Метод культура тканей таблица

Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.

Сущность

Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.

В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).

История развития

Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.

В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.

К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.

Типы исследуемого материала

Различают 2 основных вида культур тканей растений:

Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.

По способу выращивания выделяют следующие методы:

на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.

Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.

Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.

Необходимые условия

Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:

Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.

В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).

Достоинства и недостатки

Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:

хорошая воспроизводимость полученных результатов;
регулирование межклеточных взаимодействий;
небольшой расход реагентов;
генетическая однородность клеточных линий;
возможность механизации процесса выращивания;
контроль над условиями содержания клеток;
низкотемпературное хранение живых культур.

К недостатком данной биотехнологии относят:

необходимость соблюдения строгих условий асептики;
нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
дороговизна химических реагентов;
неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.

Применение

Метод культуры тканей используется для проведения исследований:

процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
результатов генетических манипуляций с клетками.

Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:

получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
криоконсервация генофонда;
реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).

Вегетативное размножение культурой ткани

Одним из видов искусственного вегетативного размножения является культура тканей. Он заключается в выращивании новых растений из фрагментов живой ткани или отдельных клеток вегетативного органа. Подобный метод выращивания растений позволяет получить большое количество экземпляров в любое время года. Кроме того, посадочный материал получается здоровым и генетически однородным.

Общая характеристика

Культура тканей — это способ искусственного вегетативного размножения растений из клеток образовательной ткани.

В основе метода вегетативного размножения культурой ткани лежит уникальное свойство растительной клетки — тотипотентность. Это способность клетки воспроизводить генетическую информацию и путём деления дать начало любому клеточному типу организма.

Рис. 1. Растительные клетки.

Для вегетативного размножения растений культурой тканей потребуется:

фрагмент живой ткани или отдельных клеток, взятых из любого вегетативного органа;
искусственная питательная среда;
пробирка;
соблюдение стерильности и температурного режима.

Рис. 2. Выращивание растений в колбах.

При попадании в благоприятную среду клетки начинают активно делиться, появляется молодое растение, которое спустя положенное время можно высаживать в грунт.

Преимущества вегетативного размножения культурой ткани

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию так называемого клонального размножения — получения неполовым путём растений, в которых в точности повторяется генетический материал исходного экземпляра.

Термин «клон» впервые был введён в 1903 году Уэбстером. В переводе с греческого «klon» — это черенок или побег, пригодный для размножения растений. Клонирование предполагает получение идентичных организмов из единичных клеток. А в 50-х годах XX века Жан Морель первым получил растения-регенеранты орхидеи. Затем в культуру in vitro (в пробирке) были введены растения гвоздики, хризантемы, гороха, кукурузы и другие травянистые культуры.

К преимуществам вегетативного размножения культурой ткани относят:

Минимальное количество исходного материала.
Получение посадочного материала в течение всего года.
Получение генетически однородных растений.
Высокий коэффициент размножения.
Получение растений, которые трудно размножаются традиционными способами.
Возможность автоматизации процесса выращивания.

В настоящее время данный способ активно используется для размножения садовой гвоздики, герберы, орхидей, женьшеня и даже картофеля. Эти растения можно привести в качестве примеров в докладе по биологии для 6 класса.

Важнейшим преимуществом вегетативного размножения культурой ткани является получение безвирусной формы растений. Это значит, что новый посадочный материал будет абсолютно здоровым, не заражённым никакими болезнетворными микроорганизмами.

Что мы узнали?

Вегетативное размножение культурой ткани — это бесполый способ размножения, основанный на получении нового растения из отдельных клеток или тканей вегетативного органа материнского растения. Кратко подытоживая, он имеет ряд преимуществ, среди которых получение абсолютно здорового, генетически однородного посадочного материала в течение всего года.

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Культуры клеток и тканей — клетки, кусочки ткани, зачатки органа, растущие или сохраняющие жизнеспособность вне организма «в пробирке» (in vitro).

В клеточных культурах клетки не организованы в ткань, тогда как для тканевых и органных культур необходимым условием является сохранение тканевой и органотипической дифференцировки и (или) функции.

История

Первые попытки культивирования клеток in vitro были сделаны в 19 в. В 1885 г. Ру (W. Roux) удалось в течение нескольких дней поддерживать развитие медуллярной пластинки куриного эмбриона в солевом растворе, а в 1887 г. Арнольду (J. Arnold) — наблюдать миграцию лейкоцитов лягушки. Однако в это время не было реальной базы для создания условий, способных поддерживать жизнедеятельность клеток и тканей in vitro. Подлинным началом культивирования клеток вне организма считаются опыты Гаррисона (R. G. Harrison), который в 1907 г. эксплантировал в сгустках лимфы лягушки кусочки медуллярной трубки эмбриона лягушки. Через несколько недель культивирования у этих клеток вырастали аксоны. Метод культивирования в сгустке лимфы, позднее в сгустке плазмы, с добавлением эмбриональных экстрактов стал одним из общепринятых и используется до наст. времени.

Развитию методов культивирования во многом способствовали исследования А. Карреля, который показал возможность длительного культивирования клеток в условиях строгой асептики. Флаконы Карреля являются необходимым элементом оборудования современных культуральных лабораторий. Большой вклад в разработку методов культивирования клеток внесли отечественные ученые А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Г. К. Хрущов, Н. Г. Хлопин и А. Д. Тимофеевский. Группа исследователей из Национального ракового ин-та (США) под руководством Эрла (W. Earle) разработала методы культивирования клеток на стекле, получила культуры одиночных клеток и клеток в суспензии. Результатом работ Фишера (D. Fischer, 1948), Мортона, Паркера, Моргана (H. J. Morton, R. Parker, J. F. Morgan, 1950), Игла (H. Eagle, 1955) явилось создание современных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих in vitro.

После того как в 50-х гг. 20 в. была показана возможность размножения вируса полиомиелита на ряде клеточных культур и возникла практическая заинтересованность в разработке методов Культур клеток и тканей, для получения вакцин эта область исследований начала стремительно развиваться. Создание специальных сред культивирования позволило получить культуры клеток из разных органов и тканей многих видов млекопитающих и человека (см. таблицу). Были выведены специальные суспензионные культуры, приближающиеся по своим способностям давать большую биомассу к культурам микроорганизмов. Суспензионные культуры нашли применение в вирусологии для накопления вирусов энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, везикулярного стоматита, осповакцины, гриппа, болезни Ньюкасла, а также в производстве биол, активных препаратов: ферментов, антител, вакцин. Различные Культуры клеток и тканей применяются с диагностическими целями для культивирования вирусов (см.).

Обнаружение явления спонтанной злокачественной трансформации клеток in vitro, а также трансформации с помощью ряда вирусов и химических канцерогенов явилось экспериментальной основой изучения механизмов канцерогенеза (см. Онкогенез). Разработаны методы слияния клеток для образования гибридов соматических клеток (см. Генетика соматических клеток), которые используются для картирования генов млекопитающих. Совершенствование методов культивирования клеток явилось основой развития цитогенетики человека, идентификации синдромов, связанных с нарушением числа и структуры хромосом (синдромы Дауна, Шерешевского — Тернера, Клайнфелтера, Эдвардса, Патау, кошачьего крика и т. д.). Успехи в области цитогенетики и картирования генов связаны с разработкой принципиально новых методов дифференциальной окраски хромосом. Совершенствование методов культивирования амниотических клеток плода и техники амниоцентеза (см.) позволило подойти к решению основных вопросов медико-генетического консультирования — пренатальной диагностике хромосомных заболеваний и наследственных биохимических нарушений обмена.

Читайте также: Серебристая ткань для чехлов

Культура клеток является одной из экспериментальных моделей генной инженерии (см.).

Кроме того, методы Культур клеток и тканей применяются в гистологии для изучения морфогенеза и функциональной анатомии клеток и тканей, в иммунологии для культивирования иммунокомпетентных клеток (см.) и изучения их функций в гематологии для культивирования клеток костного мозга и периферической крови.

Основные условия культивирования клеток и тканей

Для производства, получения и хранения Культур клеток и тканей необходимы стерильные помещения, широкий ассортимент солевых р-ров, питательных сред и антибиотиков. Кроме того, требуется следующее оборудование: стерильные боксы с ультрафиолетовым облучением и установками с ламинарным потоком стерильного воздуха; микроскопы — инвертированные для просмотра культур и обычные для анализа препаратов; центрифуги; термостаты с водяным обогревом и с контролируемой подачей CO₂; рефрижераторы для хранения сред, антибиотиков, сывороток, ферментов; установки для замораживания и емкости с жидким азотом для хранения клеточных линий; магнитные мешалки; резиновые пробки, трубки, наконечники; посуда из нейтрального стекла типа «Пирекс». Посуду кипятят в специальных детергентах, многократно прополаскивают дист, водой, стерилизуют сухим жаром или автоклавированием. Используемые биол, жидкости стерилизуют фильтрованием под давлением через мембранные фильтры с размером пор 220 нм после предфильтрования через глубинные фильтры (из асбеста или стеклянного волокна).

Кроме традиционного оборудования, современная культуральная лаборатория использует микрополичашки (пластиковые панели с углублениями) с набором автоматических микропипеток и микродозиметров, роллерные и суспензионные установки. Желательно применение пластиковой посуды одноразового пользования.

При поддержании жизнедеятельности клеток in vitro важное значение имеют осмотическое давление, концентрация ионов водорода (pH) и ряд других неорганических ионов, состав газовой среды, температура. Осмотическое давление в клетках млекопитающих составляет при t° 38° ок. 7,6 атм, и его необходимо поддерживать в культуральной среде. Осмотическое давление в питательных средах создается гл. обр. концентрацией хлорида натрия. Определенную роль играют другие неорганические ионы и глюкоза. Высокомолекулярные соединения мало влияют на величину осмотического давления.

Оптимальная концентрация ионов водорода, т. е. pH среды, для роста большинства клеток близка к нейтральным значениям. Для роста диплоидных фибробластов необходимо поддерживать pH в пределах 7,2 — 7,4. Большинство клеток, особенно постоянные клеточные линии, т. е. пересеваемые линии, выдерживают pH от 6,8 до 7,6. Величина pH в культуральной среде зависит от соотношения Гидрокарбонат натрия является частью сбалансированного солевого р-ра питательной среды, CO₂ образуется в результате дыхания клеток. При культивировании в закрытых сосудах, в случае низкой начальной концентрации клеток, уровень pH сдвигается резко в щелочную сторону, что сказывается на жизнеспособности клеток. Этого можно избежать, вдувая во флаконы CO₂ сразу после посева. Предпочтительно культивирование в открытых сосудах, в термостатах с контролируемой подачей CO₂ (5 — 10% CO₂ и 95—90% воздуха). Производятся среды с большой буферной емкостью на основе фосфатного буфера, Tris или HEPES (оксиметил-аминометан и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-этансульфоновая к-та).

Для постоянного контроля за уровнем pH в состав ростовых сред вводят индикатор pH, в качестве к-рого часто применяют фенол-красный или фенол-сульфонталеин. Эти вещества не токсичны для клеток в концентрации до 0,002 г/л.

Для поддержания жизнедеятельности клеток и тканей in vitro необходимы ионы натрия, кальция, магния, железа, которые не только участвуют в поддержании постоянства осмотического давления, но необходимы для функционирования ряда клеточных ферментов. Существенна также и достаточная концентрация кислорода, к-рая в закрытых сосудах обеспечивается определенными отношениями объема воздуха и объема среды.

Питательные среды

Культивирование Культур клеток и тканей обеспечивается в первую очередь сложным сбалансированным набором ряда питательных компонентов среды. Среды делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают рост клеток и тканей, тогда как поддерживающие предназначены гл. обр. для сохранения жизнеспособности и функц, активности К. к. и т. в течение продолжительного времени. Среди ростовых сред, в свою очередь, можно выделить естественные питательные среды — продукты частичной обработки естественных высокопитательных веществ: инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота, лошади, человека, эмбрионов телят; гидролизат лактальбумина — продукт ферментативного гидролиза белков молока; аминопептид — ферментативный гидролизат белка; гемогидролизат — продукт ферментативного расщепления крови крупного рогатого скота и человека; эмбриональный куриный экстракт. Существенным недостатком всех естественных (нативных) питательных сред является их нестандартность и сложность стерилизации. Синтетические питательные среды готовят из определенных хим. веществ без включения естественных продуктов.

На синтетических средах без добавления сыворотки или других естественных питательных веществ растут не все клетки. Наиболее широко применяются среда 199, среда Игла и ее модификации, среда F-10 и F-12 (Хэма), CMRL-1066, NCTC-109, среда Мак-Коя и др. В состав синтетических питательных сред входят, как правило, незаменимые аминокислоты в L-форме (аргинин, гистидин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин). Необходимы также цистеин и тирозин. У трансформированных клеток резко повышена потребность в глутамине. Для улучшения роста единичных клеток необходимо добавлять серин. Комплекс витаминов включает витамины группы В (парааминобензойная к-та, биотин, холин, фолиевая к-та, никотиновая к-та, пантотеновая к-та, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, инозитол). Некоторые среды (среда 199, NCTC-109) содержат коферменты и жирорастворимые витамины. Важную группу компонентов составляют восстановители (аскорбиновая к-та, L-цистеин, глутатион) и предшественники нуклеиновых к-т. Источником углеводов служат глюкоза, 2-дезокси-D-рибоза, D-рибоза. Состав сред постоянно совершенствуется. Добавление сыворотки к синтетическим средам улучшает рост клеток. Широкое применение имеют синтетические среды с добавлением 5—20% сыворотки. Для клеточных культур используют сыворотку различного происхождения. H аи лучшими ростовыми свойствами обладает эмбриональная сыворотка. Полностью роль всех компонентов сыворотки не выяснена. Пептиды, липиды, аминокислоты являются источниками питательных веществ. Высокомолекулярные фракции сыворотки альфа- и бета-глобулины выполняют защитную функцию, предохраняя клетки от повреждения. Сыворотка способствует прикреплению клеток к субстрату и распластыванию на нем.

Поддерживающая среда, как правило, ростовая среда, в к-рую не входит сыворотка. Созданы специальные поддерживающие среды, включающие желатину или снятое молоко.

Для приготовления рабочих р-ров и сред используют бидистиллированную или деминерализованную с помощью ионообменников воду. Многие первичные культуры хорошо растут на среде, содержащей гидролизат лактальбумина или гемогидролизат и сыворотку. Хорошие результаты дает среда F-10 (Хэма) с 2 — 10% сыворотки. Для выращивания постоянных клеточных линий используют основную среду Игла или среду 199 с добавлением 10% сыворотки, часто используют минимальную среду Игла (МЭМ). При работе с клеточными линиями повышенной питательной потребности рекомендуются среды Мак-Коя, Дульбекко и др. Клетки млекопитающих легко адаптируются к разным средам, однако наблюдаются случаи сложной адаптации и токсичности сред. Как правило, указанные случаи связаны с нарушением стандартных условий в производстве сред или сыворотки.

Контаминация культур клеток микроорганизмами и использование антибиотиков

Несмотря на соблюдение правил стерильности, в лабораториях, работающих с клеточными культурами, бывают случаи бактериальной, микоплазменной, грибковой и вирусной контаминации клеточных культур. Источником контаминации бактериями и микоплазма-ми могут быть исследователи, сыворотка и воздух. Вирусы могут попасть в культуру с клетками, если они взяты из инфицированного организма, а также с трипсином или сывороткой. Основой подбора антибиотиков, обладающих способностью убивать микроорганизмы, являются результаты бактериологического анализа загрязнений и тестирования эффективности действия на них антибиотиков. Наиболее часто для борьбы с бактериальными загрязнениями используют пенициллин, стрептомицин, неомицин, линкамицин, гентамицин, полимиксин, для борьбы с микоплазмами — канамицин, миокризин, ауреомицин и тилозин, а с грибками — фунгизон (амфотерицин В).

Методы приготовления и характеристика культур клеток и тканей

Культуры переживающих тканей

Как правило, для кратковременного поддержания жизни клеток и тканей используют сбалансированные солевые р-ры с определенным осмотическим давлением и pH среды. В качестве источника энергии добавляют глюкозу. Для поддержания переживающих культур наиболее широко пользуются р-рами Ханкса, Эрла, Тирода, Дульбекко и средой Троуэлла—Т8.

Культуры растущих тканей

Получение культур тканей основано на первичной эксплантации растущих тканей, изолированных непосредственно из организма. К основной группе методов относятся те, в которых используются предметные стекла с лунками, флаконы Карреля, а также пробирки и перфузионные камеры.

Эксплантацию небольших кусочков ткани для морфологических исследований в сочетании с микрокиносъемкой проводят на предметном стекле, к-рое потом накрывают специальным покровным стеклом и заклеивают. Более известны модификации этого метода: эксплантация на одинарное покровное стекло со сгустком плазмы, к-рое помещают над лункой предметного стекла (Гаррисон); метод Максимова с двойным покровным стеклом; метод культивирования в капле среды на покровном стекле [Льюис и Льюис (W. Lewis, М. Lewis)]. Методы культивирования К. к. и т. на стеклах удобны для кратковременных исследований, т. к. длительное ведение связано с необходимостью сложной замены питательной среды. Культуры на покровных стеклах можно пересевать. Для этого эксплантат рассекают на кусочки и переносят на новые покровные стекла. Каждый кусочек обрабатывают затем, как новый эксплантат.

Более длительное культивирование эксплантатов возможно в сгустке плазмы во флаконах Карреля [Эрл (W. R. Earle)]. Метод используют при формировании линий и штаммов клеток. Для этой цели во флаконы Карреля помещают каплю смеси плазмы и эмбрионального экстракта, которую распределяют по дну флакона, помещают кусочки ткани в плазму и дают образоваться сгустку, а затем приливают питательную среду. Ткань можно переносить из сосуда в сосуд, нарезая кусочками или трипсинизируя ткань и сгусток, как в случае получения первично трипсинизированных культур.

Культивирование в сгустке плазмы в неподвижной или вращающейся пробирке, метод «летающих стекол» близки к культивированию во флаконах Карреля. Эксплантаты можно укреплять на стенках пробирки или на узких покровных стеклах, которые помещают в пробирки с питательной средой. Пробирки можно поместить в наклонном положении во вращающийся барабан для лучшего контакта эксплантата со средой. Метод «летающих стекол» получил широкое применение для исследования большого числа эксплантатов. Вместо сгустка плазмы можно использовать подложки: коллагеновые, лавсановые (для дальнейших электронно-микроскопических исследований), пластиковые, агаровые, из пористой бумаги, ацетатцеллюлозы. Можно эксплантировать ткань и непосредственно на стекле, в частности при эксплантации кусочков кожи, макрофагов и других клеток, способных прикрепляться к стеклу. Задачей метода органных культур является создание условий культивирования, максимально близких к условиям in vivo. Основной принцип метода состоит в том, что эксплантат помещают на границе двух фаз —питательная среда/газовая смесь. Существует несколько вариантов поддержания органных культур: культивирование на поверхности плазменного сгустка, на часовом стекле в чашке Петри [Фелл (Н. Fell)] — классическая техника, являющаяся основой современных методов; культивирование в мягком (полутвердом) агаре, насыщенном питательной средой, эмбриональным экстрактом, сывороткой; культивирование на металлических (тантал или нержавеющая сталь) сетках, покрытых агаром [Троуэлл (О. Trowell)], нижняя поверхность которых касается жидкой питательной среды; культивирование на «плоту» из ацетатцеллюлозы или папиросной бумаги [Чан (J. Chan), 1954; Рихтер (Richter), 1955]; культивирование на миллипоровых фильтрах [Гробштейн (С. Grobstein), 1955]. Для создания оптимальных условий культуры инкубируют в газовой смеси, состоящей из 95% O₂ и 5% CO₂ с ежедневной сменой питательной среды. Широкое распространение в технике тканевых и органных культур имеют перфузионные камеры, позволяющие прижизненно изучать процессы развития.

Читайте также: Платье вязание плюс ткань своими руками

Первичные культуры, диплоидные штаммы и клеточные линии

Независимо от отношения к субстрату следует различать первичные культуры и клеточные линии. Первичные культуры получают непосредственно из нормальных или опухолевых тканей человека или животных методом эксплантации или трипсинизации тканей, обладающих ростовыми потенциями (эмбриональные: костно-мышечная ткань, амнион, легкое и т. д.; взрослые: кожа, почечная паренхима и т. д.). При этом чаще всего получают культуры эпителиальных клеток или фибробластов.

Культура считается первичной, пока она не подверглась хотя бы однократному пассированию. В процессе пассирования первичные культуры превращаются в клеточные линии.

Клеточные линии могут быть либо кратковременными, т. е. способными проходить ограниченное число пассажей, либо постоянными (пересеваемыми, перевиваемыми, стабильными, трансформированными), т. е. способными к неограниченному пассированию in vitro.

Общим для современных способов получения первичных трипсинизированных однослойных культур является обработка тканей трипсином, реже химотрипсином, папаином, панкреатином, гиалуронидазой, коллагеназой. В стерильных условиях ткань измельчают, промывают и помещают в р-ре фермента на магнитную мешалку. Полученную суспензию клеток центрифугируют, осадок клеток разводят ростовой средой до оптимальной концентрации (в зависимости от типа клеточных культур от 100 000 до 500 000 клеток на 1 мл среды). После посева в культуральные флаконы клетки прикрепляются к стеклу и адаптируются к условиям in vitro (фаза стабилизации, lag-фаза), затем они начинают активно пролиферировать (фаза логарифмического роста, log-фаза), вступая в стационарную фазу с образованием монослоя (рис. 1).

Разновидностью монослойных культур являются роллерные культуры. Роллерное культивирование клеток позволяет использовать всю внутреннюю поверхность флакона, к-рая омывается средой в результате постоянного вращения флакона с низкой скоростью (0,5—1 об/мин). Чередование жидкой и воздушных фаз, омывающих клетки, создает максимально благоприятные условия для роста клеток и повышает их продуктивность. Роллерное культивирование применимо для первичных культур, диплоидных штаммов, клеток, а также постоянных клеточных линий с выраженными адгезивными свойствами клеточной поверхности. Успех культивирования на роллерах зависит также от состава среды. Наиболее эффективны установки с перфузией среды во вращающихся роллерах.

Существуют количественные методы оценки пролиферативной активности клеток в культуре. Митотическая активность характеризуется числом клеток, находящихся в разных фазах митоза, на 1000 сосчитанных. Значения выражают в промилле. В зависимости от типа клеточных культур и условий культивирования эта величина варьирует. Наибольших значений митотическая активность достигает в фазе логарифмического роста. Благодаря существованию у нормальных клеток феномена контактного ингибирования роста (см.) формирование сплошного монослоя ведет к прекращению клеточной пролиферации. Для получения новых клеточных генераций сформированный монослой трипсинизируют до образования единичных клеток, которые разводят ростовой средой и пересеивают в новые флаконы. Число пассажей у первичных культур ограничено, и по прошествии определенного времени в них развиваются явления неспецифической дегенерации, ведущей к гибели клеток. Смена среды, создание оптимальных условий культивирования не предотвращают этого процесса.

Отдельные клетки в первичных культурах могут давать начало линиям измененных клеток, которые обладают потенцией безграничного роста в культуре. Выведение линий клеток из первичных культур длится в течение нескольких месяцев. Постоянные клеточные линии (рис. 2) характеризуются наследуемыми изменениями клеточной поверхности, которые в целом определяют их большую автономность, меньшее сродство к субстрату по сравнению с исходными клетками первичных культур. В ряде случаев трансформированные клетки утрачивают свойство контактного ингибирования роста, что в свою очередь ведет к формированию фокусов многослойного роста. Клетки клеточных линий имеют, как правило, нестабильный гетероплоидный набор хромосом. Совокупность всех этих особенностей наряду со свойством бесконечного размножения in vitro называют трансформацией. Можноиндуцировать трансформацию клеток с помощью некоторых вирусов и хим. соединений. Другим источником получения постоянных клеточных линий служат злокачественные новообразования (напр., HeLa-линия получена от женщины с плоско-клеточной карциномой шейки матки). Однако не из всех злокачественных новообразований удается получить клеточные линии. Использование метода клонирования клеток позволяет получить генетически однородную линию — клон, являющийся потомством одной клетки (рис. 3).

Из первичных культур нормальных тканей можно выделить диплоидные штаммы клеток, которые являются морфологически однородными культурами. Диплоидные штаммы должны сохранять в процессе пассирования диплоидный набор хромосом, характерный для особи, от к-рой получен штамм. Диплоидные штаммы проходят три фазы развития: стабилизации, активного роста и старения; они имеют продолжительный, но ограниченный срок жизни. Широко известен штамм WI-38 диплоидных клеток легкого эмбриона человека, выведенный Хейфликом и Мурхедом (L. Hayflick, P. S. Moorhead, 1961). Диплоидные штаммы получают методом эксплантации кусочков эмбриональной ткани и посевом взвеси эмбриональных клеток, щадяще обработанных трипсином при t° 4°. Важна исходная посевная концентрация — 10 5 клеток на 1 мл среды и pH 7,2—7,4. Очень важно получение однородной суспензии, т. к. не полностью трипсинизированные кусочки являются причиной раннего старения культуры. Диплоидные штаммы клеток эмбриона человека выдерживают ок. 50 пассажей. Штаммы, полученные из тканей взрослого организма, имеют более низкий пассажный потенциал. Культуры диплоидных клеток человека используют для приготовления следующих вирусных вакцин: полиомиелитной, аденовирусной, коревой, краснушной, оспенной, риновирусной, антирабической, против клещевого энцефалита. Критериями пригодности штаммов диплоидных клеток для производства вакцин являются кариологическая стабильность, отсутствие вирусной, бактериальной, микоплазменной и других контаминаций, отсутствие туморогенной активности при прививке животным. Для использования в практике получения вакцин штаммы на первых пассажах фазы активного роста замораживают и консервируют при температуре жидкого азота.

Кроме использования в вирусологии, диплоидные штаммы клеток широко применяют для изучения действия различных повреждающих агентов на генетический аппарат клетки для исследования ферментных систем клетки, в экспериментах по клеточной гибридизации, для изучения процессов индуцированной трансформации.

Суспензионное культивирование

Метод суспензионного культивирования дает возможность получать большое количество клеток, в частности для производства ферментов и других биологически активных соединений, имеющих научную и практическую ценность.

Метод суспензионного культивирования основан на изменениях свойств клеточной поверхности пересеваемых клеток, которые имеют пониженное сродство к субстрату. При суспензионном культивировании достигается высокая однородность клеток в культуральной среде, длительное поддержание их в логарифмической фазе роста. Наиболее простой способ культивирования — накопительная культура, в к-рой клетки постоянно перемешиваются (с помощью магнитной мешалки) в незаменяемой среде. Скорость перемешивания 200—300 об/мин. Для лимфоцитов требуется более высокая скорость — 600 об/мин. Более эффективное перемешивание достигается при циркуляции клеток в трубках. Без смены среды в суспензионных культурах наблюдаются все фазы роста клеточных культур in vitro: lag-фаза, log-фаза, стационарная фаза и фаза логарифмического отмирания.

Добавление свежих порций среды в аппараты суспензионного культивирования в логарифмической фазе дает возможность поддерживать клетки в этой фазе неограниченно долго. На основе этого наблюдения были разработаны проточные суспензионные системы, в которых скорость поступления среды регулируется скоростью размножения клеток. Проточные суспензионные системы могут быть типа хемостатов, в которых подача среды осуществляется по заданной программе с определенным интервалом времени (на основе полученных параметров клеточного размножения). Более совершенна система турбидостатов, в которых подача среды регулируется на основе фотометрических измерений плотности клеточной суспензии. Для бесперебойной работы хемо- и турбидостатов необходимо поддерживать оптимальные условия культивирования: pH среды, концентрацию O₂ и CO₂, плотность клеток в суспензии, соответствующий состав питательных сред, необходимую температуру.

Суспензионные культуры успешно используют для размножения вирусов гриппа человека и птиц, энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита и т. д. Наиболее широко применяют в суспензионном культивировании среды Хигути, Берча, Нейгла.

Культуры клеток in vivo. Оптимальные условия для жизнедеятельности клеток обеспечиваются организмом. Культивирование клеток и тканей in vivo или пассирование через живой организм осуществляется путем их трансплантации: а) эмбрионам; б) животным с толерантностью к клеткам донора; в) генетически идентичным особям; г) в области, лишенные прямого кровоснабжения (переднюю камеру глаза, мозг, роговицу); д) в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров; е) с применением средств, угнетающих иммунную систему реципиента. Удобной моделью культивирования клеток и тканей является хорион-аллантоисная оболочка куриного эмбриона.

Многие экспериментальные опухоли поддерживают путем серийных пассажей на генетически идентичных животных. Гетеротрансплантацию в переднюю камеру глаза применяют для изучения дифференцировки различных нормальных и опухолевых клеток, а также для культивирования органных культур.

Культивирование клеток в диффузионных камерах из миллипоровых фильтров (тип АА или НА, с порами, не пропускающими клетки) осуществляется в брюшной полости животных. Клетки в камерах способны не только длительно существовать, но и дифференцироваться. Особенно часто этот метод применяют для ведения органных культур. Перспективны возможности исследования клеток, растущих в диффузионных камерах, методами электронной микроскопии (рис. 4.).

Асцитные опухоли — ряд перевиваемых опухолей животных, которые способны расти в виде свободно взвешенных клеток в экссудате брюшной полости. Некоторые из асцитных опухолей можно культивировать in vitro, что создает уникальную модельную систему для проведения экспериментов, сочетая методы исследования in vivo и in vitro. Наиболее широко в экспериментальной практике используется асцитная форма карциномы Эрлиха; кроме того, получено большое число асцитных форм опухолей у крыс и мышей, которые жизнеспособны в условиях in vitro.

Получение гомо-, гетерокарионов и клеточных гибридов. Методы получения гомо-, гетерокарионов и гибридов соматических клеток in vitro основаны на открытии Барского (G. Barski) с соавт. (1960), обнаружившего, что соматические клетки могут сливаться, образуя жизнеспособные гибриды. Гибридизация соматических клеток проходит несколько этапов. Сначала клетки склеиваются, затем разрушаются клеточные оболочки и образуется цитоплазматический мостик. Полное слияние клеток заканчивается образованием одной общей оболочки. Т. о., получаются двуядерные или многоядерные гомокарионы (если сливаются идентичные клетки) или гетерокарионы (если сливаются клетки разного происхождения). Гомокарионы представляют интерес для изучения поведения многоядерных клеток в культуре. Гетерокарионы нашли применение при решении вопросов регуляции, репрессии и дерепрессии генов. Большое число исследований проведено на гетерокарионах куриных эритроцитов с HeLa-клетками.

Гибриды соматических клеток возникают спонтанно с низкой частотой 10 -6 — 10 -8 . Обработка клеток парагриппозным вирусом Сендай (предварительно инактивированным ультрафиолетовым облучением или бета-пропиолактоном) увеличивает частоту слияния до 10 -2 —10 -3 . С использованием вируса Сендай удается получить гибриды соматических клеток, принадлежащих организмам разных видов, классов (млекопитающие X птицы) и даже разных типов (человек X комар). Для образования гибридов успешно используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который позволил получить слияние клеток от представителей царства растений и животных (растительный протопласт X курица).

Для выделения гибридных клеток после их образования пользуются специальными селективными средами, в которых исходные, родительские, клетки погибают, а выживают только гибриды, отличающиеся от родительских клеток определенным сочетанием маркеров, напр, повышенной резистентностью к действию аналогов оснований ДНК или пониженной потребностью в определенных метаболитах.

Для подтверждения гибридного происхождения выделенных клеток исследуют их Кариотип (рис. 5), определяют присутствие маркерных родительских хромосом, исследуют ферменты и определяют наличие антигенов родительских клеток.

Гибридизация соматических клеток служит основным экспериментальным подходом к картированию генов млекопитающих, в особенности человека. Было обнаружено, что у межвидовых гибридов при культивировании наблюдается предпочтительная утрата хромосом одного из родителей. Так, у гибридов мышь X человек последовательно элиминируют хромосомы человека, что используют для картирования хромосом человека. Развитие методов гибридизации соматических клеток сделало возможным анализ наследования злокачественности на клеточном уровне, изучение механизмов дифференцировки клеток и проблемы регуляции генов.

Читайте также: Стулья для офиса ткань

Кроме описанной гибридизации соматических клеток, разработаны специальные методы получения гибридов для анализа механизмов цитоплазматической наследственности. Получены также гибриды клеток одного типа с отдельными хромосомами из клеток другого типа, с биохим. подтверждением функционирования этих хромосом в гибридной клетке.

Замораживание и хранение клеток при низкой температуре

В конце 19 в. было показано, что бактерии, семена растений и сложные биохимические соединения могут длительно сохраняться при низких температурах. В 50-х гг. 20 в. были сделаны попытки использовать при замораживании клеток вещества, увеличивающие выживаемость,— криопротекторы. Так, Полдж (С. Polge, 1949) обнаружил, что глицерин, добавленный к суспензии клеток, значительно увеличивает их выживаемость. Начиная с 60-х гг. в центре внимания оказался диметилсульфоксид (DMSO). Его широко используют как криопротектор для многих типов клеток. Считают, что главной причиной повреждения клеток при замораживании является повышение концентрации электролитов в клетке или около нее. При температуре ниже 0° в клетках образуются кристаллы льда, которые увеличиваются по мере понижения температуры, соответственно увеличивается в оставшейся среде и концентрация электролитов. Кристаллы льда не образуются при постепенном снижении температуры. Электронно-микроскопические наблюдения свидетельствуют о том, что очень медленное замораживание и быстрое оттаивание вызывают наименьшее повреждение цитоплазматических структур клетки. Для консервирования растущие клетки культуры снимают со стекла трипсином, промывают ростовой средой и помещают в среду замораживания в концентрации клеток 1 млн/мл и более. Среда замораживания — обычная ростовая или поддерживающая среда, содержащая от 2 до 25% сыворотки и криопротекторы: глицерин 5 — 10% или DMSO 5 — 15%. Клетки помещают в специальные стерильные пластиковые или стеклянные ампулы, закрывают или запаивают и начинают охлаждать. До — 20° понижение температуры ведется со скоростью 1° в 1 мин. При замораживании кусочков ткани их измельчают до размера 1 мм3 и проводят аналогичные процедуры. Дальнейшее охлаждение от —20° и до температуры хранения проводят быстро. Хранят замороженные клетки в рефрижераторах с жидким азотом. Предпочтительно хранение в газовой фазе, над жидким азотом, где температура составляет ок. —130°.

Процесс оттаивания должен быть очень быстрым. Ампулы из жидкого азота переносят в водяную баню t° 40°. Как только суспензия полностью оттаивает, ее разводят 1: 10 теплой ростовой средой и рассеивают. Можно предварительно отцентрифугировать клетки и залить свежей ростовой средой. Кусочки промывают и как можно быстрее инокулируют. После 6 мес. хранения культур, замороженных и оттаянных описанным способом, наблюдается 100% выживаемость клеток.

Транспортировка клеток на большие расстояния возможна либо в виде суспензии, либо в виде монослоя в культуральном флаконе, полностью заполненном средой. Возможна транспортировка клеток в замороженном состоянии при температуре кипения жидкого азота в специальных контейнерах и на сухом льду.

Культуры клеток и тканей в радиобиологии

Культуры клеток и тканей широко применяются в радиобиологии. Интерес к ним обусловлен возможностью изучать радиационную патологию клетки, изолированную от влияния других клеточных систем или нейрогуморальных факторов, которые имеют место в организме.

Культуры клеток используют при разработке вопросов механизма действия ионизирующего излучения на клетку (см. «Мишени» теория), проблемы клеточной радиочувствительности, вопросов поражения и восстановления клеток при действии ионизирующих излучений и др. Установлены, напр., закономерности изменения частоты хромосомных аберраций в зависимости от мощности дозы излучения. При относительно больших мощностях дозы излучения (более 0,5—1 р/мин) частота хромосомных аберраций растет с увеличением дозы ионизирующего излучения и составляет примерно 0,15% на каждый рад дозы. В условиях применения малых мощностей доз излучения (0,2—0,0002 р/мин) данная зависимость (доза — эффект) существенно изменяется; рост эффекта (напр., частоты хромосомных аберраций) от дозы ионизирующего излучения выражен тем слабее, чем меньше мощность дозы излучения, что свидетельствует о снижении биол, эффективности ионизирующего излучения. При продолжительном действии малых мощностей доз ионизирующего излучения возникает стабилизация эффекта, при к-рой, несмотря на продолжающееся облучение культур, уже не происходит дальнейшего повышения частоты хромосомных повреждений, хотя суммарные дозы, полученные клеточной популяцией, могут составлять 5000—10 000 р. Уровень стабилизации эффекта в этих условиях различен и пропорционален величине мощности дозы излучения. Наблюдаемые изменения связывают с тем, что в условиях продолжительного действия ионизирующего излучения облучение захватывает ряд поколений клеток. В облучаемой популяции устанавливается равновесие между интенсивностью возникновения лучевых повреждений в клетках и скоростью их репарации.

Использование синхронных культур позволило получить новые данные о действии радиации на жизненный цикл клетки: выявлены значительные колебания радиочувствительности, детально прослежен характер возникновения хромосомных и хроматидных аберраций, обнаружены участки клеточного цикла, ответственные за задержку синтеза ДНК и митоза и т. п.

Например, наибольшая радиочувствительность, как правило, характерна для клеток, находящихся в момент облучения в период митоза (М), тогда как в пресинтетический (G1) или премитотический (G2) периоды они в 2—5 раз более радиорезистентны. В период синтеза ДНК(S) радиочувствительность чаще имеет промежуточное значение, но отмечаются признаки повышенной репаративной способности клеток.

В радиационной генетике приемы культивирования обеспечивают не только возможность приготовления высококачественных препаратов для тонкого хромосомного анализа (метафазные пластинки) различных видов клеток, в т. ч. и редко делящихся (культивирование с фитогемагглютинином), кроме того, культуры различных клеток являются объектом для разносторонних исследований действия радиации на генетические структуры клеток. Они имеют первостепенное значение в исследовании генных трансмутаций и мутаций. С их помощью выявлены биохимические мутанты, устойчивые к лекарственным препаратам, с измененной радиочувствительностью и т. п.

Для диагностики радиационных поражений наибольшее значение пока имеет определение частоты и типа хромосомных аберраций, возникающих в клетках костного мозга и периферической крови (рис. 6).

Культуры клеток находят применение при изучении действия хим. радиопротекторов и радиосенсибилизаторов. Введение различных хим. веществ в питательную среду облученных культур с последующим анализом выживаемости, частоты хромосомных аберраций или иных объективных показателей лучевого поражения клеток позволяет быстро и с достаточной точностью судить о характере и эффективности их действия на клетки (рис. 7).

Имеются, однако, и определенные ограничения использования культур в радиобиологических и иных исследованиях. Они связаны в первую очередь с тем,, что в однослойных культурах удается обеспечивать только размножение клеток, тогда как второй чрезвычайно важный процесс жизнедеятельности клетки — процесс дифференцировки — быстро затухает. Поэтому в радиобиологических исследованиях чаще используют перевиваемые клеточные линии, а не первичные культуры.

Культуры клеток и тканей в онкологии

Культуры клеток и тканей как метод научного исследования широко применяется в современной онкологии. Метод позволяет на клеточном уровне изучать этиол, факторы и патогенетические механизмы процесса малигнизации, биол, особенности и закономерности поведения и взаимодействия нормальных и опухолевых клеток, механизмы действия канцерогенных и противоопухолевых веществ, а также иных хим., физ. и биол, агентов. В системе К. к. и т. возможно культивирование онкогенных вирусов (см.).

В условиях К. к. и т. закономерно воспроизводится феномен канцерогенеза или малигнизации нормальных клеток. Малигнизация клеток в К. к. и т. может происходить под воздействием онкогенных вирусов, хим. канцерогенных веществ, а также без специальных воздействий (спонтанно).

О первых попытках вызвать малигнизацию клеток вне организма сообщил А. Каррель в 1924 г. С этой целью автор использовал вирус саркомы Рауса. Возникновение опухолей на месте прививки обработанных вирусом куриных моноцитов оставило открытым вопрос, является ли развитие опухолей результатом малигнизации клеток in vitro или следствием действия вируса, размножившегося в культуре клеток. В дальнейшем, по мере выделения и изучения иных онкогенных вирусов, было показано их прямое действие на клетки в К. к. и т. Онкогенные вирусы (ДНК- и РНК-содержащие) вызывают в К. к. и т. развитие процесса трансформации, в ходе к-рого клетки претерпевают наследуемые морфол., кариологические, физиол., антигенные и другие изменения. В случаях злокачественной трансформации клетки приобретают способность образовывать при прививке животным опухоли. Наиболее изучено в К. к. и т. действие таких онкогенных вирусов, как вирус полиомы, SV40, аденовирус, вирус саркомы Рауса и др. Некоторые Онкогенные вирусы способны вызывать злокачественную трансформацию культур клеток человека.

Начиная с опытов Фишера (A. Fischer, 1926) проводятся исследования с целью вызывать малигнизацию клеток хим. канцерогенными веществами. М. А. Магат, А. Д. Тимофеевский, Л. Ф. Ларионов и др. после воздействия многоядерными ароматическими углеводородами (1, 2, 5, 6-дибензантрацен, 3,4-бензпирен) наблюдали в культурах появление морфол, изменений, похожих на трансформацию вирусного происхождения. В последующих опытах с канцерогенными веществами, гл. обр. в условиях монослойных культур, разным авторам удалось вызвать наступление злокачественной трансформации. Тем не менее возможность присутствия в клетках латентных, в т. ч. онкогенных, вирусов оставляет открытым вопрос о самостоятельном малигнизирующем действии на клетки хим. канцерогенных веществ.

В 1941 —1943 гг. в лабораториях Гая (G. О. Gey) и Эрла (W. Earle) было установлено, что малигнизация клеток может происходить без специальных воздействий в результате длительного культивирования. Так наз. спонтанная малигнизация наступает в монослойных культурах спустя несколько месяцев после начала культивирования. В культурах наблюдаются признаки трансформации: изменяется морфология, в клетках возрастает число хромосом (гетероплоидия), скорость роста увеличивается. Прививка таких культур животным часто вызывает развитие опухолей. Причины спонтанной малигнизации в К. к. и т. окончательно не изучены. Придается значение факторам питательной среды, отсутствию гомеостатических влияний организма, переносу клеток в специфические условия К. к. и т. и т. д. Имеются сведения об участии в спонтанной малигнизации онкогенных вирусов, микоплазм.

Культуры клеток и тканей являются удобной экспериментальной системой для выращивания и изучения опухолей вне организма.

Первые попытки культивировать (эксплантировать) опухоли человека были предприняты в 1910 г. А. Каррелем и Берроузом (М. Т. Burrows). В 1913 г. П. П. Авророву и А. Д. Тимофеевскому впервые удалось выращивать клетки крови и костного мозга больных лейкозами, а в 1914 г. они эксплантировали несколько сарком человека. Последующие многочисленные исследования эксплантатов опухолей показали, что опухолевые клетки в К. к. и т. могли проявлять признаки тканевой принадлежности, что позволило исследовать гистогенез ряда опухолей человека. Была показана миогенная природа некоторых сарком, уточнен генез новообразований яичников, матки, смешанной опухоли околоушной слюнной железы, малодифференцированных опухолей легкого, новообразований ц. н. с., доказана нейрогенная природа меланом и т. д. Отмеченная способность анаплазированных опухолевых клеток к дифференцировке (созреванию) соответственно их генезу, по мнению А. Д. Тимофеевского, позволяет ставить вопрос о возможности направленного изменения их биол, свойств.

Общий вид некоторых культур клеток опухолей человека представлен на рисунке 8.

Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом