В селекции многих сельскохозяйственных культур все шире применяются биотехнологические приемы, в том числе методы клеточной селекции, андроклинии и генетической трансформации клеток. Однако до сих пор не создано надежной технологии массового производства линий-регенерантов любых генотипов на основе клеточных и тканевых культур in vitro. Основной проблемой остается высокая степень зависимости результативности тех или иных методик от генотипа донорных растений. До сих пор не удалось установить генетическую детерминацию морфогенетических процессов in vitro и разработать на этой основе универсальные приемы оптимизации метода культивирования соматических тканей.
В течение полутора десятков лет в Саратовском госагроуниверситете им. Н.И. Вавилова ведутся исследования по поиску эффективных методов культивирования клеток и тканей растений in vitro, в том числе мягкой и твердой пшеницы.
Основной задачей изучения является поиск эффективных генов, способных повышать морфогенетическую активность и регенерационную способность клеток и тканей in vitro. Для этого исследуются эффекты генов короткостебельности на процессы, протекающие в культуре соматических тканей и пыльников мягкой и твердой пшеницы. Проводили скрининг набора почти изогенных сестринских линий, альтернативных по генам Rht-В1b, Rht-В1с, Rht-14, s1, Q.
В результате проведенных исследований установлено, что в культуре пыльников in vitro гены системы Rht, а также s1 и Q в генофоне сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 могут оказывать существенное влияние на формирование морфогенных пыльников, гаплоидных новообразований и растений-регенерантов (Tkachenko O.V., Djatchouk T.I., LobachevYu.V., 2000). Среди взятых в изучение линий во все годы изучения достоверное превышение изучаемых показателей отмечалось у линий с генами Rht-B1c и Q. Линии с этими генами достоверно превышали соответствующие высокорослые сибы по следующим показателям: выход морфогенных пыльников, выход гаплоидных новообразований, выход растений-регенерантов, в % от общего количества инокулированных пыльников. Положительное влияние на все этапы гаплопродукции также отмечалось у линии с геном Rht 14, но статистически достоверные отличия обнаружены не во всех экспериментах.
У линии с геном s1 отмечалось снижение выхода морфогенных пыльников и новообразований. На регенерацию растений данный ген существенного влияния не оказывал. Линия с геном Rht-B1b ни в одном эксперименте существенно не отличалась от своего высокорослого сиба ни по одному показателю.
В то же время, сравнительное изучение влияния гена Rht-B1b на этапы культивирования пыльников трех сортов твердой пшеницы показало достоверное снижение эффективности культивирования гаплоидных структур в генофоне двух из них.
Анализ соматических каллусных культур, полученных из незрелых зародышей, показал, что при внесении в генофон сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 гены короткостебельности могут оказывать существенное влияние на формирование меристематических очагов в тканях и способность к сохранению регенерационной активности в процессе длительного культивирования каллусов (Tkachenko O.V. and Lobachev Yu.V., 2008). Выявлены гены Rht-B1c и Rht14, обладающие сильным положительным эффектом на формирование морфогенных каллусов и сохранение регенерационной способности в процессе пассирования. При этом гены s1 и Q достоверно тормозили морфогенетические процессы в каллусах. Ген Rht-B1b в двух генотипах из трех также снижал эффективность закладки меристематических очагов и регенерации растений.
В результате проведенных исследований установлено, что гены, основным эффектом которых in vivo является снижение высоты растений, в культуре клеток и тканей in vitro оказывают различное качественное и количественное влияние на отдельные морфогенетические процессы. Выявлены гены, обладающие достоверным положительным эффектом на формирование каллусов с зонами меристематической активности и растений регенерантов.
Другим направлением исследований являлось изучение влияния различных химических веществ на эффективность этапов культивирования клеток и тканей пшеницы in vitro и регенерацию целых растений. В процессе совместных исследований с сотрудниками кафедры химии Саратовского госагроуниверситета было изучено несколько новых веществ и у одного из них обнаружена росторегулирующая и морфогенетическая активностью при введении в культуру in vitro. Данная разработка защищена в 2002 г. патентом РФ № 2186768.
Следующим направлением исследований, проводимых в настоящее время, является изучение влияния живых ассоциативных организмов, а именно бактерий рода Azospirillum на каллусные ткани и растения-регенеранты в культуре in vitro. Обнаружено, что не только сами бактерии, но и отдельные компоненты их клеточных стенок – липополисахариды способны стимулировать морфогенетические процессы в каллусах пшеницы (Tkachenko O.V. at all., 2012).
Читайте также: Как отстирать ткань если она покрасилась
Еще одним направлением исследований стала разработка методов контроля процессов, протекающих в культуре клеток и тканей in vitro. Совместно с учеными Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН методом иммуноферментного анализа была установлена связь между морфогенетическими процессами в каллусе и накоплением особого белкового компонента – пролиферативного антигена инициальных клеток меристем (ПАИ) (Евсеева Н.В. и др., 2007). Установлено, что клеточные культуры, несущие ген Rht-B1c накапливают ПАИ интенсивнее, что отражает повышенную морфогенетическую активность этих линий. Кроме того, была установлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы, заключающаяся в снижении уровня его содержания в процессе каллусогенеза и повышении уровня его содержания при вторичной дифференциации клеток до определенного максимального уровня в процессе регенерации растений. Было определено уравнение для кривой линии, описывающей этот процесс. В результате был предложен новый молекулярный маркер, отражающий интенсивность процессов дифференциации клеток и формирования очагов меристематической активности, приводящей к регенерации растений in vitro.
Таким образом, проведенные исследования открыли новые пути оптимизации существующих на сегодняшний день методов культивирования клеток и тканей растений in vitro, в том числе мягкой и твердой пшеницы, что позволит более эффективно применять биотехнологии в селекции сельскохозяйственных культур, в том числе пшеницы.
Условия и методы культивирования тканей in vitro
Любая ткань растений — это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития.
Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации.
Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.
Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов
Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы — в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.).
В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.
Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7-1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация — 8-10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели.
Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.
Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.
Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.
Читайте также: Гипоперфузия тканей что это
Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.
Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.
Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.
В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина — источник аминокислот.
В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.
Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы -токсичны, L-формы — пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.
Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.
Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.
Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.
При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.
При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.
Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.
Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2-5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой.
На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.
В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.
Читайте также: Салфетки из ткани своими руками мастер класс пэчворк тетраэдр
Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.
Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.
Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.
В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.
Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.
Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.
Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.
В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.
Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов.
В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.
МС — самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом