Методы выявления липидов в тканях

ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА — ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ — 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

10. ЛИПИДЫ

10.4. Методы анализа липидов

Поскольку липиды нерастворимы в воде, их экстракция и последующее разделение требуют использования органических растворителей и некоторых методик, которые нс применяются при очистке водорастворимых веществ, таких как белки или углеводы. Общий подход к разделению сложных смесей липидов основан на различиях в их полярности или растворимости в неполярных растворителях. Для последующего анализа липиды, которые содержат жирные кислоты, связанные сложноэфирной или амидной связью, можно гидролизовать, обработав кислотой, щелочью или высокоспецифичными гидролитическими ферментами (фосфолипазы, гликозидазы). Некоторые методы, широко применяемые для анализа липидов, представлены на рис. 10-24 и обсуждаются ниже.

Для экстракции липидов требуются органические растворители

Нейтральные липиды (триацилглицериды, воски, пигменты и др.) легко экстрагируются из тканей этиловым эфиром, хлороформом или бензолом, растворителями, которые не допускают ассоциации липидов, обусловленной их гидрофобными свойствами. Мембранные липиды эффективнее экстрагируются более полярными растворителями, такими как этанол или метанол, которые уменьшают гидрофобные взаимодействия между липидными молекулами, ослабляя в то же время водородные связи и электростатические взаимодействия, связывающие мембранные липиды с мембранными белками. Наиболее часто применяемым экстракционным агентом является смесь хлороформа, метанола и воды в соотношении (1:2:0,8 по объему). В этом соотношении растворители хорошо смешиваются, образуя одну фазу. После того как ткань гомогенизируют в растворителе для экстракции всех липидов, к полученному экстракту добавляют некоторое количество воды, и смесь расслаивается на две фазы — водно-метанольную (верхняя фаза) и хлороформенную (нижняя фаза). Липиды остаются в хлороформенном слое, а более полярные молекулы, такие как белки и сахара, попадают в водно-метанольный слой.

Методом адсорбционной хроматографии разделяют липиды разной полярности

Сложные смеси тканевых липидов можно разделить на фракции с помощью хроматографических методов, основанных на различной полярности липидов разных типов. В адсорбционной хроматографии (рис. 10-24, б) нерастворимый полярный материал, такой как силикагель (форма кремниевой кислоты Si(ОН)₄), помещают в стеклянную колонку, а смесь липидов (в виде хлороформенного раствора) добавляют в верхнюю часть колонки. (При высокоэффективной жидкостной хроматографии колонка меньшего диаметра, а растворители продавливаются через колонку под высоким давлением.) Полярные липиды прочно связываются с полярной кремневой кислотой, нейтральные же липиды проходят через колонку и выходят при первой промывке хлороформом. Затем вымываются полярные липиды, они выходят в порядке увеличения полярности при промывании колонки растворителями с постепенно возрастающей полярностью. Незаряженные, но полярные липиды (например, цереброзиды) вымываются ацетоном, а очень полярные или заряженные липиды (такие как глицерофосфолипиды) элюируются метанолом.

В тонкослойной хроматографии на кремневой кислоте используется тот же принцип (рис. 10-24, в). Тонкий слой силикагеля распределен по стеклянной пластинке, к которой он прилипает. Небольшое количество липидов, растворенных в хлороформе, наносят близко к краю пластинки, которую погружают в плоский контейнер с органическим растворителем или смесью растворителей. Все это находится внутри камеры, насыщенной парами растворителя. Поднимаясь по пластинке вследствие капиллярного эффекта, растворитель несет с собой липиды. Менее полярные липиды продвигаются дальше, так как они обладают меньшим стремлением к связыванию с кремниевой кислотой. Разделенные липиды можно обнаружить, опрыскивая пластинку красителем (родамином), который флуоресцирует при связывании с липидами, или выдерживая липиды в парах иода. Иод обратимо реагирует с двойными связями в жирных кислотах, так что липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты, дают желтую или коричневую окраску. Для обнаружения специфических липидов используется ряд других реагентов. Для последующего анализа участки, содержащие разделенные липиды, соскабливают с пластинки, и вновь экстрагируют липиды органическим растворителем.

Рис. 10-24. Обычные процедуры при экстракции, разделении и идентификации клеточных липидов, а) Ткань гомогенизируют в смеси хлороформ/метанол/вода. После добавления воды и удаления неэкстрагируемого осадка центрифугированием получаются две фазы. Различные типы экстрагированных липидов в хлороформенной фазе могут быть разделены адсорбционной хроматографией (б) на колонке из силикагеля, через которую пропускаются растворители с увеличивающейся полярностью, или (в) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), когда липиды переносятся восходящим фронтом растворителя вверх по пластинке, покрытой силикагелем, при этом менее полярные липиды проходят дальше, чем более полярные или заряженные. При использовании подходящих растворителей ТСХ можно применить для разделения родственных липидов; например, заряженные липиды фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и фосфатидилинозит легко разделяются методом ТСХ.

Для определения состава жирных кислот липидная фракция, содержащая связанные сложноэфирной связью жирные кислоты, переэтерифицируется в горячем водном растворе NаОН и метанола (г) для получения смеси метиловых эфиров жирных кислот. Эти метиловые эфиры затем разделяют по длине углеродной цепочки и степени ненасыщенности методом (д) газожидкостной хроматографии (ГЖХ) или методом (е) высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение молекулярной массы с помощью масс-спектрометра делает возможным однозначно идентифицировать индивидуальные липиды.

Методом газожидкостной хроматографии разделяют смеси летучих производных липидов

Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) разделяют летучие компоненты смеси в соответствии с их относительной способностью растворяться в инертном материале, наполняющем хроматографическую колонку, улетучиваться и двигаться через колонку с потоком инертного газа, например, гелия. Некоторые липиды летучи от природы, но большинство приходится сначала подвергать превращению в производные с увеличенной летучестью (т. е. более низкой температурой кипения). Для анализа жирных кислот образец фосфолипидов сначала нагревают в смеси метанол/НСl или метанол/NаОН, при этом жирные кислоты, связанные сложноэфирной связью с глицерином, превращаются в метиловые эфиры (происходит переэтерификация; рис. 10-24, г). Эти метиловые эфиры жирных кислот затем загружают в газожидкостную хроматографическую колонку, колонку нагревают, чтобы сделать компоненты летучими. Эфиры жирных кислот, которые лучше растворяются в материале, наполняющем колонку, переходят в раствор; менее растворимые липиды уносятся потоком инертного газа и первыми выходят из колонки. Порядок элюирования зависит от природы твердого адсорбента в колонке и от температуры кипения компонентов липидной смеси. Таким образом удается полностью разделить на компоненты смеси жирных кислот с различной длиной углеродной цепи и различной степенью ненасыщенности (рис. 10-24, д).

Специфический гидролиз помогает определить структуру липида

Некоторые классы липидов при определенных условиях подвергаются деградации. Например, все жирные кислоты, связанные сложноэфирной связью в триацилглицеридах, фосфолипидах и эфирах стеринов, высвобождаются посредством мягкой обработки кислотами или щелочами, а при несколько более жестких условиях гидролиза высвобождаются связанные амидной связью жирные кислоты из сфинголипидов. Ферменты, которые специфически гидролизуют определенные липиды, также используются при установлении структуры липида. Каждая из фосфолипаз А, С и D (рис. 10-16) расщепляет определенные связи в фосфолипидах с образованием продуктов, обладающих характерными растворимостью и хроматографическим поведением. Например, фосфолипаза С высвобождает растворимый в воде фосфорилированный спирт (так, из фосфатидилхолина получается фосфохолин) и растворимый в хлороформе диацилглицерин. Каждый из них можно охарактеризовать по отдельности для определения структуры исходного фосфолипида. При комбинации специфического гидролиза и анализа продуктов гидролиза с помощью методов тонкослойной, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографии часто удается расшифровать структуру липида.

Методом масс-спектрометрии можно полностью расшифровывать структуру липида

Для однозначного определения длины углеводородной цепочки или положения двойных связей применяют метод масс-спектрометрического анализа липидов или их летучих производных. Химические свойства родственных липидов (например, двух жирных кислот, близких по длине углеродной цепи и с ненасыщенными связями в разных положениях, или двух изопреноидов с разным числом изопреновых единиц) очень сходны. Их положение на хроматограммах часто не даст возможности обнаружить различия между ними. Однако, когда элюат, выходящий с хроматографической колонки, анализируют с помощью масс-спектрометрии, можно одновременно разделить и идентифицировать компоненты липидной смеси по характерной картине фрагментации (рис. 10-25).

Рис. 10-25. Определение структуры жирной кислоты с помощью масс-спектрометра. Жирная кислота превращается в производное, обеспечивающее минимизацию миграции двойных связей в процессе фрагментации молекулы электронной бомбардировкой. Производное — пиколиновый эфир линолевой кислоты (18:2(∆ 9,12 ); Мr =371) содержит спирт пиколинол (красный цвет). При бомбардировке потоком электронов эта молекула превращается в исходный ион (М + ; Мr = 371), в котором атом N несет положительный заряд и ряд более мелких фрагментов, образующихся при разрыве связей С-С в жирной кислоте. Масс-спектрометр разделяет эти заряженные фрагменты в соответствии с соотношением масса/заряд (m/z). (Для ознакомления с основами масс-спектрометрии см. доп. 3-2.)

Читайте также: Чем можно убрать жир засохший с ткани

На масс-спектре хорошо выявляются ионы с m/z = 92,108,151 и 164. Они содержат пиридиновое кольцо пиколинола и различные фрагменты карбоксильной группы. Это доказывает, что изучаемое соединение действительно пиколиновый эфир. Молекулярный ион (m/z = 371) подтверждает присутствие жирной кислоты С-18 с двумя двойными связями. Одинаковая группа ионов с массой 14 единиц (u) представляет потерю каждой последующей метильной или метиленовой группы с метильного конца ацильной цепочки (начиная с С-18; здесь — правый конец молекулы), пока не достигается ион с m/z = 300. Затем следует интервал в 26 единиц u — углеводороды с двойной связью в конце цепи, m/z = 274; далее интервал в 14 единиц u — отщепление метиленовой группы С-11, m/z = 260 и т. д. Таким образом определяют полную структуру, хотя одни только эти данные сами по себе не дают информации о конфигурации (цис- или транс-) двойных связей.

Липидомика занимается классификацией липидов и их функций

При изучении биологической роли липидов в клетках и тканях важно знать, какие липиды и в каком количестве присутствуют в данной клетке или ткани, а также каким образом липидный состав меняется в процессе эмбрионального развития, при различных заболеваниях и при приеме определенных лекарств. Современным ученым, занимающимся изучением липидов, известны уже тысячи природных липидов, поэтому была введена новая система номенклатуры, позволяющая упростить использование баз данных липидных структур. В этой системе каждый липид относят к одной из восьми групп (табл. 10-3), обозначаемых двумя буквами. Внутри групп липиды распределены по классам и подклассам с соответствующими номерами. Например, все глицерофосфохолины имеют обозначение GР01; глицерофосфохолины с двумя жирными кислотами в сложноэфирной связи обозначаютGР0101, а те, что имеют один остаток жирной кислоты, присоединенный по положению 1, а другой остаток, присоединенный по положению 2, обозначают GР0102. Жирные кислоты обозначают номерами, так что каждый конкретный липид имеет свой собственный идентификаци

онный номер, и все липиды, включая еще не открытые, могут быть однозначно описаны с помощью 12-значного идентификационного номера. Одним из факторов, учитывающихся в данной классификации, является природа вещества- предшественника в биосинтезе. Например, пре- нолы (такие как долихолы и витамины Е и К) образуются из изопренильных предшественников. К поликетидам, не обсуждавшимся в данной главе, относятся некоторые природные вещества (среди них много токсичных), путь биосинтеза которых связан с биосинтезом жирных кислот. Восемь категорий, представленных в табл. 10-3, не совпадают полностью с той классификацией по биологическим функциям, которой мы пользовались в настоящей главе. Например, к структурным липидам мембран мы отнесли как глицерофосфолипиды, так и сфинголипиды, а в табл. 10-3 они попали в разные категории. Заметим, что у каждого способа классификации есть свои преимущества.

Таблица 10-3. Восемь основных категорий природных липидов

Методы выявления липидов в тканях

Собирательный термин «липиды» охватывает жиры (т.е. триглицериды) и жироподобные вещества растительного и живот­ного происхождения. Это преимущественно неполярные соеди­нения, основным компонентом которых являются жирные кислоты. Липиды нерастворимы или плохо растворимы в воде, но хорошо растворяются в типичных жирорастворителях: бензине, хлороформе, четыреххлористом углероде, ацетоне, эфире, петролейном эфире, горячем спирте и т.п. Не все липиды раство­римы в указанных растворителях одинаково, на этом основаны дифференциальная экстракция липидов и выявление их с помо­щью жирорастворимых красителей.

С учетом гистохимических свойств и химической структуры липиды делят на простые (нейтральные жиры, воски, стериды) и сложные (фосфолипиды, цереброзиды, ганглиозиды, сульфолипиды).

Гистохимическая идентификация липидов

Гистохимическое выявление липидов возможно с помощью физических и химических методов. К физическим относятся мето­ды экстракции, поляризационная микроскопия и окрашивание жирорастворимыми красителями, к химическим — подавляю­щее большинство гистохимических методов выявления липидов, направленных главным образом на определение активных функциональных групп.

В основе методов экстракции липидов лежат законы раствори­мости, известные из аналитической органической химии. Их не­обходимо также учитывать при подготовке тканей для проведе­ния гистохимического анализа липидов. Первые потери водо­растворимых липидов происходят уже при фиксации в альдеги­дах или тетраоксиде осмия и продолжаются в процессе обезво­живания и заливки. После первичной фиксации в тетраоксиде осмия вымываются главным образом насыщенные липиды. Осо­бенно велики суммарные потери липидов в тканях, фиксирован­ных в альдегидах. После двойной фиксации в альдегидах и тет­раоксиде осмия достигается хорошая стабилизация структур, содержащих ненасыщенные липиды. Наибольшие потери липи­дов наблюдаются во время пропитки ткани парафином и эпок­сидными смолами, но их можно уменьшить путем более быстро­го обезвоживания и замены этанола на ацетон. Стабилизация липидов может быть значительно усилена путем добавления к альдегидной фиксирующей смеси хлорида кальция, как, напри­мер, в кальций-формоле по Бейкеру или при использовании хроматов, способных окислять ненасыщенные липиды, как в фиксаторе Элфтмана, содержащем бихромат калия и сулему. Хорошо сохраняются фосфолипиды при фиксации с одновре­менным обезвоживанием в ацетоне с 0,65 % хлоридом магния.

Управляя процессом экстрагирования липидов и применяя его в сочетании с методами окрашивания, гистохимия обеспечи­вает контроль специфичности окрашивания и дифференциро­ванно выявляет различные липидные фракции.

Экстракция липидов по Кейлигу позволяет провести разде­ление четырех фракций липидов, при этом тонкие, нефиксиро­ванные кусочки ткани обрабатывают четырьмя растворителями:

а) холодным ацетоном (удаляет глицериды, холестерин, холестериды и кетостероиды);

б) горячим ацетоном (удаляет цереб­розиды);

в) горячим эфиром (удаляет лецитины и кефалины) ;

г) горячим метанол-хлороформом (удаляет все липиды).

Применяют по три порции каждого растворителя, сменяя их соответственно через 3, 3 и 12 ч. Для горячих растворителей можно использовать аппарат Сокслета или более простой при­бор. После экстракции кусочки ткани промывают водой, и криостатные срезы окрашивают раствором судана черного В в 70 % спирте. Следует помнить, что при использовании этого метода не удается полностью исключить диффузию, что затрудняет точную локализацию липидов, однако все же они остаются в срезе и окрашиваются Суданом.

Экстракция пиридином по Бейкеру обеспечивает удаление всех липидов. Ее проводят на тонких кусочках ткани, фиксиро­ванных слабым раствором фиксатора Буэна в течение 20 ч. После фиксации их следует промыть в спирте для удаления пикриновой кислоты, обработать пиридином сначала при ком­натной температуре 30 мин, затем при 60С 20 ч, промыть в проточной воде в течение 2 ч, перенести в бихромат-кальциевый раствор (5 % бихромат калия и 1 % хлорид кальция на дистил­лированной воде) и окрасить материал Суданом и черным В или любым другим жировым красителем.

Разработаны приемы липидной экстракции, обеспечивающие хорошую ультраструктурную сохранность ткани для целей электронно-микроскопической гистохимии.

Поляризационная микроскопия липидов

В нативном состоянии большинство нейтральных липидов нахо­дится в жидком состоянии и не дает двойного лучепреломления в поляризованном свете; это свидетельствует об их аморфном (изотропном) состоянии. Однако при охлаждении нейтральные липиды переходят в анизотропное состояние и могут образовы­вать двоякопреломляющие кристаллы. При поворачивании предметного столика поляризационного микроскопа с исследуе­мым препаратом на 360° можно отметить четыре положения, при которых интенсивность пришедшего света минимальна. По­добным образом ведут себя все липиды. Если же в препарате выявляется анизотропный эффект мальтийского креста, то можно сделать вывод о присутствии фосфатидов, цереброзидов или эфиров холестерина. В целом же возможности этого метода ограничены.

Флюоресцентная микроскопия липидов

Небольшая часть липидов обладает собственной, или первич­ной, флюоресценцией в ультрафиолетовом свете. Липопигмен-ты светятся желтым или желто-зеленым светом, липиды с рас­творенным каротином дают зеленую флюоресценцию, так же как и стероидные гормоны, но зеленая флюоресценция послед­них меняется во времени. Практическое значение имеет выявле­ние витамина А.

Методы вторичной флюоресценции, в основе которых лежит растворение флюоресцирующих веществ (флюорохромов) в ли­пидах тканей, позволяют устанавливать присутствие липидов в клетках и тканях точнее, чем многие другие методы. С этой целью использовали ряд флюоресцирующих красителей, в том числе метиленовый синий, тиофлавин, родамин В, бенгальский розовый, фосфин 3R, бензпирен и др. Возможность применения водных растворов таких красителей обеспечивает сохранность самых мелких капелек жира. С помощью этого метода выявля­ют липиды и липопротеиды в очень низких концентрациях. Особенно это относится к флюорохромированию бензпиреном. Этот высокочувствительный метод позволяет выявлять липиды в тонких структурах, входящих в состав липопротеидных ком­плексов или тонкодисперсных образований.

Выявление бензпиреном по Бергу

1. Материал фиксируют в формалине или кальций-формоле.

Срезы толщиной 10 мкм получают на замораживающем микро­томе.

2. Обрабатывают срезы в течение 20 мин раствором бензпирен-кофеина (к 100 мл насыщенного отфильтрованного 1,5 % раствора кофеина в воде добавляют 0,002 г 3,4 бензпирена; рас­твор выдерживают 2 дня при 37 °С, отфильтровывают и разво­дят равным объемом дистиллированной воды. Оставляют на 2 ч и вновь фильтруют. Колбу с раствором плотно закрывают и по­мещают в темное место; в таком виде его можно хранить не­сколько месяцев).

3. Срезы быстро промывают в дистиллированной воде.

4. Заключают под покровное стекло с водой и сразу же ис­следуют под флюоресцентным микроскопом.

липиды выделяются своей синей или бело-синей флюоресценцией.

Примечание. Этот метод не позволяет дифференциро­вать липиды разных классов; цвет флюоресценции — от сине-зеленой до бело-синей и бело-желтой, по-видимому, зависит от концентрации липидов.

Флюорохромирование липидов фосфином 3R

Флюорохром —фосфин 3R — обусловливает яркую серебристо-белую флюоресценцию, которую легко отличить от естествен­ной флюоресценции тканей, даже не пользуясь контрольными препаратами сравнения.

1. Материал фиксируют в кальций-формоле. Срезы толщи­ной 10 мкм готовят на замораживающем микротоме.

2. Срезы помещают в дистиллированную воду, затем обраба­тывают 0,1 % водным раствором фосфина 3R.

3. Быстро промывают в дистиллированной воде.

4. Заключают в 90 % глицерин или дистиллированную воду, исследуют под флюоресцентным микроскопом.

липиды, включая эфиры холестерина, дают се­ребристо-белую флюоресценцию. Исключение составляют жир­ные мыла и холестерин.

Окраска жирорастворимыми красителями

Для всех жировых красителей единственным общим признаком является отсутствие солюбилизирующих сульфогрупп (—SO3H) или карбоксильных (-СООН)-групп. Это диазокрасители, в ос­новном красного цвета.

Судан черный В обладает более выраженными, чем суданы III и IV, красящими свойствами, хотя он может давать и гораз­до более слабое окрашивание белков и кислых ГАГ.

Окраска Суданом черным по Лизону

1. Материал фиксируют в кальций-формоле, готовят срезы на замораживающем микротоме или заливают в поливакс.

2. Промывают срезы в 70 % спирте.

3. Окрашивают Суданом черным (насыщенный раствор Суда­на В в 70 % спирте, профильтрованный перед использованием) 20 — 30 мин.

4. Промывают в 70 % спирте 30 с.

5. Быстро промывают в дистиллированной воде.

6. Окрашивают 1 % ядерным прочным красным 1 мин.

7. Быстро промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин или глицерин.

липиды окрашиваются в цвета от черного до тем­но-синего,

ядра — в красный цвет; окраску воспринимают так­же фосфолипиды.

Для контроля неспецифического окрашивания за счет ад­сорбции используют экстракцию ацетоном или этанолом.

Окраска масляным красным О в изопропаноле по Лилли

1. Материал фиксируют в кальций-формоле, срезы получа­ют на замораживающем микротоме.

2. Срезы переносят в дистиллированную воду и быстро про­мывают в 60 % изопропаноле.

3. Срезы окрашивают 10 — 20 мин в растворе масляного крас­ного О (0,05 г масляного красного О растворяют в 100 мл 98 % изопропанола, перед использованием разводят дистиллированной водой в пропорции 6:4, выдерживают 24 ч и затем фильтруют).

4. Быстро дифференцируют в 60 % изопропаноле или сразу же промывают в дистиллированной воде.

5. Промывают в проточной воде 10 мин.

6. Срезы заключают в глицерин-желатин.

нейтральные жиры окрашиваются в красный цвет, ядра — в синий.

Масляный красный О можно также ис­пользовать в виде насыщенного отфильтрованного раствора в 70 % спирте. Вместо масляного красного О можно применять масляный красный 7В, который окрашивает липиды в ярко-красный цвет. В качестве растворителей для жировых красите­лей используют 55 — 70 % спирт, 65 — 98 % изопропанол, пропиленгликоль, а также смесь Герксхаймера, состоящую из равных частей 70 % спирта и ацетона.

Гистохимическое выявление фосфолипидов

Для гистохимического выявления фосфолипидов наиболее пригодны методы с использованием кислого гематеина. По ме­тоду Бейкера ткани после фиксации в кальций-формоле подвер­гают длительному хромированию в бихромат-кальциевой смеси, в результате чего фосфолипиды образуют нерастворимые ком­плексы с хромом. Эти комплексы реагируют с кислым гематеипом, который получают при окислении гематоксилина метайодатом натрия. Связанный с фосфолипидами хром, взаимодейст­вуя с кислым гематеином, образует соединение хром-гематеин темно-синего цвета.

Окраска фосфолипидов кислым гематеином Бейкера

1. Кусочки размером 2 — 4 мм фиксируют в 2 сменах ацетона с 0,65 % раствором хлорида магния по 60 мин.

2. Помещают в ксилол — 2 смены по 5—10 мин.

3. Переносят в горячий парафин — 2 смены по 30 мин.

4. Заливают в парафин и получают срезы.

5. Срезы проводят через ксилол — 2 смены по 5 мин.

6. Помещают в ацетон с 0,65 % раствором хлорида магния -2 смены по 5 мин.

7. Переносят в дистиллированную воду — 2 смены по 1 мин.

8. Помещают срезы в 5 % раствор бихромата калия при 60 °С на 4 ч.

9. Промывают в нескольких сменах дистиллированной во­ды.

10. Помещают срезы при температуре 37 °С на 0,5 — 5 ч в раствор кислого гематеина (50 мг кристаллического гематокси­лина растворяют в 50 мл 0,1 % раствора метайодата натрия при нагревании до кипения, охлаждают и добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты).

11. Промывают в дистиллированной воде.

12. Дифференцируют при комнатной температуре в 0,25 % водных растворах дибората натрия, декагидрата и гексациано-феррата калия 18 ч.

13. Промывают в дистиллированной воде.

14. Обезвоживают в 2 сменах ацетона с 0,65 % хлоридом маг­ния по 5 мин.

15. Проводят через 2 смены ксилола по 5 мин и заключают в бальзам.

фосфолипиды окрашиваются в черно-синие тона.

Окраска железным гематоксилином по Элледеру и Лойде для выявления фосфолипидов

1. Срезы получают на замораживающем микротоме.

2. Срез А в сухом состоянии обрабатывают 10 мин при тем­пературе от 0 до 4 «С абсолютным ацетоном и высушивают на воздухе.

Срез Б при комнатной температуре обрабатывают 10 мин смесью хлороформа с метанолом, а затем быстро промывают в ацетоне и дистиллированной воде.

3. Срезы А и Б фиксируют в кальций-формоле (5—10 мин), а затем промывают в дистиллированной воде.

4. Оба среза окрашивают смесью растворов I (3 части) и II (1 часть) 6-8 мин.

298 мл дистиллированной воды + 2 мл концентри­рованной соляной кислоты + 2,5 г дихлорида железа гексагидрата + 4,5 г сульфата железа гептагидрата.

1 г гематоксилина растворяют при слабом нагре­вании в 100 мл дистиллированной воды.

5. Промывают в дистиллированной воде, затем несколько раз в 0,2 % растворе соляной кислоты.

6. Хорошо промывают в проточной воде.

7. Заключают под покровное стекло в глицерин-желатин или после обезвоживания в ацетоне и просветления в ксилоле — в бальзам.

Результат: фосфолипиды окрашиваются в темно-синий цвет. Их можно идентифицировать, лишь сравнив с окрашиванием срезов, обработанных ацетоном и смесью хлороформа с метано­лом; последние не должны давать окрашивания, обусловленно­го присутствием липидов.

Можно использовать также замороженные срезы тканей, фиксированных в формалине. Перед экстракцией ацетоном такие срезы следует подсушить. Продолжительность экстра­кции в смеси хлороформа с метанолом после фиксации в фор­малине должна составлять 1 —2 ч. С помощью обработки срезов гидроксидом натрия после экстракции ацетоном удается вы­явить сфингомиелин. Плазмалогены можно удалять с помощью гидролиза в 1 % водном или солянокислом (1 и.) растворе суле­мы в течение 10 мин. Преимуществом этого метода являются быстрота и надежность.

Выявление ненасыщенных липидов

Для гистохимического выявления важна легкая окисляемость ненасыщенных липидов. Продуктом окисления непредельных связей липидов, проводимого с помощью надмуравьиной или надуксусной кислоты, в большинстве случаев являются альде­гидные группы, которые могут быть выявлены с помощью реак­тива Шиффа.

Непредельные связи в липидах ответственны также за вос­становление тетраоксида осмия и за превращение его в диоксид осмия (осмиевую чернь).

На связывание тетраоксида осмия, по-видимому, влияет также ориентация липидных молекул в тканях. На этом прин­ципе основан тест Марчи с тетраоксидом осмия на дегенерирванный миелин. Механизм реакции Марчи был детально изучен Adams (1959), который разработал метод одновременного выяв­ления нормального и дегенерированного миелина с помощью тетраоксида осмия и alfa-нафтиламина.

По Adams, гидрофобные липиды дегенерированного миелина окрашиваются в черный цвет в результате восстановления оксида осмия до его тетраок­сида. Гидрофильные липиды нормального миелина окрашива­ются в красный цвет в связи с образованием хелата осмий-alfa-нафтиламина. Таким образом, этот метод позволяет различать три типа липидов: ненасыщенные гидрофобные (черный цвет), не­насыщенные гидрофильные (красный цвет) и насыщенные (бес­цветные). К первому типу относятся олеиновая кислота, трио-леин и олеат холестерина, ко второму — лецитин, кефалин, сфингомиелин и цереброзид, к третьему — стеариновая кисло­та, тристеарин, стеарат холестерина и холестерин.

Если перед реакцией по Адамсу провести гидролиз в 2 н. гидроксида натрия при 37 °С в течение 1 ч, то окрашиваются только устойчивые к щелочному гидролизу липиды, из которых наиболее важным в биологическом отношении является сфинго­миелин; также, по-видимому, окрашивается кефалин В.

Окраска с применением тетраоксида осмия

и alfa-нафтиламина по Адамсу

1. Материал фиксируют в кальций-формоле, срезы толщи­ной 10—15 мкм получают на замораживающем микротоме.

2. Обрабатывают свободноплавающие срезы 18 мин в смеси, в состав которой входят 1 часть 1 % тетраоксида осмия и 3 части 1 % перхлората калия.

3. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.

4. Срезы монтируют на покровные стекла.

5. Обрабатывают 10 — 20 мин при 37 °С насыщенным водным раствором alfa-нафтиламина (готовят путем добавления а-нафтил-амина к дистиллированной воде и последующего фильтрования после нагревания до 40 °С).

6. Промывают в дистиллированной воде 5 мин.

7. Окрашивают 2 % альциановым синим в 5 % уксусной кис­лоте от 15 до 60 с (под контролем микроскопии).

8. Заключают в глицерин-желатин.

фосфолипиды окрашиваются в оранжево-крас­ный цвет, эфиры холестерина и триглицериды — в черный.

Гидрофобные липиды, окрашенные в черный цвет, во многих случаях могут маскировать имеющиеся в тканях фосфолипиды. В результате гидролиза свободноплава­ющих срезов в 2 н. растворе гидроксида натрия в течение 1 ч при 37 «С глицерофосфолипиды вымываются, а устойчивые к действию щелочи сфингомиелины сохраняются и окрашиваются в оранжевый цвет. Этот метод выявления надежен лишь при ус­ловии предварительной фиксации срезов в абсолютном ацетоне.

Для гистохимического выявления холестерина применяют метод Адамса с хлорной кислотой и нафтохиноном, а также метод Шультца. В основе последнего лежит окисление холесте­рина до оксихолестерина под действием ультрафиолетового из­лучения (в первоначальном варианте) или аммонийных квас­цов. Хотя с помощью реакции Шультца выявляют не только хо­лестерин и его эфиры, метод можно считать достаточно специ­фичным.

Модифицированная реакция Шультца для выявления

1. Материал фиксируют в кальций-формоле 2 — 3 дня в холо­дильнике. Срезы толщиной 20 — 30 мкм получают на заморажи­вающем микротоме.

2. Свободноплавающие срезы промывают в нескольких сме­нах дистиллированной воды 24 ч.

3. Срезы помещают на 7 дней при 37 «С в забуференный рас­твор железоаммонийных квасцов [2,5 % раствор железоаммонийных квасцов (фиолетовые кристаллы) в 0,2 М ацетатном бу­фере, рН 3,0; окончательная величина рН раствора около 2,0].

4. Срезы промывают в 0,2 М ацетатном буфере — 3 смены по 1 ч.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Переносят в 5 % раствор формалина на 10 мин, а затем монтируют на предметные стекла, осторожно давая жидкости стечь, просушивают фильтровальной бумагой.

7. На покровное стекло наносят одну каплю, смеси равных частей химически чистых уксусной и серной кислот (серную кислоту осторожно, по каплям, добавляют к уксусной кислоте, при этом колбу лучше охлаждать на ледяной бане). Переверну­тое предметное стекло со срезом осторожно кладут на покров­ное и слегка прижимают так, чтобы жидкость равномерно рас­пределилась по срезу.

8. Препарат сразу же исследуют под микроскопом.

холестерин и его эфиры через несколько секунд приобретают сине-зеленое окрашивание, через 30 — 60 мин цвет меняется на синий.

Свободный холестерин и другие Зbetta-оксистерины могут быть выявлены также на ультраструктурном уровне благодаря их способности образовывать нерастворимые в воде соединения с дигитоксином. Эту реакцию проводят одновременно с альдегид­ной фиксацией или после нее.

Плазмалогены, или ацетальфосфатиды, — это модифицирован­ные глицерофосфатиды, содержащие ненасыщенный ацеталь с альдегидом. Природа этих альдегидных групп, которые высво­бождаются из плазмалогенов под действием сулемы или мягко­го кислотного гидролиза, точно неизвестна. В основе метода Фельгена и Фойта лежит выявление реактивом Шиффа высших альдегидов, высвобождаемых из плазмалогенов после непро­должительного воздействия сулемы. Этот же принцип реакции использован в реакции Хайеса.

Плазмалевая реакция по Хайесу

1. Материал фиксируют в кальций-формоле 3 —6 ч. Срезы получают на замораживающем микротоме.

2. Срезы прикрепляют к предметному стеклу.

3. Обрабатывают в 1 — 5 % растворе сулемы 10 мин.

4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 20 мин.

6. Промывают срезы в 3 сменах сернистой воды по 1 мин.

7. Промывают в проточной воде 20 мин.

8. Заключают под покровное стекло в глицерин-желатин.

в срезах, обработанных сулемой, плазмалогены

окрашиваются в красно-фиолетовый цвет.

Контрольные срезы после п. 2 переносят непосредственно в реактив Шиффа; эти срезы, не обработанные раствором сулемы, должны оставаться неокрашенными.

Примечание. Появление красноватого окрашивания — признак псевдоплазмалевой реакции, обусловленной окислением ненасыщенных липидов. Высвобождаемые в результате гидроли­за липиды блокируются с помощью соответствующих реакций со­четания. Реактив Шиффа можно заменить фенилгидразином.

От плазмалевой реакции следует отличать псевдоплазмалевую реакцию тканевых и клеточных компонентов, окрашивае­мых реактивом Шиффа при различных условиях.

Химическая природа соединений, дающих псевдоплазмалевую реакцию, не­известна. Lison (1953) выделяет две группы таких соединений. К первой относятся соединения, окрашиваемые реактивом Шиффа без предварительной обработки, содержащиеся в эластиновых волокнах, миелине, некоторых клетках гипофиза, ци­топлазме яйцеклеток и нервных волокнах. Во вторую группу входят соединения, реагирующие с реактивом Шиффа после предварительной обработки. В первую очередь это липиды, легко окисляемые йодной кислотой и некоторыми другими сла­быми окислителями.

Обычная формалиновая фиксация подавляет плазмалевую реакцию. Интенсивность последней, наоборот, увеличивается при продолжительной фиксации формалином.

Выявление жирных кислот и триглицеридов

Для гистохимического выявления жирных кислот существуют два подхода: образование солей красителя в реакциях жирных кислот с некоторыми основными красителями и омыление жир­ных кислот солями металлов. Более интенсивно разрабатывает­ся второй подход.

В методе Хольцингера ионы меди, связываемые жирными кислотами, выявляются рубеановодородной кислотой, которая образует с ними окрашенное комплексное соединение.

Выявление жирных кислот по Хольцингеру

1. Срезы нефиксированного материала получают на замора­живающем микротоме.

2. Обрабатывают 0,05 % водным раствором ацетата меди 3 — 5 ч.

3. Промывают в 2 сменах 0,1 % раствора динатриевой соли ЭДТА при рН 7,1 по 10 с.

4. Промывают в дистиллированной воде.

5. Обрабатывают в течение 10 мин в 0,1 % растворе рубеано­водородной кислоты в 70 % спирте (100 мл рубеановодородной кислоты растворяют в 70 мл абсолютного спирта при легком на­гревании, после охлаждения раствор доводят до 100 мл дистил­лированной водой).

6. Промывают несколько минут в 70 % спирте, а затем в дис­тиллированной воде.

7. Окрашивают (в случае необходимости) ядерным прочным красным.

8. Заключают в глицерин-желатин.

Можно обезводить в спиртах возрастающей концентрации, провести через ксилол и заключить в бальзам.

жирные кислоты окрашиваются в зеленовато-чер­ный цвет.

Реакция омыления лежит также в основе метода Адамса для выявления жирных кислот триглицеридов. При этом эфирные связи триглицеридов сначала расщепляются липазой, а затем высвободившиеся жирные кислоты переводятся в осадок в виде нерастворимых кальциевых мыл. С целью электронно-микро­скопического выявления проводят обмен оснований с образова­нием свинцовых мыл. Для обнаружения продуктов гистохими­ческой реакции в световой микроскопии препарат обрабатывают раствором сульфида аммония с образованием коричневого осад­ка сульфида свинца. Специфичность этой реакции может быть проконтролирована с помощью ингибиторов липазы: 0,01 М растворов цинка, свинца, меди и ЭДТА.

Выявление триглицеридов по Адамсу

1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в течение 4 ч при 4 °С в 3 % глутаровом альдегиде на 0,067 М какодилатном бу­фере (рН 7,4).

2. Промывают в 7,5 % сахарозе на буфере в течение 18 ч.

3. Срезы толщиной 50 мкм получают на замораживающем микротоме.

4. Срезы инкубируют в течение 30 мин в среде, в состав ко­торой входят 50 мг панкреатической липазы, 10 мл 2 % раство­ра хлорида кальция, 15 мл 0,2 М трис-буфера (рН 7,0) и 25 мл дистиллированной воды.

5. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

6. Помещают срезы на 15 мин в 1 % раствор нитрита свинца.

7. Промывают в дистиллированной воде,

8. Дополнительно фиксируют в 1 % растворе тетраоксида осмия в течение 18 ч.

в участках прохождения реакции выявляются оп­тически плотные игольчатые кристаллы свинцового мыла.

• Свежие записи
  • Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
  • Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
  • Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
  • Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
  • Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом