Метод культивирования тканей это

КУЛЬТУ́РА КЛЕ́ТОК И ТКА́НЕЙ, клет­ки, ку­соч­ки тка­ней или за­чат­ков ор­га­нов, вы­ра­щен­ные вне ор­га­низ­ма (in vitro). В ос­но­ве вы­ра­щи­ва­ния кле­ток и тка­ней ле­жит стро­гое со­блю­де­ние сте­риль­но­сти и ис­поль­зо­ва­ние спец. пи­тат. сред, обес­пе­чи­ваю­щих под­дер­жа­ние жиз­не­дея­тель­но­сти куль­ти­ви­руе­мых кле­ток и мак­сималь­но сход­ных со сре­дой, с ко­то­рой клет­ки взаи­мо­дей­ст­ву­ют в ор­га­низ­ме. Ме­тод по­лу­че­ния К. к. и т. яв­ля­ет­ся од­ним из важ­ней­ших в экс­пе­рим. био­ло­гии. К. к. и т. мо­гут быть за­мо­ро­же­ны и со­хра­нять­ся дли­тель­ное вре­мя при темп-ре жид­ко­го азо­та (–196 °C). Ос­но­во­по­ла­гаю­щий экс­пе­ри­мент по куль­ти­ви­ро­ва­нию кле­ток жи­вот­ных про­вёл амер. учё­ный Р. Гар­ри­сон в 1907, по­мес­тив ку­со­чек за­чат­ка нерв­ной сис­те­мы за­ро­ды­ша ля­гуш­ки в сгу­сток лим­фы. Клет­ки за­чат­ка ос­та­ва­лись жи­вы­ми неск. не­дель, из них вы­рас­та­ли нерв­ные во­лок­на. Со вре­ме­нем ме­тод был усо­вер­шен­ст­во­ван А. Кар­ре­лем (Фран­ция), М. Бер­ро­узом (США), А. А. Мак­си­мо­вым (Рос­сия) и др. учё­ны­ми, ис­поль­зо­вав­ши­ми в ка­че­ст­ве пи­тат. сре­ды плаз­му кро­ви и вы­тяж­ку из тка­ней за­ро­ды­ша. В даль­ней­шем ус­пе­хи в по­лу­че­нии К. к. и т. бы­ли свя­за­ны с раз­ра­бот­кой сред оп­ре­де­лён­но­го хи­мич. со­ста­ва для куль­ти­ви­ро­ва­ния разл. ти­пов кле­ток. Обыч­но они со­дер­жат со­ли, ами­но­кис­ло­ты, ви­та­ми­ны, глю­ко­зу, фак­то­ры рос­та, ан­ти­био­ти­ки, пре­ду­пре­ж­даю­щие за­ра­же­ние куль­ту­ры бак­те­рия­ми и мик­ро­ско­пич. гри­ба­ми. На­ча­ло соз­да­нию ме­то­да К. к. и т. у рас­те­ний (на ку­соч­ке фло­эмы мор­ко­ви) по­ло­же­но Ф. Стю­ар­дом (США) в 1958.

Культура клеток

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор, содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa.

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов, как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы.

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др. Факторы роста, используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста.

Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно изменённых таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трёхмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Эта система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии). С целью обеспечения необходимых физических условий для культивирования адгезивных культур и заселения объёма внеклеточного матрикса тканеинженерных конструкций используются системы динамического культивирования на основе роторных и вихревых биореакторов, биореакторов с непосредственным на скаффолд: компрессионных биореакторов, биореакторов с механическим натяжением и гидростатическим давлением, специальных биореакторов для электростимуляции клеток и тканей, а также комбинированных биореакторов.

Перекрёстное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

• Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
• Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
• Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
• По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH.

Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассирование клеток

Пассирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, её обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

Трансфекция и трансдукция

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путём трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла. Этот метод называется трансдукция.

Линии клеток человека

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики, поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета», согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия.

Гибридома

Гибридома — это линия клеток, полученная в результате слияния нормальных лимфоцитов с «бессмертными» раковыми клетками. Используется для получения моноклональных антител. Лейкоциты, выделенные из селезёнки или крови иммунизированных животных, производят антитела с необходимой специфичностью, но как у любой первичной культуры, их способность к пролиферации ограничена пределом Хейфлика. Для иммортализации их искусственно сливают с «бессмертной» линией клеток миеломы, в результате чего происходит рекомбинация признаков. После этого линию клонируют и отбирают клоны, способные одновременно к неограниченной пролиферации и производящие антитела против избранного антигена.

Использование клеточных культур

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.

Бактериальные, дрожжевые культуры

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Виды клеточных линий

Краткий перечень клеточных линий

Приведённый здесь список наиболее распространённых клеточных линий не является полным и исчерпывающим.

Читайте также: Перья из ткани для платья

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Культуры клеток и тканей — клетки, кусочки ткани, зачатки органа, растущие или сохраняющие жизнеспособность вне организма «в пробирке» (in vitro).

В клеточных культурах клетки не организованы в ткань, тогда как для тканевых и органных культур необходимым условием является сохранение тканевой и органотипической дифференцировки и (или) функции.

История

Первые попытки культивирования клеток in vitro были сделаны в 19 в. В 1885 г. Ру (W. Roux) удалось в течение нескольких дней поддерживать развитие медуллярной пластинки куриного эмбриона в солевом растворе, а в 1887 г. Арнольду (J. Arnold) — наблюдать миграцию лейкоцитов лягушки. Однако в это время не было реальной базы для создания условий, способных поддерживать жизнедеятельность клеток и тканей in vitro. Подлинным началом культивирования клеток вне организма считаются опыты Гаррисона (R. G. Harrison), который в 1907 г. эксплантировал в сгустках лимфы лягушки кусочки медуллярной трубки эмбриона лягушки. Через несколько недель культивирования у этих клеток вырастали аксоны. Метод культивирования в сгустке лимфы, позднее в сгустке плазмы, с добавлением эмбриональных экстрактов стал одним из общепринятых и используется до наст. времени.

Развитию методов культивирования во многом способствовали исследования А. Карреля, который показал возможность длительного культивирования клеток в условиях строгой асептики. Флаконы Карреля являются необходимым элементом оборудования современных культуральных лабораторий. Большой вклад в разработку методов культивирования клеток внесли отечественные ученые А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Г. К. Хрущов, Н. Г. Хлопин и А. Д. Тимофеевский. Группа исследователей из Национального ракового ин-та (США) под руководством Эрла (W. Earle) разработала методы культивирования клеток на стекле, получила культуры одиночных клеток и клеток в суспензии. Результатом работ Фишера (D. Fischer, 1948), Мортона, Паркера, Моргана (H. J. Morton, R. Parker, J. F. Morgan, 1950), Игла (H. Eagle, 1955) явилось создание современных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих in vitro.

После того как в 50-х гг. 20 в. была показана возможность размножения вируса полиомиелита на ряде клеточных культур и возникла практическая заинтересованность в разработке методов Культур клеток и тканей, для получения вакцин эта область исследований начала стремительно развиваться. Создание специальных сред культивирования позволило получить культуры клеток из разных органов и тканей многих видов млекопитающих и человека (см. таблицу). Были выведены специальные суспензионные культуры, приближающиеся по своим способностям давать большую биомассу к культурам микроорганизмов. Суспензионные культуры нашли применение в вирусологии для накопления вирусов энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, везикулярного стоматита, осповакцины, гриппа, болезни Ньюкасла, а также в производстве биол, активных препаратов: ферментов, антител, вакцин. Различные Культуры клеток и тканей применяются с диагностическими целями для культивирования вирусов (см.).

Обнаружение явления спонтанной злокачественной трансформации клеток in vitro, а также трансформации с помощью ряда вирусов и химических канцерогенов явилось экспериментальной основой изучения механизмов канцерогенеза (см. Онкогенез). Разработаны методы слияния клеток для образования гибридов соматических клеток (см. Генетика соматических клеток), которые используются для картирования генов млекопитающих. Совершенствование методов культивирования клеток явилось основой развития цитогенетики человека, идентификации синдромов, связанных с нарушением числа и структуры хромосом (синдромы Дауна, Шерешевского — Тернера, Клайнфелтера, Эдвардса, Патау, кошачьего крика и т. д.). Успехи в области цитогенетики и картирования генов связаны с разработкой принципиально новых методов дифференциальной окраски хромосом. Совершенствование методов культивирования амниотических клеток плода и техники амниоцентеза (см.) позволило подойти к решению основных вопросов медико-генетического консультирования — пренатальной диагностике хромосомных заболеваний и наследственных биохимических нарушений обмена.

Культура клеток является одной из экспериментальных моделей генной инженерии (см.).

Кроме того, методы Культур клеток и тканей применяются в гистологии для изучения морфогенеза и функциональной анатомии клеток и тканей, в иммунологии для культивирования иммунокомпетентных клеток (см.) и изучения их функций в гематологии для культивирования клеток костного мозга и периферической крови.

Основные условия культивирования клеток и тканей

Для производства, получения и хранения Культур клеток и тканей необходимы стерильные помещения, широкий ассортимент солевых р-ров, питательных сред и антибиотиков. Кроме того, требуется следующее оборудование: стерильные боксы с ультрафиолетовым облучением и установками с ламинарным потоком стерильного воздуха; микроскопы — инвертированные для просмотра культур и обычные для анализа препаратов; центрифуги; термостаты с водяным обогревом и с контролируемой подачей CO₂; рефрижераторы для хранения сред, антибиотиков, сывороток, ферментов; установки для замораживания и емкости с жидким азотом для хранения клеточных линий; магнитные мешалки; резиновые пробки, трубки, наконечники; посуда из нейтрального стекла типа «Пирекс». Посуду кипятят в специальных детергентах, многократно прополаскивают дист, водой, стерилизуют сухим жаром или автоклавированием. Используемые биол, жидкости стерилизуют фильтрованием под давлением через мембранные фильтры с размером пор 220 нм после предфильтрования через глубинные фильтры (из асбеста или стеклянного волокна).

Кроме традиционного оборудования, современная культуральная лаборатория использует микрополичашки (пластиковые панели с углублениями) с набором автоматических микропипеток и микродозиметров, роллерные и суспензионные установки. Желательно применение пластиковой посуды одноразового пользования.

При поддержании жизнедеятельности клеток in vitro важное значение имеют осмотическое давление, концентрация ионов водорода (pH) и ряд других неорганических ионов, состав газовой среды, температура. Осмотическое давление в клетках млекопитающих составляет при t° 38° ок. 7,6 атм, и его необходимо поддерживать в культуральной среде. Осмотическое давление в питательных средах создается гл. обр. концентрацией хлорида натрия. Определенную роль играют другие неорганические ионы и глюкоза. Высокомолекулярные соединения мало влияют на величину осмотического давления.

Оптимальная концентрация ионов водорода, т. е. pH среды, для роста большинства клеток близка к нейтральным значениям. Для роста диплоидных фибробластов необходимо поддерживать pH в пределах 7,2 — 7,4. Большинство клеток, особенно постоянные клеточные линии, т. е. пересеваемые линии, выдерживают pH от 6,8 до 7,6. Величина pH в культуральной среде зависит от соотношения Гидрокарбонат натрия является частью сбалансированного солевого р-ра питательной среды, CO₂ образуется в результате дыхания клеток. При культивировании в закрытых сосудах, в случае низкой начальной концентрации клеток, уровень pH сдвигается резко в щелочную сторону, что сказывается на жизнеспособности клеток. Этого можно избежать, вдувая во флаконы CO₂ сразу после посева. Предпочтительно культивирование в открытых сосудах, в термостатах с контролируемой подачей CO₂ (5 — 10% CO₂ и 95—90% воздуха). Производятся среды с большой буферной емкостью на основе фосфатного буфера, Tris или HEPES (оксиметил-аминометан и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-этансульфоновая к-та).

Для постоянного контроля за уровнем pH в состав ростовых сред вводят индикатор pH, в качестве к-рого часто применяют фенол-красный или фенол-сульфонталеин. Эти вещества не токсичны для клеток в концентрации до 0,002 г/л.

Для поддержания жизнедеятельности клеток и тканей in vitro необходимы ионы натрия, кальция, магния, железа, которые не только участвуют в поддержании постоянства осмотического давления, но необходимы для функционирования ряда клеточных ферментов. Существенна также и достаточная концентрация кислорода, к-рая в закрытых сосудах обеспечивается определенными отношениями объема воздуха и объема среды.

Питательные среды

Культивирование Культур клеток и тканей обеспечивается в первую очередь сложным сбалансированным набором ряда питательных компонентов среды. Среды делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают рост клеток и тканей, тогда как поддерживающие предназначены гл. обр. для сохранения жизнеспособности и функц, активности К. к. и т. в течение продолжительного времени. Среди ростовых сред, в свою очередь, можно выделить естественные питательные среды — продукты частичной обработки естественных высокопитательных веществ: инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота, лошади, человека, эмбрионов телят; гидролизат лактальбумина — продукт ферментативного гидролиза белков молока; аминопептид — ферментативный гидролизат белка; гемогидролизат — продукт ферментативного расщепления крови крупного рогатого скота и человека; эмбриональный куриный экстракт. Существенным недостатком всех естественных (нативных) питательных сред является их нестандартность и сложность стерилизации. Синтетические питательные среды готовят из определенных хим. веществ без включения естественных продуктов.

На синтетических средах без добавления сыворотки или других естественных питательных веществ растут не все клетки. Наиболее широко применяются среда 199, среда Игла и ее модификации, среда F-10 и F-12 (Хэма), CMRL-1066, NCTC-109, среда Мак-Коя и др. В состав синтетических питательных сред входят, как правило, незаменимые аминокислоты в L-форме (аргинин, гистидин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин). Необходимы также цистеин и тирозин. У трансформированных клеток резко повышена потребность в глутамине. Для улучшения роста единичных клеток необходимо добавлять серин. Комплекс витаминов включает витамины группы В (парааминобензойная к-та, биотин, холин, фолиевая к-та, никотиновая к-та, пантотеновая к-та, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, инозитол). Некоторые среды (среда 199, NCTC-109) содержат коферменты и жирорастворимые витамины. Важную группу компонентов составляют восстановители (аскорбиновая к-та, L-цистеин, глутатион) и предшественники нуклеиновых к-т. Источником углеводов служат глюкоза, 2-дезокси-D-рибоза, D-рибоза. Состав сред постоянно совершенствуется. Добавление сыворотки к синтетическим средам улучшает рост клеток. Широкое применение имеют синтетические среды с добавлением 5—20% сыворотки. Для клеточных культур используют сыворотку различного происхождения. H аи лучшими ростовыми свойствами обладает эмбриональная сыворотка. Полностью роль всех компонентов сыворотки не выяснена. Пептиды, липиды, аминокислоты являются источниками питательных веществ. Высокомолекулярные фракции сыворотки альфа- и бета-глобулины выполняют защитную функцию, предохраняя клетки от повреждения. Сыворотка способствует прикреплению клеток к субстрату и распластыванию на нем.

Поддерживающая среда, как правило, ростовая среда, в к-рую не входит сыворотка. Созданы специальные поддерживающие среды, включающие желатину или снятое молоко.

Для приготовления рабочих р-ров и сред используют бидистиллированную или деминерализованную с помощью ионообменников воду. Многие первичные культуры хорошо растут на среде, содержащей гидролизат лактальбумина или гемогидролизат и сыворотку. Хорошие результаты дает среда F-10 (Хэма) с 2 — 10% сыворотки. Для выращивания постоянных клеточных линий используют основную среду Игла или среду 199 с добавлением 10% сыворотки, часто используют минимальную среду Игла (МЭМ). При работе с клеточными линиями повышенной питательной потребности рекомендуются среды Мак-Коя, Дульбекко и др. Клетки млекопитающих легко адаптируются к разным средам, однако наблюдаются случаи сложной адаптации и токсичности сред. Как правило, указанные случаи связаны с нарушением стандартных условий в производстве сред или сыворотки.

Контаминация культур клеток микроорганизмами и использование антибиотиков

Несмотря на соблюдение правил стерильности, в лабораториях, работающих с клеточными культурами, бывают случаи бактериальной, микоплазменной, грибковой и вирусной контаминации клеточных культур. Источником контаминации бактериями и микоплазма-ми могут быть исследователи, сыворотка и воздух. Вирусы могут попасть в культуру с клетками, если они взяты из инфицированного организма, а также с трипсином или сывороткой. Основой подбора антибиотиков, обладающих способностью убивать микроорганизмы, являются результаты бактериологического анализа загрязнений и тестирования эффективности действия на них антибиотиков. Наиболее часто для борьбы с бактериальными загрязнениями используют пенициллин, стрептомицин, неомицин, линкамицин, гентамицин, полимиксин, для борьбы с микоплазмами — канамицин, миокризин, ауреомицин и тилозин, а с грибками — фунгизон (амфотерицин В).

Методы приготовления и характеристика культур клеток и тканей

Культуры переживающих тканей

Как правило, для кратковременного поддержания жизни клеток и тканей используют сбалансированные солевые р-ры с определенным осмотическим давлением и pH среды. В качестве источника энергии добавляют глюкозу. Для поддержания переживающих культур наиболее широко пользуются р-рами Ханкса, Эрла, Тирода, Дульбекко и средой Троуэлла—Т8.

Культуры растущих тканей

Получение культур тканей основано на первичной эксплантации растущих тканей, изолированных непосредственно из организма. К основной группе методов относятся те, в которых используются предметные стекла с лунками, флаконы Карреля, а также пробирки и перфузионные камеры.

Эксплантацию небольших кусочков ткани для морфологических исследований в сочетании с микрокиносъемкой проводят на предметном стекле, к-рое потом накрывают специальным покровным стеклом и заклеивают. Более известны модификации этого метода: эксплантация на одинарное покровное стекло со сгустком плазмы, к-рое помещают над лункой предметного стекла (Гаррисон); метод Максимова с двойным покровным стеклом; метод культивирования в капле среды на покровном стекле [Льюис и Льюис (W. Lewis, М. Lewis)]. Методы культивирования К. к. и т. на стеклах удобны для кратковременных исследований, т. к. длительное ведение связано с необходимостью сложной замены питательной среды. Культуры на покровных стеклах можно пересевать. Для этого эксплантат рассекают на кусочки и переносят на новые покровные стекла. Каждый кусочек обрабатывают затем, как новый эксплантат.

Читайте также: Стулья с металлическим каркасом из ткани

Более длительное культивирование эксплантатов возможно в сгустке плазмы во флаконах Карреля [Эрл (W. R. Earle)]. Метод используют при формировании линий и штаммов клеток. Для этой цели во флаконы Карреля помещают каплю смеси плазмы и эмбрионального экстракта, которую распределяют по дну флакона, помещают кусочки ткани в плазму и дают образоваться сгустку, а затем приливают питательную среду. Ткань можно переносить из сосуда в сосуд, нарезая кусочками или трипсинизируя ткань и сгусток, как в случае получения первично трипсинизированных культур.

Культивирование в сгустке плазмы в неподвижной или вращающейся пробирке, метод «летающих стекол» близки к культивированию во флаконах Карреля. Эксплантаты можно укреплять на стенках пробирки или на узких покровных стеклах, которые помещают в пробирки с питательной средой. Пробирки можно поместить в наклонном положении во вращающийся барабан для лучшего контакта эксплантата со средой. Метод «летающих стекол» получил широкое применение для исследования большого числа эксплантатов. Вместо сгустка плазмы можно использовать подложки: коллагеновые, лавсановые (для дальнейших электронно-микроскопических исследований), пластиковые, агаровые, из пористой бумаги, ацетатцеллюлозы. Можно эксплантировать ткань и непосредственно на стекле, в частности при эксплантации кусочков кожи, макрофагов и других клеток, способных прикрепляться к стеклу. Задачей метода органных культур является создание условий культивирования, максимально близких к условиям in vivo. Основной принцип метода состоит в том, что эксплантат помещают на границе двух фаз —питательная среда/газовая смесь. Существует несколько вариантов поддержания органных культур: культивирование на поверхности плазменного сгустка, на часовом стекле в чашке Петри [Фелл (Н. Fell)] — классическая техника, являющаяся основой современных методов; культивирование в мягком (полутвердом) агаре, насыщенном питательной средой, эмбриональным экстрактом, сывороткой; культивирование на металлических (тантал или нержавеющая сталь) сетках, покрытых агаром [Троуэлл (О. Trowell)], нижняя поверхность которых касается жидкой питательной среды; культивирование на «плоту» из ацетатцеллюлозы или папиросной бумаги [Чан (J. Chan), 1954; Рихтер (Richter), 1955]; культивирование на миллипоровых фильтрах [Гробштейн (С. Grobstein), 1955]. Для создания оптимальных условий культуры инкубируют в газовой смеси, состоящей из 95% O₂ и 5% CO₂ с ежедневной сменой питательной среды. Широкое распространение в технике тканевых и органных культур имеют перфузионные камеры, позволяющие прижизненно изучать процессы развития.

Первичные культуры, диплоидные штаммы и клеточные линии

Независимо от отношения к субстрату следует различать первичные культуры и клеточные линии. Первичные культуры получают непосредственно из нормальных или опухолевых тканей человека или животных методом эксплантации или трипсинизации тканей, обладающих ростовыми потенциями (эмбриональные: костно-мышечная ткань, амнион, легкое и т. д.; взрослые: кожа, почечная паренхима и т. д.). При этом чаще всего получают культуры эпителиальных клеток или фибробластов.

Культура считается первичной, пока она не подверглась хотя бы однократному пассированию. В процессе пассирования первичные культуры превращаются в клеточные линии.

Клеточные линии могут быть либо кратковременными, т. е. способными проходить ограниченное число пассажей, либо постоянными (пересеваемыми, перевиваемыми, стабильными, трансформированными), т. е. способными к неограниченному пассированию in vitro.

Общим для современных способов получения первичных трипсинизированных однослойных культур является обработка тканей трипсином, реже химотрипсином, папаином, панкреатином, гиалуронидазой, коллагеназой. В стерильных условиях ткань измельчают, промывают и помещают в р-ре фермента на магнитную мешалку. Полученную суспензию клеток центрифугируют, осадок клеток разводят ростовой средой до оптимальной концентрации (в зависимости от типа клеточных культур от 100 000 до 500 000 клеток на 1 мл среды). После посева в культуральные флаконы клетки прикрепляются к стеклу и адаптируются к условиям in vitro (фаза стабилизации, lag-фаза), затем они начинают активно пролиферировать (фаза логарифмического роста, log-фаза), вступая в стационарную фазу с образованием монослоя (рис. 1).

Разновидностью монослойных культур являются роллерные культуры. Роллерное культивирование клеток позволяет использовать всю внутреннюю поверхность флакона, к-рая омывается средой в результате постоянного вращения флакона с низкой скоростью (0,5—1 об/мин). Чередование жидкой и воздушных фаз, омывающих клетки, создает максимально благоприятные условия для роста клеток и повышает их продуктивность. Роллерное культивирование применимо для первичных культур, диплоидных штаммов, клеток, а также постоянных клеточных линий с выраженными адгезивными свойствами клеточной поверхности. Успех культивирования на роллерах зависит также от состава среды. Наиболее эффективны установки с перфузией среды во вращающихся роллерах.

Существуют количественные методы оценки пролиферативной активности клеток в культуре. Митотическая активность характеризуется числом клеток, находящихся в разных фазах митоза, на 1000 сосчитанных. Значения выражают в промилле. В зависимости от типа клеточных культур и условий культивирования эта величина варьирует. Наибольших значений митотическая активность достигает в фазе логарифмического роста. Благодаря существованию у нормальных клеток феномена контактного ингибирования роста (см.) формирование сплошного монослоя ведет к прекращению клеточной пролиферации. Для получения новых клеточных генераций сформированный монослой трипсинизируют до образования единичных клеток, которые разводят ростовой средой и пересеивают в новые флаконы. Число пассажей у первичных культур ограничено, и по прошествии определенного времени в них развиваются явления неспецифической дегенерации, ведущей к гибели клеток. Смена среды, создание оптимальных условий культивирования не предотвращают этого процесса.

Отдельные клетки в первичных культурах могут давать начало линиям измененных клеток, которые обладают потенцией безграничного роста в культуре. Выведение линий клеток из первичных культур длится в течение нескольких месяцев. Постоянные клеточные линии (рис. 2) характеризуются наследуемыми изменениями клеточной поверхности, которые в целом определяют их большую автономность, меньшее сродство к субстрату по сравнению с исходными клетками первичных культур. В ряде случаев трансформированные клетки утрачивают свойство контактного ингибирования роста, что в свою очередь ведет к формированию фокусов многослойного роста. Клетки клеточных линий имеют, как правило, нестабильный гетероплоидный набор хромосом. Совокупность всех этих особенностей наряду со свойством бесконечного размножения in vitro называют трансформацией. Можноиндуцировать трансформацию клеток с помощью некоторых вирусов и хим. соединений. Другим источником получения постоянных клеточных линий служат злокачественные новообразования (напр., HeLa-линия получена от женщины с плоско-клеточной карциномой шейки матки). Однако не из всех злокачественных новообразований удается получить клеточные линии. Использование метода клонирования клеток позволяет получить генетически однородную линию — клон, являющийся потомством одной клетки (рис. 3).

Из первичных культур нормальных тканей можно выделить диплоидные штаммы клеток, которые являются морфологически однородными культурами. Диплоидные штаммы должны сохранять в процессе пассирования диплоидный набор хромосом, характерный для особи, от к-рой получен штамм. Диплоидные штаммы проходят три фазы развития: стабилизации, активного роста и старения; они имеют продолжительный, но ограниченный срок жизни. Широко известен штамм WI-38 диплоидных клеток легкого эмбриона человека, выведенный Хейфликом и Мурхедом (L. Hayflick, P. S. Moorhead, 1961). Диплоидные штаммы получают методом эксплантации кусочков эмбриональной ткани и посевом взвеси эмбриональных клеток, щадяще обработанных трипсином при t° 4°. Важна исходная посевная концентрация — 10 5 клеток на 1 мл среды и pH 7,2—7,4. Очень важно получение однородной суспензии, т. к. не полностью трипсинизированные кусочки являются причиной раннего старения культуры. Диплоидные штаммы клеток эмбриона человека выдерживают ок. 50 пассажей. Штаммы, полученные из тканей взрослого организма, имеют более низкий пассажный потенциал. Культуры диплоидных клеток человека используют для приготовления следующих вирусных вакцин: полиомиелитной, аденовирусной, коревой, краснушной, оспенной, риновирусной, антирабической, против клещевого энцефалита. Критериями пригодности штаммов диплоидных клеток для производства вакцин являются кариологическая стабильность, отсутствие вирусной, бактериальной, микоплазменной и других контаминаций, отсутствие туморогенной активности при прививке животным. Для использования в практике получения вакцин штаммы на первых пассажах фазы активного роста замораживают и консервируют при температуре жидкого азота.

Кроме использования в вирусологии, диплоидные штаммы клеток широко применяют для изучения действия различных повреждающих агентов на генетический аппарат клетки для исследования ферментных систем клетки, в экспериментах по клеточной гибридизации, для изучения процессов индуцированной трансформации.

Суспензионное культивирование

Метод суспензионного культивирования дает возможность получать большое количество клеток, в частности для производства ферментов и других биологически активных соединений, имеющих научную и практическую ценность.

Метод суспензионного культивирования основан на изменениях свойств клеточной поверхности пересеваемых клеток, которые имеют пониженное сродство к субстрату. При суспензионном культивировании достигается высокая однородность клеток в культуральной среде, длительное поддержание их в логарифмической фазе роста. Наиболее простой способ культивирования — накопительная культура, в к-рой клетки постоянно перемешиваются (с помощью магнитной мешалки) в незаменяемой среде. Скорость перемешивания 200—300 об/мин. Для лимфоцитов требуется более высокая скорость — 600 об/мин. Более эффективное перемешивание достигается при циркуляции клеток в трубках. Без смены среды в суспензионных культурах наблюдаются все фазы роста клеточных культур in vitro: lag-фаза, log-фаза, стационарная фаза и фаза логарифмического отмирания.

Добавление свежих порций среды в аппараты суспензионного культивирования в логарифмической фазе дает возможность поддерживать клетки в этой фазе неограниченно долго. На основе этого наблюдения были разработаны проточные суспензионные системы, в которых скорость поступления среды регулируется скоростью размножения клеток. Проточные суспензионные системы могут быть типа хемостатов, в которых подача среды осуществляется по заданной программе с определенным интервалом времени (на основе полученных параметров клеточного размножения). Более совершенна система турбидостатов, в которых подача среды регулируется на основе фотометрических измерений плотности клеточной суспензии. Для бесперебойной работы хемо- и турбидостатов необходимо поддерживать оптимальные условия культивирования: pH среды, концентрацию O₂ и CO₂, плотность клеток в суспензии, соответствующий состав питательных сред, необходимую температуру.

Суспензионные культуры успешно используют для размножения вирусов гриппа человека и птиц, энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита и т. д. Наиболее широко применяют в суспензионном культивировании среды Хигути, Берча, Нейгла.

Культуры клеток in vivo. Оптимальные условия для жизнедеятельности клеток обеспечиваются организмом. Культивирование клеток и тканей in vivo или пассирование через живой организм осуществляется путем их трансплантации: а) эмбрионам; б) животным с толерантностью к клеткам донора; в) генетически идентичным особям; г) в области, лишенные прямого кровоснабжения (переднюю камеру глаза, мозг, роговицу); д) в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров; е) с применением средств, угнетающих иммунную систему реципиента. Удобной моделью культивирования клеток и тканей является хорион-аллантоисная оболочка куриного эмбриона.

Многие экспериментальные опухоли поддерживают путем серийных пассажей на генетически идентичных животных. Гетеротрансплантацию в переднюю камеру глаза применяют для изучения дифференцировки различных нормальных и опухолевых клеток, а также для культивирования органных культур.

Культивирование клеток в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров (тип АА или НА, с порами, не пропускающими клетки) осуществляется в брюшной полости животных. Клетки в камерах способны не только длительно существовать, но и дифференцироваться. Особенно часто этот метод применяют для ведения органных культур. Перспективны возможности исследования клеток, растущих в диффузионных камерах, методами электронной микроскопии (рис. 4.).

Асцитные опухоли — ряд перевиваемых опухолей животных, которые способны расти в виде свободно взвешенных клеток в экссудате брюшной полости. Некоторые из асцитных опухолей можно культивировать in vitro, что создает уникальную модельную систему для проведения экспериментов, сочетая методы исследования in vivo и in vitro. Наиболее широко в экспериментальной практике используется асцитная форма карциномы Эрлиха; кроме того, получено большое число асцитных форм опухолей у крыс и мышей, которые жизнеспособны в условиях in vitro.

Получение гомо-, гетерокарионов и клеточных гибридов. Методы получения гомо-, гетерокарионов и гибридов соматических клеток in vitro основаны на открытии Барского (G. Barski) с соавт. (1960), обнаружившего, что соматические клетки могут сливаться, образуя жизнеспособные гибриды. Гибридизация соматических клеток проходит несколько этапов. Сначала клетки склеиваются, затем разрушаются клеточные оболочки и образуется цитоплазматический мостик. Полное слияние клеток заканчивается образованием одной общей оболочки. Т. о., получаются двуядерные или многоядерные гомокарионы (если сливаются идентичные клетки) или гетерокарионы (если сливаются клетки разного происхождения). Гомокарионы представляют интерес для изучения поведения многоядерных клеток в культуре. Гетерокарионы нашли применение при решении вопросов регуляции, репрессии и дерепрессии генов. Большое число исследований проведено на гетерокарионах куриных эритроцитов с HeLa-клетками.

Читайте также: Ткань с нитками висячими

Гибриды соматических клеток возникают спонтанно с низкой частотой 10 -6 — 10 -8 . Обработка клеток парагриппозным вирусом Сендай (предварительно инактивированным ультрафиолетовым облучением или бета-пропиолактоном) увеличивает частоту слияния до 10 -2 —10 -3 . С использованием вируса Сендай удается получить гибриды соматических клеток, принадлежащих организмам разных видов, классов (млекопитающие X птицы) и даже разных типов (человек X комар). Для образования гибридов успешно используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который позволил получить слияние клеток от представителей царства растений и животных (растительный протопласт X курица).

Для выделения гибридных клеток после их образования пользуются специальными селективными средами, в которых исходные, родительские, клетки погибают, а выживают только гибриды, отличающиеся от родительских клеток определенным сочетанием маркеров, напр, повышенной резистентностью к действию аналогов оснований ДНК или пониженной потребностью в определенных метаболитах.

Для подтверждения гибридного происхождения выделенных клеток исследуют их Кариотип (рис. 5), определяют присутствие маркерных родительских хромосом, исследуют ферменты и определяют наличие антигенов родительских клеток.

Гибридизация соматических клеток служит основным экспериментальным подходом к картированию генов млекопитающих, в особенности человека. Было обнаружено, что у межвидовых гибридов при культивировании наблюдается предпочтительная утрата хромосом одного из родителей. Так, у гибридов мышь X человек последовательно элиминируют хромосомы человека, что используют для картирования хромосом человека. Развитие методов гибридизации соматических клеток сделало возможным анализ наследования злокачественности на клеточном уровне, изучение механизмов дифференцировки клеток и проблемы регуляции генов.

Кроме описанной гибридизации соматических клеток, разработаны специальные методы получения гибридов для анализа механизмов цитоплазматической наследственности. Получены также гибриды клеток одного типа с отдельными хромосомами из клеток другого типа, с биохим. подтверждением функционирования этих хромосом в гибридной клетке.

Замораживание и хранение клеток при низкой температуре

В конце 19 в. было показано, что бактерии, семена растений и сложные биохимические соединения могут длительно сохраняться при низких температурах. В 50-х гг. 20 в. были сделаны попытки использовать при замораживании клеток вещества, увеличивающие выживаемость,— криопротекторы. Так, Полдж (С. Polge, 1949) обнаружил, что глицерин, добавленный к суспензии клеток, значительно увеличивает их выживаемость. Начиная с 60-х гг. в центре внимания оказался диметилсульфоксид (DMSO). Его широко используют как криопротектор для многих типов клеток. Считают, что главной причиной повреждения клеток при замораживании является повышение концентрации электролитов в клетке или около нее. При температуре ниже 0° в клетках образуются кристаллы льда, которые увеличиваются по мере понижения температуры, соответственно увеличивается в оставшейся среде и концентрация электролитов. Кристаллы льда не образуются при постепенном снижении температуры. Электронно-микроскопические наблюдения свидетельствуют о том, что очень медленное замораживание и быстрое оттаивание вызывают наименьшее повреждение цитоплазматических структур клетки. Для консервирования растущие клетки культуры снимают со стекла трипсином, промывают ростовой средой и помещают в среду замораживания в концентрации клеток 1 млн/мл и более. Среда замораживания — обычная ростовая или поддерживающая среда, содержащая от 2 до 25% сыворотки и криопротекторы: глицерин 5 — 10% или DMSO 5 — 15%. Клетки помещают в специальные стерильные пластиковые или стеклянные ампулы, закрывают или запаивают и начинают охлаждать. До — 20° понижение температуры ведется со скоростью 1° в 1 мин. При замораживании кусочков ткани их измельчают до размера 1 мм3 и проводят аналогичные процедуры. Дальнейшее охлаждение от —20° и до температуры хранения проводят быстро. Хранят замороженные клетки в рефрижераторах с жидким азотом. Предпочтительно хранение в газовой фазе, над жидким азотом, где температура составляет ок. —130°.

Процесс оттаивания должен быть очень быстрым. Ампулы из жидкого азота переносят в водяную баню t° 40°. Как только суспензия полностью оттаивает, ее разводят 1: 10 теплой ростовой средой и рассеивают. Можно предварительно отцентрифугировать клетки и залить свежей ростовой средой. Кусочки промывают и как можно быстрее инокулируют. После 6 мес. хранения культур, замороженных и оттаянных описанным способом, наблюдается 100% выживаемость клеток.

Транспортировка клеток на большие расстояния возможна либо в виде суспензии, либо в виде монослоя в культуральном флаконе, полностью заполненном средой. Возможна транспортировка клеток в замороженном состоянии при температуре кипения жидкого азота в специальных контейнерах и на сухом льду.

Культуры клеток и тканей в радиобиологии

Культуры клеток и тканей широко применяются в радиобиологии. Интерес к ним обусловлен возможностью изучать радиационную патологию клетки, изолированную от влияния других клеточных систем или нейрогуморальных факторов, которые имеют место в организме.

Культуры клеток используют при разработке вопросов механизма действия ионизирующего излучения на клетку (см. «Мишени» теория), проблемы клеточной радиочувствительности, вопросов поражения и восстановления клеток при действии ионизирующих излучений и др. Установлены, напр., закономерности изменения частоты хромосомных аберраций в зависимости от мощности дозы излучения. При относительно больших мощностях дозы излучения (более 0,5—1 р/мин) частота хромосомных аберраций растет с увеличением дозы ионизирующего излучения и составляет примерно 0,15% на каждый рад дозы. В условиях применения малых мощностей доз излучения (0,2—0,0002 р/мин) данная зависимость (доза — эффект) существенно изменяется; рост эффекта (напр., частоты хромосомных аберраций) от дозы ионизирующего излучения выражен тем слабее, чем меньше мощность дозы излучения, что свидетельствует о снижении биол, эффективности ионизирующего излучения. При продолжительном действии малых мощностей доз ионизирующего излучения возникает стабилизация эффекта, при к-рой, несмотря на продолжающееся облучение культур, уже не происходит дальнейшего повышения частоты хромосомных повреждений, хотя суммарные дозы, полученные клеточной популяцией, могут составлять 5000—10 000 р. Уровень стабилизации эффекта в этих условиях различен и пропорционален величине мощности дозы излучения. Наблюдаемые изменения связывают с тем, что в условиях продолжительного действия ионизирующего излучения облучение захватывает ряд поколений клеток. В облучаемой популяции устанавливается равновесие между интенсивностью возникновения лучевых повреждений в клетках и скоростью их репарации.

Использование синхронных культур позволило получить новые данные о действии радиации на жизненный цикл клетки: выявлены значительные колебания радиочувствительности, детально прослежен характер возникновения хромосомных и хроматидных аберраций, обнаружены участки клеточного цикла, ответственные за задержку синтеза ДНК и митоза и т. п.

Например, наибольшая радиочувствительность, как правило, характерна для клеток, находящихся в момент облучения в период митоза (М), тогда как в пресинтетический (G1) или премитотический (G2) периоды они в 2—5 раз более радиорезистентны. В период синтеза ДНК(S) радиочувствительность чаще имеет промежуточное значение, но отмечаются признаки повышенной репаративной способности клеток.

В радиационной генетике приемы культивирования обеспечивают не только возможность приготовления высококачественных препаратов для тонкого хромосомного анализа (метафазные пластинки) различных видов клеток, в т. ч. и редко делящихся (культивирование с фитогемагглютинином), кроме того, культуры различных клеток являются объектом для разносторонних исследований действия радиации на генетические структуры клеток. Они имеют первостепенное значение в исследовании генных трансмутаций и мутаций. С их помощью выявлены биохимические мутанты, устойчивые к лекарственным препаратам, с измененной радиочувствительностью и т. п.

Для диагностики радиационных поражений наибольшее значение пока имеет определение частоты и типа хромосомных аберраций, возникающих в клетках костного мозга и периферической крови (рис. 6).

Культуры клеток находят применение при изучении действия хим. радиопротекторов и радиосенсибилизаторов. Введение различных хим. веществ в питательную среду облученных культур с последующим анализом выживаемости, частоты хромосомных аберраций или иных объективных показателей лучевого поражения клеток позволяет быстро и с достаточной точностью судить о характере и эффективности их действия на клетки (рис. 7).

Имеются, однако, и определенные ограничения использования культур в радиобиологических и иных исследованиях. Они связаны в первую очередь с тем,, что в однослойных культурах удается обеспечивать только размножение клеток, тогда как второй чрезвычайно важный процесс жизнедеятельности клетки — процесс дифференцировки — быстро затухает. Поэтому в радиобиологических исследованиях чаще используют перевиваемые клеточные линии, а не первичные культуры.

Культуры клеток и тканей в онкологии

Культуры клеток и тканей как метод научного исследования широко применяется в современной онкологии. Метод позволяет на клеточном уровне изучать этиол, факторы и патогенетические механизмы процесса малигнизации, биол, особенности и закономерности поведения и взаимодействия нормальных и опухолевых клеток, механизмы действия канцерогенных и противоопухолевых веществ, а также иных хим., физ. и биол, агентов. В системе К. к. и т. возможно культивирование онкогенных вирусов (см.).

В условиях К. к. и т. закономерно воспроизводится феномен канцерогенеза или малигнизации нормальных клеток. Малигнизация клеток в К. к. и т. может происходить под воздействием онкогенных вирусов, хим. канцерогенных веществ, а также без специальных воздействий (спонтанно).

О первых попытках вызвать малигнизацию клеток вне организма сообщил А. Каррель в 1924 г. С этой целью автор использовал вирус саркомы Рауса. Возникновение опухолей на месте прививки обработанных вирусом куриных моноцитов оставило открытым вопрос, является ли развитие опухолей результатом малигнизации клеток in vitro или следствием действия вируса, размножившегося в культуре клеток. В дальнейшем, по мере выделения и изучения иных онкогенных вирусов, было показано их прямое действие на клетки в К. к. и т. Онкогенные вирусы (ДНК- и РНК-содержащие) вызывают в К. к. и т. развитие процесса трансформации, в ходе к-рого клетки претерпевают наследуемые морфол., кариологические, физиол., антигенные и другие изменения. В случаях злокачественной трансформации клетки приобретают способность образовывать при прививке животным опухоли. Наиболее изучено в К. к. и т. действие таких онкогенных вирусов, как вирус полиомы, SV40, аденовирус, вирус саркомы Рауса и др. Некоторые Онкогенные вирусы способны вызывать злокачественную трансформацию культур клеток человека.

Начиная с опытов Фишера (A. Fischer, 1926) проводятся исследования с целью вызывать малигнизацию клеток хим. канцерогенными веществами. М. А. Магат, А. Д. Тимофеевский, Л. Ф. Ларионов и др. после воздействия многоядерными ароматическими углеводородами (1, 2, 5, 6-дибензантрацен, 3,4-бензпирен) наблюдали в культурах появление морфол, изменений, похожих на трансформацию вирусного происхождения. В последующих опытах с канцерогенными веществами, гл. обр. в условиях монослойных культур, разным авторам удалось вызвать наступление злокачественной трансформации. Тем не менее возможность присутствия в клетках латентных, в т. ч. онкогенных, вирусов оставляет открытым вопрос о самостоятельном малигнизирующем действии на клетки хим. канцерогенных веществ.

В 1941 —1943 гг. в лабораториях Гая (G. О. Gey) и Эрла (W. Earle) было установлено, что малигнизация клеток может происходить без специальных воздействий в результате длительного культивирования. Так наз. спонтанная малигнизация наступает в монослойных культурах спустя несколько месяцев после начала культивирования. В культурах наблюдаются признаки трансформации: изменяется морфология, в клетках возрастает число хромосом (гетероплоидия), скорость роста увеличивается. Прививка таких культур животным часто вызывает развитие опухолей. Причины спонтанной малигнизации в К. к. и т. окончательно не изучены. Придается значение факторам питательной среды, отсутствию гомеостатических влияний организма, переносу клеток в специфические условия К. к. и т. и т. д. Имеются сведения об участии в спонтанной малигнизации онкогенных вирусов, микоплазм.

Культуры клеток и тканей являются удобной экспериментальной системой для выращивания и изучения опухолей вне организма.

Первые попытки культивировать (эксплантировать) опухоли человека были предприняты в 1910 г. А. Каррелем и Берроузом (М. Т. Burrows). В 1913 г. П. П. Авророву и А. Д. Тимофеевскому впервые удалось выращивать клетки крови и костного мозга больных лейкозами, а в 1914 г. они эксплантировали несколько сарком человека. Последующие многочисленные исследования эксплантатов опухолей показали, что опухолевые клетки в К. к. и т. могли проявлять признаки тканевой принадлежности, что позволило исследовать гистогенез ряда опухолей человека. Была показана миогенная природа некоторых сарком, уточнен генез новообразований яичников, матки, смешанной опухоли околоушной слюнной железы, малодифференцированных опухолей легкого, новообразований ц. н. с., доказана нейрогенная природа меланом и т. д. Отмеченная способность анаплазированных опухолевых клеток к дифференцировке (созреванию) соответственно их генезу, по мнению А. Д. Тимофеевского, позволяет ставить вопрос о возможности направленного изменения их биол, свойств.

Общий вид некоторых культур клеток опухолей человека представлен на рисунке 8.

• Свежие записи
  • Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
  • Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
  • Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
  • Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
  • Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом