скота, собаки, свиньи, крыс, мышей, хомячка, кролика, кошки, овцы, хорька и кур. Клетки хранились в жидком азоте в течение различного периода. Было показано, что диплоидные клетки человека и ряд перевиваемых клеток барана, свиньи, хомячка, обезьян и человека не были контаминированы ВД. Однако в 30% клеточных линий из 83-х изученных был выявлен ВД, причем чаще всего в более поздних закладках. Очевидно, при культивировании этих клеток использовались сыворотки, содержащие этот вирус (15). Одним из пунктов паспорта клеточной линии является чувствительность к репродукции вирусов. Изучение чувствительности разных клеточных линий к определенным вирусам крайне важно для приготовления противовирусных вакцин.
Читайте также: Ткань таслан в розницу
Вирусам свойственен определенный круг хозяев, узкий для одних видов и очень широкий для других. Генетический аппарат вирусов представлен как ДНК, так и РНК в одно- или двунитевой, линейной или циркулярной, моно- или фрагментарной формах. К РНК- содержащим вирусам позвоночных относятся 20 видов вирусов (арена, артери, астро, бирна, борна, бунья, геле, дельта, калици, корона, нода, ортомиксо, парамикса, рабдо, рео, ретро, тога, фило и флави вирусы), включая субвирусные агенты вероиды, сателлиты и прионы. К ДНК-содержащим вирусам позвоночных относятся 11 видов вирусов (адено, анелмо, асфар, гепадна, герпес, иридо, паппилома, парво, покс, полиома и цирко вирусы). Название этих видов вирусов связано либо с их морфологией, либо с местом их изоляции. Интерес к проблеме поиска клеточных линий, чувствительных к различным ДНК- и РНК-содержащим вирусам, позволил нам суммировать различные данные и представить их в виде таблиц 1—4 (16,17).
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
Культуры клеток и тканей — клетки, кусочки ткани, зачатки органа, растущие или сохраняющие жизнеспособность вне организма «в пробирке» (in vitro).
В клеточных культурах клетки не организованы в ткань, тогда как для тканевых и органных культур необходимым условием является сохранение тканевой и органотипической дифференцировки и (или) функции.
История
Первые попытки культивирования клеток in vitro были сделаны в 19 в. В 1885 г. Ру (W. Roux) удалось в течение нескольких дней поддерживать развитие медуллярной пластинки куриного эмбриона в солевом растворе, а в 1887 г. Арнольду (J. Arnold) — наблюдать миграцию лейкоцитов лягушки. Однако в это время не было реальной базы для создания условий, способных поддерживать жизнедеятельность клеток и тканей in vitro. Подлинным началом культивирования клеток вне организма считаются опыты Гаррисона (R. G. Harrison), который в 1907 г. эксплантировал в сгустках лимфы лягушки кусочки медуллярной трубки эмбриона лягушки. Через несколько недель культивирования у этих клеток вырастали аксоны. Метод культивирования в сгустке лимфы, позднее в сгустке плазмы, с добавлением эмбриональных экстрактов стал одним из общепринятых и используется до наст. времени.
Развитию методов культивирования во многом способствовали исследования А. Карреля, который показал возможность длительного культивирования клеток в условиях строгой асептики. Флаконы Карреля являются необходимым элементом оборудования современных культуральных лабораторий. Большой вклад в разработку методов культивирования клеток внесли отечественные ученые А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Г. К. Хрущов, Н. Г. Хлопин и А. Д. Тимофеевский. Группа исследователей из Национального ракового ин-та (США) под руководством Эрла (W. Earle) разработала методы культивирования клеток на стекле, получила культуры одиночных клеток и клеток в суспензии. Результатом работ Фишера (D. Fischer, 1948), Мортона, Паркера, Моргана (H. J. Morton, R. Parker, J. F. Morgan, 1950), Игла (H. Eagle, 1955) явилось создание современных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих in vitro.
После того как в 50-х гг. 20 в. была показана возможность размножения вируса полиомиелита на ряде клеточных культур и возникла практическая заинтересованность в разработке методов Культур клеток и тканей, для получения вакцин эта область исследований начала стремительно развиваться. Создание специальных сред культивирования позволило получить культуры клеток из разных органов и тканей многих видов млекопитающих и человека (см. таблицу). Были выведены специальные суспензионные культуры, приближающиеся по своим способностям давать большую биомассу к культурам микроорганизмов. Суспензионные культуры нашли применение в вирусологии для накопления вирусов энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, везикулярного стоматита, осповакцины, гриппа, болезни Ньюкасла, а также в производстве биол, активных препаратов: ферментов, антител, вакцин. Различные Культуры клеток и тканей применяются с диагностическими целями для культивирования вирусов (см.).
Обнаружение явления спонтанной злокачественной трансформации клеток in vitro, а также трансформации с помощью ряда вирусов и химических канцерогенов явилось экспериментальной основой изучения механизмов канцерогенеза (см. Онкогенез). Разработаны методы слияния клеток для образования гибридов соматических клеток (см. Генетика соматических клеток), которые используются для картирования генов млекопитающих. Совершенствование методов культивирования клеток явилось основой развития цитогенетики человека, идентификации синдромов, связанных с нарушением числа и структуры хромосом (синдромы Дауна, Шерешевского — Тернера, Клайнфелтера, Эдвардса, Патау, кошачьего крика и т. д.). Успехи в области цитогенетики и картирования генов связаны с разработкой принципиально новых методов дифференциальной окраски хромосом. Совершенствование методов культивирования амниотических клеток плода и техники амниоцентеза (см.) позволило подойти к решению основных вопросов медико-генетического консультирования — пренатальной диагностике хромосомных заболеваний и наследственных биохимических нарушений обмена.
Культура клеток является одной из экспериментальных моделей генной инженерии (см.).
Кроме того, методы Культур клеток и тканей применяются в гистологии для изучения морфогенеза и функциональной анатомии клеток и тканей, в иммунологии для культивирования иммунокомпетентных клеток (см.) и изучения их функций в гематологии для культивирования клеток костного мозга и периферической крови.
Основные условия культивирования клеток и тканей
Для производства, получения и хранения Культур клеток и тканей необходимы стерильные помещения, широкий ассортимент солевых р-ров, питательных сред и антибиотиков. Кроме того, требуется следующее оборудование: стерильные боксы с ультрафиолетовым облучением и установками с ламинарным потоком стерильного воздуха; микроскопы — инвертированные для просмотра культур и обычные для анализа препаратов; центрифуги; термостаты с водяным обогревом и с контролируемой подачей CO2; рефрижераторы для хранения сред, антибиотиков, сывороток, ферментов; установки для замораживания и емкости с жидким азотом для хранения клеточных линий; магнитные мешалки; резиновые пробки, трубки, наконечники; посуда из нейтрального стекла типа «Пирекс». Посуду кипятят в специальных детергентах, многократно прополаскивают дист, водой, стерилизуют сухим жаром или автоклавированием. Используемые биол, жидкости стерилизуют фильтрованием под давлением через мембранные фильтры с размером пор 220 нм после предфильтрования через глубинные фильтры (из асбеста или стеклянного волокна).
Кроме традиционного оборудования, современная культуральная лаборатория использует микрополичашки (пластиковые панели с углублениями) с набором автоматических микропипеток и микродозиметров, роллерные и суспензионные установки. Желательно применение пластиковой посуды одноразового пользования.
При поддержании жизнедеятельности клеток in vitro важное значение имеют осмотическое давление, концентрация ионов водорода (pH) и ряд других неорганических ионов, состав газовой среды, температура. Осмотическое давление в клетках млекопитающих составляет при t° 38° ок. 7,6 атм, и его необходимо поддерживать в культуральной среде. Осмотическое давление в питательных средах создается гл. обр. концентрацией хлорида натрия. Определенную роль играют другие неорганические ионы и глюкоза. Высокомолекулярные соединения мало влияют на величину осмотического давления.
Оптимальная концентрация ионов водорода, т. е. pH среды, для роста большинства клеток близка к нейтральным значениям. Для роста диплоидных фибробластов необходимо поддерживать pH в пределах 7,2 — 7,4. Большинство клеток, особенно постоянные клеточные линии, т. е. пересеваемые линии, выдерживают pH от 6,8 до 7,6. Величина pH в культуральной среде зависит от соотношения Гидрокарбонат натрия является частью сбалансированного солевого р-ра питательной среды, CO2 образуется в результате дыхания клеток. При культивировании в закрытых сосудах, в случае низкой начальной концентрации клеток, уровень pH сдвигается резко в щелочную сторону, что сказывается на жизнеспособности клеток. Этого можно избежать, вдувая во флаконы CO2 сразу после посева. Предпочтительно культивирование в открытых сосудах, в термостатах с контролируемой подачей CO2 (5 — 10% CO2 и 95—90% воздуха). Производятся среды с большой буферной емкостью на основе фосфатного буфера, Tris или HEPES (оксиметил-аминометан и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-этансульфоновая к-та).
Для постоянного контроля за уровнем pH в состав ростовых сред вводят индикатор pH, в качестве к-рого часто применяют фенол-красный или фенол-сульфонталеин. Эти вещества не токсичны для клеток в концентрации до 0,002 г/л.
Для поддержания жизнедеятельности клеток и тканей in vitro необходимы ионы натрия, кальция, магния, железа, которые не только участвуют в поддержании постоянства осмотического давления, но необходимы для функционирования ряда клеточных ферментов. Существенна также и достаточная концентрация кислорода, к-рая в закрытых сосудах обеспечивается определенными отношениями объема воздуха и объема среды.
Питательные среды
Культивирование Культур клеток и тканей обеспечивается в первую очередь сложным сбалансированным набором ряда питательных компонентов среды. Среды делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают рост клеток и тканей, тогда как поддерживающие предназначены гл. обр. для сохранения жизнеспособности и функц, активности К. к. и т. в течение продолжительного времени. Среди ростовых сред, в свою очередь, можно выделить естественные питательные среды — продукты частичной обработки естественных высокопитательных веществ: инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота, лошади, человека, эмбрионов телят; гидролизат лактальбумина — продукт ферментативного гидролиза белков молока; аминопептид — ферментативный гидролизат белка; гемогидролизат — продукт ферментативного расщепления крови крупного рогатого скота и человека; эмбриональный куриный экстракт. Существенным недостатком всех естественных (нативных) питательных сред является их нестандартность и сложность стерилизации. Синтетические питательные среды готовят из определенных хим. веществ без включения естественных продуктов.
На синтетических средах без добавления сыворотки или других естественных питательных веществ растут не все клетки. Наиболее широко применяются среда 199, среда Игла и ее модификации, среда F-10 и F-12 (Хэма), CMRL-1066, NCTC-109, среда Мак-Коя и др. В состав синтетических питательных сред входят, как правило, незаменимые аминокислоты в L-форме (аргинин, гистидин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин). Необходимы также цистеин и тирозин. У трансформированных клеток резко повышена потребность в глутамине. Для улучшения роста единичных клеток необходимо добавлять серин. Комплекс витаминов включает витамины группы В (парааминобензойная к-та, биотин, холин, фолиевая к-та, никотиновая к-та, пантотеновая к-та, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, инозитол). Некоторые среды (среда 199, NCTC-109) содержат коферменты и жирорастворимые витамины. Важную группу компонентов составляют восстановители (аскорбиновая к-та, L-цистеин, глутатион) и предшественники нуклеиновых к-т. Источником углеводов служат глюкоза, 2-дезокси-D-рибоза, D-рибоза. Состав сред постоянно совершенствуется. Добавление сыворотки к синтетическим средам улучшает рост клеток. Широкое применение имеют синтетические среды с добавлением 5—20% сыворотки. Для клеточных культур используют сыворотку различного происхождения. H аи лучшими ростовыми свойствами обладает эмбриональная сыворотка. Полностью роль всех компонентов сыворотки не выяснена. Пептиды, липиды, аминокислоты являются источниками питательных веществ. Высокомолекулярные фракции сыворотки альфа- и бета-глобулины выполняют защитную функцию, предохраняя клетки от повреждения. Сыворотка способствует прикреплению клеток к субстрату и распластыванию на нем.
Поддерживающая среда, как правило, ростовая среда, в к-рую не входит сыворотка. Созданы специальные поддерживающие среды, включающие желатину или снятое молоко.
Для приготовления рабочих р-ров и сред используют бидистиллированную или деминерализованную с помощью ионообменников воду. Многие первичные культуры хорошо растут на среде, содержащей гидролизат лактальбумина или гемогидролизат и сыворотку. Хорошие результаты дает среда F-10 (Хэма) с 2 — 10% сыворотки. Для выращивания постоянных клеточных линий используют основную среду Игла или среду 199 с добавлением 10% сыворотки, часто используют минимальную среду Игла (МЭМ). При работе с клеточными линиями повышенной питательной потребности рекомендуются среды Мак-Коя, Дульбекко и др. Клетки млекопитающих легко адаптируются к разным средам, однако наблюдаются случаи сложной адаптации и токсичности сред. Как правило, указанные случаи связаны с нарушением стандартных условий в производстве сред или сыворотки.
Контаминация культур клеток микроорганизмами и использование антибиотиков
Несмотря на соблюдение правил стерильности, в лабораториях, работающих с клеточными культурами, бывают случаи бактериальной, микоплазменной, грибковой и вирусной контаминации клеточных культур. Источником контаминации бактериями и микоплазма-ми могут быть исследователи, сыворотка и воздух. Вирусы могут попасть в культуру с клетками, если они взяты из инфицированного организма, а также с трипсином или сывороткой. Основой подбора антибиотиков, обладающих способностью убивать микроорганизмы, являются результаты бактериологического анализа загрязнений и тестирования эффективности действия на них антибиотиков. Наиболее часто для борьбы с бактериальными загрязнениями используют пенициллин, стрептомицин, неомицин, линкамицин, гентамицин, полимиксин, для борьбы с микоплазмами — канамицин, миокризин, ауреомицин и тилозин, а с грибками — фунгизон (амфотерицин В).
Методы приготовления и характеристика культур клеток и тканей
Культуры переживающих тканей
Как правило, для кратковременного поддержания жизни клеток и тканей используют сбалансированные солевые р-ры с определенным осмотическим давлением и pH среды. В качестве источника энергии добавляют глюкозу. Для поддержания переживающих культур наиболее широко пользуются р-рами Ханкса, Эрла, Тирода, Дульбекко и средой Троуэлла—Т8.