Метод культуры тканей или клеток

Клеточная инженерия. Клетки и ткани, методы культивирования

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Клеточная инженерия. Клетки и ткани, методы культивирования

Клеточная инженерия — одно из наиболее важных направле­ний в биотехнологии. Она основана на использовании принципи­ально нового объекта — изолированной культуры клеток или тка­ней эукариотических организмов, а также на тотипотентности — уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференциров-ка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна­чительных количеств биологически ценных метаболитов расти­тельного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПРЕДМЕТА

Бурное развитие клеточной инженерии приходится на 50-е годы прошлого века, хотя первые попытки выращивания изолированных кусочков ткани были сделаны гораздо раньше. В конце XIX — начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтро­вальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой инте­рес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили раз­витие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сег­мента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусоч­ках ткани тоньше 1,5 — 2,0 мм клетки не делились. Хаберландт впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности кле­ток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способнос­ти каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В.Роббинсом и немецким ученым В.Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончи­ков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей расти­тельных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массо­вые исследования по разработке новых питательных сред, вклю­чающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового клас­са фитогормонов — цитокининов — оказалось, что при совмест­ном их действии с другим классом фитогормонов — ауксинами — появилась возможность стимулировать деление клеток, поддер­живать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в конт­ролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс кле­точных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккин-гом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. ме­тода получения изолированных протопластов. Это послужило тол­чком к получению соматических гибридов, введению в протопла­сты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод кло-нального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение. Весьма важным достижением в разви­тии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани-«нянь­ки». Этот метод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый про­гресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в раз­витии методов получения трансгенных растений, технологий ис­пользования изолированных тканей и клеток травянистых расте­ний, начато культивирование тканей древесных растений.

МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

Читайте также: Как обтянуть сиденье ткань

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусствен­ных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получи­ло название метода культуры изолированных тканей.

В связи с тем что в жизни человека наибольшее значение име­ют семенные растения, методы и условия для их культивирова­ния разработаны лучше, чем для голосеменных растений или во­дорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако независимо от принадлежнос­ти растений к той или иной таксономической группе существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.

Асептика. Прежде всего культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток тре­бует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые мо­гут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирую-щие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар-боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика дос­тигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направ­ленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептичес­кие комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую по­верхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фоль­гу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушиль­ном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 — 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышен­ном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их сле­дует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источ­ником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпи-фитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерили­зация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации представлены в табл. 6.1.

После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем раство­ре их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скаль­пелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.

Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной тка­ни. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тро­пических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхност­ной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, ко­торые и убивают микробную флору внутри ткани. Следует, одна­ко, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к сте­рилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направ­ленно действующий антибиотик.

Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культиви­руют на многокомпонентных питательных средах. Они могут су­щественно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и мик­роэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтети­ческие аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) вхо­дят в состав любой питательной смеси в концентрации 2 — 3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способ­но к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Исключение составляет кал-лусная ткань мандрагоры, амаранта и некоторых других растений.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении со­отношения между этими фитогормонами или при добавлении дру­гих фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фос­фата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды зна­чительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Од­нако изначально низкое содержание фосфатов в питательной сре­де способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Уста­новлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличи­вает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут быть до­бавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, кон­ский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экст­ракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). Введение их в сре­ду дает интересные результаты, но такие эксперименты трудно воспроизводимы, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. Например, добавление в питательную среду от­дельных фракций кокосового молока не давало никаких результа­тов, в то время как нефракционированный эндосперм вызывал деление клеток.

Читайте также: Casanova chocolate аскона ткань

При приготовлении твердых питательных сред для поверхнос­тного выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар — полисахарид, получаемый из морских водорослей. В качестве примеров в табл. 6.2 приведены составы наиболее рас­пространенных питательных сред.

Среда Мурасиге и Скуга — самая универсальная. Она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина при­водит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых культур (преобладание кинетина).

Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирова­ния клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обес­печивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность.

Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как они не способны фото-синтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза.

В качестве источника света используют люминесцент­ные лампы. Для большинства травянистых растений оптимум ос­вещенности составляет примерно 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000—10 000 люкс) освещенность подавляет рост. Освещение может влиять на метаболизм каллусных клеток. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parviflora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенно­сти влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавоноловых гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освеще­ния ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый». Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при по­следовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем све­том, лежащим в области «красный—длинноволновый красный».

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. В то же время каллусы и культуры клеток диоскореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32 °С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфоге­неза требует более низких температур (18 — 20 °С). Влияние тем­пературы на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть дан­ные, что в каллусных культурах максимальное образование алка­лоидов наблюдалось при температуре 25 °С, а при повышении тем­пературы резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15 °С). Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тща­тельно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток.

Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом куль­тивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наи­большим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60 — 70%.

Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от мно­гих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве­стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ­ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак­торов на рост и физиологические характеристики этой культуры.

Метод культуры тканей: сущность и применение

Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.

Сущность

Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.

Читайте также: Как сделать рисунок из кусочков ткани

В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).

История развития

Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.

В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.

К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.

Типы исследуемого материала

Различают 2 основных вида культур тканей растений:

• Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
• Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.

По способу выращивания выделяют следующие методы:

• на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
• с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
• применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
• выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.

Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.

Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.

Необходимые условия

Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:

• Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
• Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
• Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.

В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).

Достоинства и недостатки

Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:

• хорошая воспроизводимость полученных результатов;
• регулирование межклеточных взаимодействий;
• небольшой расход реагентов;
• генетическая однородность клеточных линий;
• возможность механизации процесса выращивания;
• контроль над условиями содержания клеток;
• низкотемпературное хранение живых культур.

К недостатком данной биотехнологии относят:

• необходимость соблюдения строгих условий асептики;
• нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
• дороговизна химических реагентов;
• неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.

Применение

Метод культуры тканей используется для проведения исследований:

• процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
• межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
• взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
• результатов генетических манипуляций с клетками.

Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:

• получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
• направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
• клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
• выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
• криоконсервация генофонда;
• реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).

• Свежие записи
  • Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
  • Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
  • Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
  • Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
  • Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом
  • Правообладателям
  • Политика конфиденциальности

  Мастерица © 2023
  Информация, опубликованная на сайте, носит исключительно ознакомительный характер