НИССЛЯ МЕТОД (F. Nissl, нем. невропатолог и психиатр, 1860—1919) — способ гистологической окраски нервной ткани. Предложен Нисслем в 1894 г. Н. м. наряду с импрегнацией серебром широко применяется для изучения нервной ткани как в норме, так и при патологии. Метод позволяет судить о нормальном состоянии и патол, изменениях в нервных клетках (флоккуляция тигроида, тигролиз, вакуолизация цитоплазмы и др.), а также в глиальных элементах. Оригинальный Н. м. с течением времени претерпел ряд упрощений; вместо него применяют различные модификации, в частности так наз. упрощенный Н. м. Кусочки мозга толщиной до 3—4 мм фиксируют в спирте или в 10—15% формалине. После фиксации кусочки желательно обезжирить в многократно сменяемом в течение нескольких месяцев 96% спирте. Заливку производят в целлоидин или парафин, изготовляя как можно более тонкие срезы. Замороженные срезы из фиксированного формалином материала выдерживают при t° 37° в 70% спирте. Срезы окрашивают обычно в р-ре толуидинового синего (0,1%), тионина (0,1 —-1,0%) или крезилового фиолетового (0,5%), добиваясь интенсивной окраски, для чего р-ры можно подогреть. Окраску дифференцируют в 70—96% спирте или в смеси 90 мл 96% спирта с 10 мл свежего анилинового масла, затем препараты проводят через абсолютный спирт и заключают в нейтральный канадский бальзам. Просветление в кайепутовом масле улучшает качество препарата, но при неполном удалении масла срезы вскоре обесцвечиваются. При правильной окраске по Н. м. хроматофильное вещество нервной клетки (см.) приобретает интенсивно-синий, лиловый или фиолетовый цвет, ядра становятся светлыми или синеватыми, ядрышки темно-синими, хорошо выявляются также глиальные клетки, сосуды и пр. Препараты постепенно выцветают, в связи с чем их рекомендуется хранить в темноте.
Библиография: Меркулов Г. А. Курс патологогистологпческой техники, с. 193, Д., 1969; N issl F. tiber eine neue U ntersuchungsrriethode des Centra 1 organs specie] 1 zur Feststellung der Localization der Nervenzelien, Neurol. Zbl., Bd 13, S. 507, 1894.
Метод ниссля используют для выявления в тканях
Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,— тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.
Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».
Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl — фиксация препаратов этиловым спиртом — выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.
Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.
Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 — 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.
Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10—15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.
Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла (оливковое мыло), 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.
Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).
Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.
Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.
1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.
2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.
3. Дифференцируют в 96 % спирте.
4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.
5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.
6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.
7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.
Метод Ниссля в модификации Снесарева
Одновременно с нервными клетками на препаратах, окрашенных по Нисслю, выявляются клеточные элементы мягкой мозговой оболочки и ее сосудов, внутримозговых сосудов, ядра глии и инфильтративные клетки, липофусцин, зеленый пигмент, 6азофильные коагуляты в сосудах, протоплазменная реакция астроцитов. Метод Ниссля также может быть использован для предварительной диагностики нейроэктодермальных опухолей и паразитарных поражений мозга.
Срезы материала, залитого в целлоидин, получают на санном микротоме. Толщина срезов 8-10 мкм. Их хранят в 96 % спирте.
1. Срезы в 96 % спирте подогревают на водяной бане до появления пузырьков и охлаждают.
2. Переносят в 0,2 % раствор тионина, подогревают до появления паров и охлаждают.
3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды; проводят через 2 смены 96 % спирта (до побледнения срезов) по 30 —40 с в каждой.
4. При недостаточной дифференцировке тионина в спиртах проводят через эвкалиптовый спирт (10 мл 96 % спирта + 1 капля эвкалиптового масла) 3-5 с; тщательно ополаскивают в 3 сменах 96 % спирта, проводят через спирт-ксилол (2 части ксилола и 1 часть 96 % спирта), 100 % спирт-ксилол, ксилол.
5. Переносят на предметное стекло и заключают в бальзам.
6. Готовые препараты укладывают на доски и держат на свету до просветления фона (контроль под микроскопом).
Раствор тионина. Готовят из 1 г тионина и 500 мл дистиллированной воды. Тионин растирают в ступке в течение 45-60 мин, добавляя по каплям подогретую дистиллированную воду. Затем доливают оставшуюся дистиллированную воду, подогревают, доводят до кипения и фильтруют через 6 фильтров.
Перед использованием приготовленного раствора тионина его также следует профильтровать. Использованный краситель сливают в отдельный сосуд, так как он может быть вновь использован.
Результаты: на светлом фоне выявляются нервные клетки сине-фиолетового цвета различных оттенков.
Метод Ниссля отличается постоянством и большой надежностью результатов. Основой его успешного использования являются правильная фиксация материала и, что особенно важно, тщательное обезвоживание в спиртах восходящей концентрации при заливке в целлоидин или парафин. При несоблюдении этих условий препараты дают неотчетливое изображение, имеют зеленый оттенок и быстро обесцвечиваются.
Метод ниссля используют для выявления в тканях
В распознавании, диагностике и изучении патоморфологических основ этиологии и патогенеза психических заболеваний значительное место принадлежит анатомическим исследованиям.
Патологическая анатомия в психиатрии изучает изменения структуры органов и тканей при различных психических болезнях, определяет характер и локализацию патологического процесса (в первую очередь в мозге), устанавливает диагноз психического и соматического страдания, если оно было, и причину смерти. Патологическая анатомия психозов имеет ряд особенностей, обусловленных ее тесной связью с теорией психиатрии, практикой клинической работы и психиатрической прозектуры.
Патологическая анатомия психозов создавалась психиатрами-клиницистами, которые стремились выяснить сущность наблюдаемых ими психических расстройств и найти их анатомическую основу. У истоков патоморфологии психозов стояли И.П. Мержеевский, В.М.Бехтерев, С.С.Корсаков, T . Willis , G . Meynert , F . Nissle , A . Alzheimer и др. Ее дальнейшее развитие в нашей стране связано с именами В.А.Гиляровского, П.Е.Снесарева, Л.И.Смирнова, М.О.Гуревича, В.К.Белецкого, А.П. Авцына, их сотрудников и последователей, заложивших основы современной клинической анатомии психических заболеваний. Их труды остаются настольными руководствами в повседневной работе нейроморфологов.
Особенно большой вклад внесла патологическая анатомия в познание заболеваний, связанных с определенным анатомическим процессом в мозге (некоторые формы врожденного слабоумия, сифилис мозга и прогрессивный паралич, старческая деменция, сосудистые психозы и т.п.). Успехи в изучении этих заболеваний, относящиеся к концу XIX и особенно к началу XX в., связаны с развитием нозологических представлений в психиатрии, распространением анатомических методов в медицине и появлением элективных гистологических методов изучения нервной ткани.
Успехи в изучении перечисленных органических заболеваний мозга вселили большие надежды на выявление морфологической основы и других психозов. Однако оказалось, что далеко не все психические заболевания имеют достаточно очерченную нейроморфологическую картину головного мозга. К таким болезням относятся шизофрения, аффективные и другие эндогенные психозы. Но даже тогда, когда психоз имеет определенный анатомический субстрат (например, сифилис мозга или прогрессивный паралич), клиническую картину болезни полностью объяснить его наличием не удается, поскольку сходным анатомическим поражениям иногда соответствуют различные формы и проявления болезни. Все это свидетельствует о достаточно сложных взаимоотношениях между патологическим процессом на нейроанатомическом и психическом уровне и в известной мере о существовании определенных границ для нейроморфологии в познании патогенеза психозов. Признание этого касается прежде всего традиционных методов световой микроскопии, использующихся в психиатрической прозектуре, и вряд ли будет правильным экстраполировать эту точку зрения на более совершенные методические приемы, которые уже появились или будут разработаны в будущем. Но тем не менее в клинической психиатрии в противоположность «органическим» стали выделять «функциональные» психозы и к 50—60-м годах интерес к анатомическому исследованию несколько снизился.
Ситуация в психиатрической нейроморфологии изменилась в 70-е годы после появления и внедрения в клиническую практику КТ и других методов прижизненной визуализации мозговых структур, которые позволили установить наличие выраженных мозговых изменений при многих формах психической патологии (шизофрении, алкоголизме, некоторых формах неврозов и др.). Обнаружение с помощью КТ структурных изменений мозга при психических заболеваниях, которые ранее было принято считать «функциональными», оказалось для многих психиатров неожиданным. Поэтому была предпринята попытка переосмыслить существо таких психозов. Примерами могут служить опубликованная в 1986 г. статья Р. Tyrer и А. Mackay «Шизофрения: больше не функциональный психоз», а также высказывание G . P . Reynolds (1989), который счел возможным говорить о стирании границ между «функциональными» и «органическими» психозами.
Вышеизложенное объясняет резкое повышение интереса к нейроморфологии психических заболеваний в течение последних десятилетий. Это дало основание H . Y . Meltzer (1987) говорить о ренессансе нейроанатомии в психиатрии.
Существенный прогресс в психиатрической нейроморфологии определяется развитием новых методов исследования на основе значительных достижений смежных наук, в первую очередь физики и химии. Современный нейроморфолог применяет методы гистохимии со спектроцитофотометрией, люминесцентную, трансмиссионную и сканирующую электронную микроскопию и электронную цитохимию, методы радиоавтографии, фракционирования мозговой ткани с выделением ультраструктурных элементов, а также культивирование нервной ткани и различные экспериментальные приемы, сочетающие морфологические, физиологические и нейрохимические подходы к исследованию состояния нервной и других систем человека. Кроме того, в течение текущего десятилетия в нейроморфологию стали интенсивно внедряться методы количественного исследования в виде различных приемов анализа изображения и стереологии на основе использования соответствующей аппаратуры, обеспеченной компьютерными системами и специальными статистическими программами. Таким образом, заложены основы превращения нейроанатомии из описательной науки в науку точную, позволяющую количественно выражать изменения в нервной ткани на световом и ультраструктурном уровне и улавливать сдвиги, которые не могут быть выявлены при визуальной оценке. В настоящее время идет интенсивное накопление соответствующих фундаментальных и клинико-анатомических данных [Беличенко П.В., 1989; Орловская Д.Д., Уранова НА., 1990; Уранова НА. и др., 1997; 1999; Scheibel A . B . et al ., 1981; Bogerts В. et al ., 1983, 1986; Benes P . M . et al ., 1986; Casanova M . F . et al ., 1988, 1990, и др.].
Существенной особенностью научных исследований в области нейроморфологии психических болезней является также развитие подходов, ориентированных на нейрохимические системы мозга (дофаминергическую, серотонинергическую и др.) и их рецепторы, которым отводится ведущая роль в патогенезе многих психических болезней и механизме действия используемых для их лечения психофармакологических средств [Уранова НА., 1995, 1998; Falkai P . et al ., 1997; Reynolds G . P ., Beasley C . L ., 1997].
Перечисленные изменения создали предпосылки для значительного углубления положений классической нейрогистологии, выявления существа ранее описанных гистологических феноменов при том или ином психическом заболевании и изучения природы лежащих в их основе патологических процессов. Однако такие исследования из-за необходимости для их проведения специального оборудования и высококвалифицированных специалистов, пока не получили широкого распространения в повседневной практике психиатрических прозектур. Тем не менее они важны для интерпретации патологоанатомических данных.
Патологоанатомический диагноз в психиатрии — всегда диагноз клинико-анатомический, т.е. синтез клинических, биологических и морфологических данных о проявлениях и особенностях болезненного процесса, его динамике и исходе. Речь идет о том, что морфологические исследования в психиатрии служат продолжением клинической диагностики [Гиляровский В.А., 1955; Смирнов Л.И., 1955]. Как и в общей патологической анатомии, исследование аутопсийного материала направлено на верификацию клинического диагноза. Однако в некоторых случаях патологоанатомический диагноз психического заболевания формулируется со ссылкой на клинический диагноз. Это обусловлено тем, что при некоторых заболеваниях не установлено достаточно специфичных морфологических изменений, позволяющих отличить одно заболевание от другого, не принимая во внимание клиническую картину.
Патологоанатом психиатрического учреждения сталкивается с трудностями, обусловленными в первую очередь тем, что сами психозы относительно редко бывают причиной смерти. Больные, как правило, умирают от интеркуррентных соматических заболеваний, чаще в пожилом возрасте. Оценивая те или иные морфологические изменения, патологоанатом должен учитывать не только основное психическое заболевание, но и влияние дополнительных факторов. Кроме сопутствующих соматических заболеваний, это возрастные изменения органов и тканей (их значение особенно возрастает в связи с увеличением продолжительности жизни), результаты применения современных лечебных средств, а также патоморфоз психозов и в том числе патоморфоз, обусловленный психофармакологическими средствами ( в последние годы в работе патологоанатомов психиатрических учреждений появились трудности, не связанные со спецификой психиатрической прозектуры. Вопреки традициям, сложившимся в отечественной клинической медицине, принят закон, согласно которому анатомическое исследование становится по существу необязательным (на его проведение должно быть согласие родственников больного) со всеми вытекающими последствиями для психиатрической диагностики в условиях отсутствия клинико-анатомической верификации диагноза (закон принят Государственной думой 8.12.95 г.) ).
При патологоанатомической диагностике необходимо исключить посмертные изменения. В отечественных психиатрических учреждениях в отличие от некоторых зарубежных не производят биопсию мозга при психозах. В связи с этим раннее вскрытие приобретает огромное научное и практическое значение, позволяя патологоанатому исключить нежелательное наслоение аутолитических, посмертных изменений ткани мозга и других органов.
В связи с современными изменениями в структуре общей и психической заболеваемости и патоморфозом психозов значительно изменилось и соотношение различных причин смерти при психозах. Почти исчезли туберкулез, алиментарное истощение, смерть в состоянии тяжелого психомоторного возбуждения и кататонии, зато увеличился удельный вес различных сосудистых нарушений и заболеваний, свойственных позднему возрасту (атеросклероз, гипертоническая болезнь, новообразования и т.п.). Наиболее частыми причинами смерти являются сосудистые заболевания и пневмонии.
Основные диагностические приемы в психиатрической прозектуре не отличаются от таковых в общей патологической анатомии (анатомическое вскрытие, макроскопическое и микроскопическое исследование всех органов и тканей); особенно тщательно и систематизировано изучают мозг умерших.
При макроскопическом изучении мозга обращают внимание на его размеры, массу, состояние мозговых оболочек, кровенаполнение, консистенцию. Для минимального исследования мозга с помощью световой микроскопии мозг разделяют на несколько частей (обычно делают вертикально-поперечные разрезы на уровне височных полюсов, через мамиллярные тела, через валик мозолистого тела и отделяют мозжечок со стволом мозга) и фиксируют в 5 % растворе формалина. Для специальных гистологических и гистохимических методик используют и другие фиксаторы. После фиксации из мозга вырезают кусочки для дальнейшей гистологической обработки. Для этого необходимы кора (обычно лобная) с оболочками, полосатое тело, мозжечок с зубчатым ядром и продолговатый мозг на уровне олив. В нейроморфологии широко используют не только общие гистологические методы, но и методы, избирательно выявляющие те или иные морфологические элементы нервной ткани и их изменения. Для суждения о состоянии нервных клеток (нейронов, или нейроцитов) используют метод Ниссля, астроцитов — методы Кахала и Снесарева, микроглии — Ортеги и Миагавы — Александровской, аргирофильного каркаса сосудов — импрегнацию по Снесареву, миелина — окраску по Шпильмейеру и Лизону и др. В последние годы применяют гистохимические методы и методы люминесцентной микроскопии, в частности, для выявления амилоидных отложений (в психиатрической прозектуре одним из наиболее частых проявлений амилоидоза мозга служат сенильные бляшки).
При изучении изменений в нейронах обращают внимание на их форму, размеры, взаиморасположение, состояние ядра, изменения цитоплазмы, нисслевского вещества (тифоида), нейрофибрилл.
В классификациях патологических изменений нейронов выделяют: 1) «первичное раздражение» по Нисслю; 2) сморщивание, или склероз («хроническое заболевание» по Нисслю); 3) отечное состояние; 4) ишемические изменения; 5) острое набухание («острое заболевание» по Нисслю);
6) «тяжелое заболевание» по Нисслю; 7) патологическое отложение липоидных веществ (в том числе липоидный склероз, связанный с отложением липофусцина; 8) кальцинацию; 9) кариоцитолиз (клетка-тень).
Из изменений отростков клеток (нервных волокон) наибольшее практическое значение имеет выявление демиелинизации.
При оценке изменений глиальных элементов учитывают состояние всех видов глии — астроцитов, олигодендроцитов и микроглиоцитов, характер процесса в целом (атрофический, гипертрофический, гиперпластический), т.е. реактивность глии.
В основе патологоанатомической диагностики отдельных психических заболеваний лежат определение и оценка изменений во всех элементах нервной ткани вместе взятых (нейронах, нервных волокнах, глии, сосудах, оболочках). Комплексы этих изменений составляют гистопатологические синдромы [Смирнов Л.И., 1941], из которых формируются типы патологических процессов, характеризующих заболевания мозга. Одна из наиболее распространенных классификаций патологических мозговых процессов (мозговых болезней) предложена П.Е.Снесаревым. Он выделяет энцефалопатии, энцефалиты и опухоли. Морфологические понятия «энцефалопатия» или «энцефалит», естественно, шире, чем «гистопатологический синдром», поскольку они включают в себя не только характеристику морфологического симптомокомплекса, но и указание на этиологический фактор и патогенез нарушений.
Различают следующие энцефалопатии: 1) диспластические (уродства развития мозга); 2) дисциркуляторные; 3) некробиотические и некротические; 4) геморрагические; 5) травматические и другие деструктивные; 6) энцефалопатии, связанные с внедрением инородных тел и инвазией паразитов;
7) регенеративно-пролиферативные (наблюдающиеся при регенерации нервных волокон и др.); 8) дистрофические. Из всех энцефалопатии в диагностике психических заболеваний наибольшее практическое значение имеют дистрофические энцефалопатии. Эти энцефалопатии в свою очередь разделяются на: а) аноксические; б) алиментарно-дистрофические (при алиментарном истощении); в) токсические (при различных отравлениях); г) токсико-аноксические (характерные для эндогенных психозов); д) инволюционно-дистрофические (при старческом слабоумии и других процессах старения).
Энцефалиты представляют собой воспалительные синдромы. Выделяют энцефалиты неспецифические и специфические, острые и хронические, диффузные и очаговые. Они разделяются также по этиологии (вирусные, бактериальные, паразитарные), патогенезу и важнейшим патологоанатомическим проявлениям (например, демиелинизирующие). Некоторые демиелинизирующие энцефалиты относятся к нейроаллергическим заболеваниям.
П.Е.Снесарев (1961) подразделял опухоли на нейроэктодермальные, опухоли из мозговых корешков и периферических нервов, оболочечные и сосудистые. Существуют и другие классификации новообразований мозга. На морфологической характеристике опухолей мы не останавливаемся, поскольку в прозекторской практике с ними чаще встречаются неврологи и нейрохирурги и они подробно описаны в специальных руководствах.
Патологическая анатомия отдельных психических заболеваний изложена в соответствующих разделах руководства.
