Главным требованием, которое характеризует культивирование клеток в отличие от других лабораторных методов, является необходимость поддержания асептических условий. Хотя обычно экономически невыгодно создание и поддержание большой асептической зоны, важно, чтобы все помещения лаборатории, в которой проводятся работы с культурами тканей, были чистыми и не имели сквозного прохода. Появление и внедрение ламинарных боксов (шкафов) значительно облегчило решение этой проблемы и позволило работать с культурами клеток в неспециализированных лабораториях при условии, что размещение оборудования соответствует имеющимся требованиям.
При планировании новых помещений и приобретении оборудования следует учитывать несколько моментов. Будет ли строиться новое здание или уже имеющееся помещение будет переделываться в соответствии с новыми требованиями? В последнем случае вы будете ограничены структурой уже имеющихся помещений, переделывание воздуховодов и вентиляционных систем может оказаться очень Дорогим, изменение структуры помещений может быть связано с удалением несущей нагрузку стены и стать дорогостоящим и сложным мероприятием. При строительстве нового здания имеется больше возможностей для осуществления необходимой планировки и разработки структуры лабораторных помещений, оборудование может быть размещено более эргономично и энергосберегающе, чем при необходимости распределять его в соответствии со структурой помещений. Необходимо учитывать следующие параметры:
1) Вентиляция
а) Равновесие давления . В идеале культуральные помещения лаборатории должны иметь повышенное атмосферное давление относительно других зон, для того чтобы избежать заноса зараженного воздуха извне. Однако использование материала, выделенного из человеческих тканей, требует соблюдения наиболее строгих требований безопасности, которые относят лаборатории, в которых проводятся работы по культуре тканей, к категории I. Соответствующие требования связаны с необходимостью создания отрицательного давления в лабораторных помещениях относительно других зон. Для того чтобы удовлетворить обоим требованиям, предпочтительным является создание буферной зоны с положительным давлением вне культуральных помещений, таких как подготовительная зона или микроскопическая комната или коридор.
б) Ламинарные шкафы . Внимательно отнеситесь к размещению впускных и выходных систем воздуховода. Предпочтительно располагать ламинарный шкаф так, чтобы поток выходящего воздуха направлялся наружу, обеспечивая лучшую циркуляцию и удаление тепла из помещения (300–500 Вт на каждый ламинарный шкаф). Такое расположение облегчит проведение обеззараживания формальдегидом, если это потребуется. Вентиляционные колпаки, обращенные во внешнюю сторону, смогут обеспечить наилучший поток воздуха, требуемый для работы, и необходимо лишь удостовериться, что приходящий воздух из центральной вентиляционной системы или локальных кондиционеров воздуха не смешивается с чистым потоком воздуха из-под колпака ламинарный шкафа. Предпочтительно оставлять ламинарный шкаф постоянно работающим; в случае, если его включают только при работе, следует выждать некоторое время для прохождения воздуха через вентиляционный колпак.
2) Размещение
а) Количество оборудования . Количество оборудования в помещениях культуральной лаборатории зависит от количества работающих людей, от того, сколько времени они будут работать еженедельно и какой тип культуры они будут вести? С учетом этих вопросов следует решать, сколько ламинарных шкафов потребуется (с учетом того, смогут ли работники использовать бокс совместно или каждый из них занимает ламинарный шкаф в течение всего рабочего дня), и необходимо ли обеспечить большое пространство для манипуляций с биореактором, работой с животными тканями и большим количеством различных линий клеток. Ориентировочно, при работе лаборатории, состоящей из 50 человек, выполняющих различную работу, требуется 12 ламинарных шкафов (при их совместном использовании).
б) Пространство . Сколько места требуется для оборудования и всей лаборатории? Самая большая площадь выделяется для манипуляций с культурами, где должны быть размещены ламинарные боксы, счетчики клеток, центрифуги, инкубаторы, микроскопы и некоторые основные реагенты, среды, стеклянная и пластиковая посуда. Вторую по величине площадь следует отдать помещению для мытья, препаративных работ и стерилизации. Третью — комнате для хранения и четвертую — для инкубации. Приблизительное соотношение площади в этих помещениях составляет соответственно 4:2:1:1.
Читайте также: Условные обозначения состава ткани
в) Асептическая зона . Если при работе сотрудников лаборатории будет необходимость постоянной работы в зоне содержания животных, следует обеспечить удобный доступ как к помещениям для культивирования тканей, так и для комнат, в которых осуществляются манипуляции с животными, однако так, чтобы при этом помещения не соприкасались. Окна в помещениях для культивирования могут причинять неудобства, приводя к колебаниям температуры в помещении, становясь причиной ультрафиолетовой денатурации сред и инфицированию микроорганизмами, если помещения не обеззараживаются соответствующим образом.
г) Ламинарные шкафы . Пространство между ламинарными шкафами должно составлять не менее 500 мм для обеспечения свободного доступа к ним и снижения до минимума возможности интерференции воздушных потоков. В это пространство можно поместить передвижную тележку или столик на колесиках, на которых могут располагаться бутыли, флаконы, реактивы, а также лабораторные журналы.
д) Инкубирование . В зависимости от того, какой тип инкубирования используется в работе, выбираются размеры, температура, газовая фаза и расстояние от места расположения инкубатора до рабочего места. Используется ли обычное инкубирование в термостате или термальной комнате без специальной газовой среды либо требуется CO2-атмосфера с повышенным уровнем влажности? Обычно большое количество флаконов или флаконы большого объема после герметизации наилучшим образом инкубируются в термальной комнате, в то время как открытые чашки и планшеты лучше хранить в CO2-инкубаторе с повышенным уровнем влажности.
е) Подготовительная зона . Оборудование для мытья и стерилизации должны быть расположены: 1) близко к асептической зоне, которую они обслуживают, и 2) вплотную к стене, выходящей наружу, для того чтобы обеспечить лучшее удаление тепла из печей и потоков пара из паровых вентилей автоклавов. Обеспечьте хороший обзор и приемлемое пространство, приятное для взгляда персоналу, работающему на стерилизационном, моющем и подготовительном оборудовании. Обычно они выполняют свою работу периодически, в то время как научные сотрудники постоянно смотрят в ламинарный шкаф и не нуждаются в приятной обстановке.
ж) Обслуживание асептической зоны. Выясните, будет ли нужен лифт или достаточно эстакады или пандуса? В последнем случае важно знать, каков необходимый угол наклона и максимальный груз, который можно перевозить вверх по наклону без использования механических устройств?
з) Хранение . Каковы масштабы предполагаемого хранения, и каких размеров пространство может потребоваться для хранения одноразовой пластиковой посуды? Каков предполагаемый объем работ с клеточными линиями, обусловливающий требования к помещению для сосудов с жидким азотом?
3) Реконструирование. Если предполагается переоборудование существовавших прежде помещений, учитывайте определенные структурные ограничения и тщательно выбирайте местоположение, избегая тесноты и трудновыполнимых проектов использования комнат, в которых маневренность ограничена.
4) Доступ. Удостоверьтесь, что обе створки дверей открываются достаточно широко, что высота дверей и потолков достаточна для обеспечения установки такого оборудования, как инкубаторы, автоклавы. При этом помните, что ламинарный шкаф требует дополнительного пространства над верхней поверхностью для установки воздуховода. Удостоверьтесь, что дверной проход и пространство между оборудованием обеспечивает доступ для его технического обслуживания.
5) Карантин. Какой карантин требуется для вашей лаборатории? Вновь поступившие клеточные линии и биопсийные образцы должны быть исследованы на предмет контаминации микоплазмами до того, как они будут переданы в те комнаты, где проводятся работы с основными линиями. Некоторые линии клеток человека и приматов, а также клеточные линии, потенциально представляющие собой биологическую опасность, требуют изоляции.
Изучение этих вопросов позволит вам решить, каких размеров помещения вам требуются. Каков предполагаемый тип устройства лаборатории: одна или две маленьких комнаты либо комплекс помещений, включающий моечную, стерилизационную, одну или две асептических зоны, инкубационную комнату, темную комнату для флюоресцентной микроскопии и микрофотографии, холодильную комнату и хранилище ? При сравнении с традиционно расположенными в ряд комнатами и единственным ламинарный шкафом в изолированной комнате лучшим вариантом является одно специально спланированное для культуральных работ помещение со смежной подготовительной зоной и рядом меньших комнат с общей подготовительной зоной. Отдельное помещение обеспечивает лучшую защиту от заражения, позволяет хранить клеточные ростковые линии отдельно от реактивов и стеклянной посуды и в любом случае потребуется при работе с клетками человека или приматов.
Читайте также: Камуфляжная ткань в белгороде
Небольшая лаборатория культивирования тканей. Возможная планировка простой автономной лаборатории культивирования тканей для 2–3 сотрудников. Темным цветом выделены области, занимаемые перемещаемым оборудованием. Области светлого цвета — закрепленная или перемещаемая мебель.
Лаборатория культивирования тканей средних размеров. Планировка лаборатории для 5–6 сотрудников, с моечной и подготовительной зоной, расположенными в другом помещении. Темным цветом выделены области, занимаемые перемещаемым оборудованием. Области светлого цвета — закрепленная или перемещаемая мебель.
Лаборатория культивирования тканей с прилежащими препаративными комнатами. Возможная планировка лаборатории культивирования тканей средних размеров, но с прилежащими подготовительной зоной, микроскопической комнатой и термостатируемой комнатой на 37 °С.
Большая лаборатория культивирования тканей. Предлагаемая планировка подходит для 20–30 сотрудников. Рядом расположены моечная, стерилизационная и препаративная зоны 37 °С. Темным цветом выделены области, занимаемые оборудованием. Области светлого цвета — закрепленная или перемещаемая мебель.
Оснащение культуральной лаборатории
Лабораторные термостаты
К термостатам, используемым в лаборатории выращивания клеток предъявляется ряд особых требований. Они должны обеспечивать высокую стабильность поддержания температуры, иметь минимальный градиент температуры по объему, обладать системой быстрого набора температуры после кратковременного открывания, внутренний объем термостата должен изготавливаться из биологически инертных материалов не влияющих на жизнедеятельность клеток. Материалы, используемые для внутренних и внешних поверностей должны позволять деконтаминацию водными растворами спирта и стерилизацию ультрафиолетовым излучением.
Термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные. В жидкостных в качестве теплоносителем является дистиллированная вода, в ванну с которой и помещаются емкости с питательной средой. Плюсом в таких термостатах является малое значение градиента температуры внутри камеры, минусом – большая тепловая инерция и, вследствие последней, большое время охлаждения и вхождения в рабочий режим. В воздушных термостатах теплоносителем является воздух.
СО2-инкубаторы
Для сохранения постоянного pH в питательной среде и предотвращения ее испарения в период инкубации клеток разработаны инкубаторы, отличающиеся от термостатов тем, что они имеют систему поддержания состава газовой среды и высокой влажности внутри рабочей камеры. В инкубаторе создается повышенная концентрация кислорода и углекислого газа, величина которой зависит от условий культивирования и поддерживается постоянной. Заданный состав газовой смеси внутри камеры при помощи поступления газа в поток очищенного внешнего воздуха, который подается во внутренний объем инкубатора. В газо-проточных инкубаторах подача газовой смеси происходит непрерывно, а точный состав и процентное содержание достигается при помощи изменения скорости потока.
Аэраторы
Для снабжения культуральной среды кислородом — используют воздух, либо воздух, обогащенный кислородом, реже — чистый кислород. Анаэробные процессы, зависят от газообразных субстратов и требуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности. Аэраторы – основной пример функционирующих систем газоснабжения и газоотвода.
Лабораторные шейкеры
Большое значение в оснащении лаборатории культивирования клеток имеют приборы, которые могут обеспечить принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них клеточными культурами, обеспечивая улучшенный газообмен и тем самым повышая эффективность культивирования. Большинство моделей лабораторных встряхивателей позволяет производить перемешивание в одном режиме – вращательном или возвратно-поступательном. Роллерные установки – применяются для выращивания клеток в цилиндрических сосудах из боросиликатного стекла с небольшим количеством питательной среды, вращающихся в горизонтальном положении со скоростью 8 оборотов/мин, обеспечивая постоянное перемешивание и интенсивный рост клеток. Для повышения эффективности культивирования установки обеспечивают системой, дающей возможность заменять питательную среду и удалять супернатант без остановки вращения. Для этого сосуды снабжаются специальными перфузионными пробками, в которых центральная часть вращается независимо от периферийной. В эту часть пробки вводятся трубки для смены питательной среды, удаления супернатанта и введения инокулята. В состав данной системы также входят перистальтические насосы и блок автоматики, регулирующий их работу.
Читайте также: Шитые изделия из ткани
Лабораторные ферментеры (биореакторы)
Это комплексы приборов и аппаратов для массового суспензионного или глубинного культивирования клеточных и бактериальных культур. В лабораторной практике ферментеры применяются для ведения научно- исследовательских работ или отработки технологии массового культивирования.
В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно-восстановительным потенциалом и другими параметрами.
В лабораторной практике наиболее часто применяются ферментеры с емкостью сосудов от 1 до 20 л, для отработки технологий – от 30 до 400 л. Во всех случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема сосуда.
Части ферментеров, контактирующие с питательной средой изготавливаются из биологически пассивных, химически стойких материалов, позволяющих производить стерилизацию насыщенным водяным паром (качественная нержавеющая сталь, фторопласт, боросиликатное стекло, силиконовая резина).
Сосуды ферментеров имеют цилиндрическую (реже коническую) форму. В них размещены датчики температуры, рН, кислорода, а также система для аэрации питательной среды, производимой барботированием газов (подача газов снизу через барботер) через питательную среду или сочетанием продувки газов с механическим перемешиванием среды. При использовании механических мешалок их соединение с приводным двигателем производится при помощи магнитных муфт, что снижает риск загрязнения питательной среды. Помимо механического и пневматического перемешивания используются также системы циркуляционного (гидродинамического) перемешивания направленным током жидкости по замкнутому контуру при помощи насосов.
Культуральная посуда из стекла
Хотя в последние годы широко применяется одноразовая пластиковая посуда, посуда из стекла не утратила своего значения благодаря ряду преимуществ: хорошие адгезионные свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток; многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.
Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов – многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа. Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам, за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того, стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.
Существует также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей.
Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и бактериологически.
Культуральный лабораторный пластик
Пластиковая лабораторная посуда в отдельных случаях более пригодна, чем стеклянная, из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, так как она выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими или химическими способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях: для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.
Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат, т. е. посуда, обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом