Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.
Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.
Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.
Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).
После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).
По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.
Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.
Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.
Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.
Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).
Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей
| Микроскопическая техника Гистологическая техника Гематоксилин Обзорные окрашивания Методы окраски тканей Окрашивание нервной ткани Окрашивание костной ткани Кровь: методы окраски Окрашивание азаном по методу Гейденгайна Микротом для парафиновых срезов МПС-2 |
Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей
Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.).
Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.
Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем— цитоплазма.
Ядерные (основные) красители. для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина.
Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.
Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином .
Железный гематоксилин Гейденгайна
окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2—12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1—36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.
Железный гематоксилин Вейгерта
готовят в виде двух основных растворов — раствора Вейгерта 1 и раствора Вейгерта 2. Раствор Вейгерта 1 представляет собой 1% раствор гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта 2 имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официальный раствор полуторахлористого железа-это 50% раствор водного хлорного железа (FеСI3* 6Н20). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором соляной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.
Квасцовый кармин приготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания -0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.
Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для до окрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2—5 мин. Цитоплазма клеток и эритроцитьи красятся в желтый цвет.
Методика окрашивания срезов гематоксилин — эозином.
Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженньие срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-3О мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.
Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:
1) срезы переносят в дистиллированную воду;
2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;
3) промывают в дистиллированной воде;
4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;
5) осуществляют контроль под микроскопом;
6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1—2 с;
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.
Методика окрашивания азур-2-эозином.
Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 110-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время, от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.
Ниже описаны методики, и прописи красителей в частности гематоксилина и его приготовление для окраски срезов из книги Р. Лилли
ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ
ПРОТРАВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ЯДЕР И ДРУГИХ СТРУКТУР
Комплексы гематоксилина с солями алюминия обычно готовят, используя двойной сульфат аммония и алюминия или алюмо — аммониевые квасцы. Такие комплексы называются обычно квасцовым гематоксилином. Иногда вместо аммониевых используются калиевые или натриевые квасцы, причем результаты окрашивания не изменяются. Поскольку красящим началом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления — гематеин, а соли алюминия в отличие от солей трехвалентного железа не являются окислителями, растворы квасцового гематоксилина перед использованием необходимо окислить или дать им «вызреть». Гематеин медленно образуется при пропускании пузырьков воздуха через растворы гематоксилина (для получения однородных результатов может понадобиться 3—4 недели), при выдерживании растворов в открытых сосудах в течение нескольких недель; гематеин образуется также в твердом красителе, хранящемся в открытом сосуде во влажной атмосфере. Большинство химических окислителей, таких, как перекиси, иодаты, перманганаты, перхлораты, окись ртути и соли трехвалентного железа, окисляют гематоксилин сразу, хотя некоторые из них действуют при нагревании.
Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще лучше в кислых растворах. Многие авторы предпочитают перекрашивать срезы не подкисленными растворами красителя, а затем дифференцировать их в кислоте, подкисленном спирте или других дифференцирующих агентах.
Квасцовый гематоксилин, приготовленный на 10%-ном водном растворе алюмо-аммониевых квасцов, имеет рН около 2,95; при добавлении 2% уксусной кислоты рН сдвигается до 2,34, при добавлении 4% — до 2,22.
Отмечено, что содержание гематеина в различных партиях поступающего в продажу гематоксилина различно, так что краситель иногда может представлять собой почти чистый гематеин. У меня имелись образцы гематоксилина, которые «вызревали» «естественным путем» за сравнительно короткий срок (8—10 дней). Обычный срок вызревания составляет 8—10 недель, хотя, по данным Шморля, период вызревания для гематоксилина Бемера составляет 8—10 дней. Иногда встречаются партии гематоксилина, которые оказываются сильно «переокисленным» при добавлении стандартных количеств иодата натрия. Я могу привести пример, когда 1 г NaIО3 окисляли 6 г гематоксилина. Это соотношение ниже, чем в прописи Майера, но выше рекомендованного.
Хорошо «вызревшие» растворы квасцового гематоксилина разбавляют дистиллированной водой до концентрации приблизительно 10 мг гематоксилина в 1 л. При «переокислении»- независимо от того, достигнуто ли оно за счет длительного выдерживания на воздухе или избыточной дозы окислителя,— раствор меняет цвет от пурпурного через красный до оранжевого или даже желто-коричневого.
Для приготовления растворов гематоксилина с хорошими красящими свойствами на 1 г гематоксилина обычно берут 177 мг перманганата калия, 200 мг иодата натрия и 500 мг окиси ртути, но, как было показано недавно, количества некоторых из зтих окислителей можно уменьшить.
Рекомендуются следующие количества окислителей на 1 г гематоксилина: иодата натрия NaIO3 -40-100 мг, перманганата калия КМnО4 — 175 мг, периодата калия КI04 —50 мг, окиси ртути НgО — 100 мг. Первые три окислителя используют при пониженной температуре, для окисления окисью ртути необходимо кипячение. Дозы КМnО4 и КI04 следует уточнить.
Способ получения гематеина не оказывает влияния на красящие свойства гематоксилина. Различные растворы квасцового гематоксилина будут окрашивать по-разному в зависимости от количества красителя, использованного для их приготовления, степени его окисления или переокисления; избирательность окрашивания при прогрессивном методе зависит от рН раствора. Роль спирта, по-видимому, сводится главным образом к предохранению от плесени, роль глицерина — к повышению стабильности растворов по отношению к переокислению. Действительно, я наблюдал, как намерению
переокисленвые растворы гематоксилина при добавлении 30% глицерина восстанавливали при стоянии свою способность к окрашиванию.
В табл. 1 приведен ряд наиболее часто употребляемых прописей приготовления
квасцовых гематоксилинов из расчета на 1 л раствора. В некоторых методах рекомендуется сначала растворить гематоксилин в спирте или в воде и окислить либо на воздухе, либо добавляя окислители. По-видимому, не имеет значения, добавляются ли квасцы, глицерин, вода, уксусная кислота и другие компоненты к гематоксилину до или после его окисления; не важен и метод окисления. Спирт и глицерин могут сами окисляться химическими окислителями.
Пропись Делафильда цитируется по Майеру («Энциклопедия» Эрлиха).
Я беру 60 г квасцов, что несколько превышает количество, необходимое для получения раствора 1 : 11, который Майер считает насыщенным. Маллори советует применять 15%-ный раствор квасцов и во всех прописях использует этиловый спирт. Последняя рекомендация кажется полезной.
Прописи для приготовления 1 л квасцовых гематоксилинов