Эффективность использования метода фиксации при заборе органов и тканей для электронного микроскопического исследования
Publication in electronic media: 3.06.2010 under http://journal.forens-lit.ru/node/156
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Новосибирск 2009 Вып. 15
С. В. Савченко, И. В. Степанищев, Е. В. Кузнецов
Электронная микроскопия является методом морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющих изучить структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях. После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа, электронная микроскопия прошла большой путь развития и позволила перейти на качественно новый уровень изучения материи. Электронная микроскопия нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинской генетике, иммунологии. Благодаря электронной микроскопии была раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток. Электронная микроскопия позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в том числе на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клинической симптоматики. Исследования строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются возможностями разрешающей способности электронных микроскопов. Использование электронной микроскопии в сочетании с другими методами, например, с авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими, обусловило появление электронной авторадиографии, электронной гистохимии, иммунной электронной микроскопии (электронной иммуноморфологии) и других. Это позволило значительно расширить информацию, получаемую с помощью электронной микроскопии, наблюдать структурное выражение течения биохимических процессов в клетке, что, в свою очередь, подтвердило один из основных методологических принципов современной биологии — диалектическое единство структуры и функции.
Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов изучения, от которой в значительной мере зависят возможности метода. В соответствии с целями исследования методика такой подготовки может быть различной. Однако непременным условием для любых электронно-микроскопических исследований является фиксация тканей с максимальным сохранением их прижизненного строения. Существуют два принципиально различных способа фиксации: химический и физический, каждый из которых имеет различные варианты. В электронной микроскопии, как правило, используют химическую фиксацию с помощью фиксаторов, обладающих стабилизирующими свойствами.
Универсального для любых тканей фиксатора не существует, поэтому в зависимости от задачи конкретного исследования применяют соответствующие фиксаторы. При выборе химических фиксаторов исходят из их способности коагулировать белки (спирты, ацетон, некоторые кислоты, соли тяжелых металлов и др.) либо стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовоксильный калий и др). Существуют оптимальные сроки взятия различных тканей и клеток, обычно исчисляемые минутами. Чем раньше ткань помешают в фиксатор, тем более достовернее данные получают о прижизненной структуре клеток. Фиксаторы обладают различной скоростью проникновения в ткань: от этого зависит возможная величина объекта исследования.
В настоящее, время электронная микроскопия приобретает огромную значимость как в практической деятельности, так и в научной. В виду того, что электронные микроскопы во многих бюро судебной медицины отсутствуют, и материал приходиться в кратчайшие сроки фиксировать и транспортировать в лабораторий электронной микроскопии, мы посчитали целесообразным провести сравнение двух фиксирующих растворов. Для сравнения мы взяли осмиевый фиксатор и фиксатор, содержащий 4% параформ и 0,2% глутаральдегид на фосфатном буфере с рН 7,4. Существенной разницы при изучении и органов и тканей после фиксации в этих растворах мы не наблюдали, но некоторые отличия по составу и качеству имеются. Так, четырехокись осмия и глутаровый альдегид проникают в ткань на 0,1-0,5 мм примерно за 1 — 1,5 часа, но для некоторых тканей оно может быть увеличено до 4 часов или до 20-30 мин. В отдельных случаях допускается в течение одних суток. Наибольшее распространение получила фиксация материала в глутаровом альдегиде. Глутаровый альдегид достаточно хорошо фиксирует белки, но при этом стабилизация липидов недостаточна. По сравнению с широко применяемым последние годы другим альдегидным фиксатором — глутаральдегидом — параформальдегид обладает рядом несомненных преимуществ. Главное из них — большая скорость проникновения в ткани, что очень важно для предотвращения аутолитических изменений в образце, развивающихся уже во время фиксации. При глутараль-дегидной фиксации удовлетворительное состояние ультраструктурных компонентов клеток прослеживается на глубину не более 1мм, в то время как параформальдегидный фиксатор сохраняет для электронно-микроскопического исследования всю ткань образца в объеме 3,5 см2 (Winbom, Seeling 1970). Кроме того, фиксирующий раствор на основе параформа существенно увеличивает срок хранения тканей, — как показали исследования Целлариуса и соавт, (1980), структура клеточных органелл полностью сохраняется в течение 3-4 месяцев. Таким образом, фиксирующий раствор на основе глутарового альдегида и параформа позволяет существенно увеличить срок сохранения в неизмененном виде органов и тканей, что существенно влияет на более эффективное исследование и может использоваться при необходимости в экспертной практике.
Фиксация гистологического и биопсийного материала
библиографическое описание:
Фиксация гистологического и биопсийного материала — .
Читайте также: Строение стенки капилляра соединительная ткань
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФИКСАЦИИ
Фиксация обеспечивает стабилизацию тканевых структур и их уплотнение, прекращает аутолиз, стабилизирует локализацию структур. Механизм действия фиксаторов основан на коагуляции белков и стабилизации липидов. Для достижения этой цели возможны 3 подхода:
· Альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)
· кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)
Мы рассмотрим третий вариант. Прижизненно взятая ткань должна быть зафиксирована на протяжении (не больше)30-90 минут, температура фиксатора – 0-4С
Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, поэтому фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Увеличение температуры фиксатора ускоряет процесс, но вызывает еще большие изменения в тканях. Слишком продолжительная фиксация приводит к значительному уплотнению материала, что в дальнейшем затрудняет его обработку. Для каждого конкретного вида исследования подбирают наиболее приемлемый фиксатор.
Полноценная фиксация материала обеспечивается при соблюдении ряда требований.
1. После вырезки кусочка ткани его немедленно погружают в фиксатор.
2. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10—20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора.
3. В том случае, если цвет фиксатора изменяется после погружения в него кусочков ткани, фиксатор необходимо немедленно сменить.
4. Недопустимо повторное использование фиксаторов.
5. Для каждого фиксатора следует соблюдать установленное время фиксации. Длительное пребывание материала возможно лишь в некоторых фиксаторах, например 10 % нейтральном формалине, жидкости Боуэна.
Для фиксации лучше использовать емкости с широким горлом, чтобы не возникло проблем с извлечением фиксированного материала. Равномерность фиксации некоторых рыхлых тканей, например легочной, достигается помещением их на дно банки, а поверх них — прокладки из слоя марли или ваты.
Чаще материал фиксируют при комнатной температуре, но для некоторых видов исследования (гистохимических, электронно-микроскопических и др.) необходимо проводить фиксацию при 4°С. Материал срочных биопсий фиксируют при повышенной температуре фиксатора.
В экспериментальных исследованиях применяют также прижизненный перфузионный метод фиксации и его сочетание с обычным погружением в фиксирующую жидкость.
ПРОСТЫЕ ФИКСИРУЮЩИЕ ЖИДКОСТИ
· альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)
· кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)
Можно хранить месяцами, надо всего лишь контролировать рН.
Формалин. Основным, широко применяемым фиксатором служит формалин, представляющий собой 40% раствор формальдегида. Формальдегид – это газ, растворимый в воде до концентрации40% по массе, каким он и поступает в продажу под названием « Формалин». В гистологической практике используют 10% раствор формалина, что соответствует 4% формальдегиду.
.Из формальдегида готовят нейтральный (забуференный до рН 7,0) 10—12% формалин. Для этого в банку с 40% формалином засыпают карбонат кальция или магния либо смесь этих солей — доломит из расчета 100 г на 1 л формалина. Для получения 10 % нейтрального формалина через 24 ч к 1 части 40% нейтрального формалина добавляют 9 частей водопроводной воды. Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С
В водных незабуференных растворах Ф-д со временем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые ухудшают качество фиксации, как и выпадение белого осадка параформальдегида. В результате точную Со Ф-да в растворах формалина установить не представляется возможным. Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70—80° С (в вытяжном шкафу!), и использовать для фиксации. Очищенный коммерческий параформальдегид применяют как составную часть многих фиксаторов для гистохимических и электронно-микроскопических исследований.
Фиксатор может показывать себя не с лучшей стороны из-за примесей, в основном метанола(до16%).Для этого существуют методы приготовления свободного от метанола
· 2гр параформальдегида + 50мл 0,1М фосфатного буфера(рН 7,4-7,6)=нагревают до 70с до просветления раствора, помешивают, охлаждают и фильтруют. Его рН 7,3-7,5.
· готовят 40% параформальдегид(40гр порошка формальдегида + 100мл дистиллированной воды при нагревании до 65С, перемешивая.
+ несколько капель 40%гидроксида натрия до просветления раствора.
· Нейтральный 40% формалин 100 мл
· Водопроводная вода 900 мл
Продолжительность фиксации 48 ч при 20 ° С с последующей промывкой в проточной воде в течение 6—12 ч.
Универсальным фиксатором, пригодным для гистологических и большинства гистохимических исследований, является нейтральный формалин по Лилли) .
1. А. 100 мл 40 % формалина + 900 мл дистиллированной воды.
2. Б. 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата (однозамещенного фосфата натрия).
3. В. 6,5 г гидроортофосфата натрия (двузамещенного фосфата натрия).
Фиксатор Лилли для кислых гликозаминогликанов
2. 40% раствор формальдегида 10мл
продолжительность фиксации 24 часа при комнатной Т( при 4С – 2-3дня, 10-14 дней при –25С).
Фиксатор Жандра для гликогена
1. Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте 85 частей
2. Раствор формальдегида 40% 10 частей
3. Ледяная уксусная кислота 5 частей