Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3
4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Методы обнаружения вирусов при культивировании их в культуре ткани, в организме чувствительных лабораторных животных, в курином эмбрионе. Методы титрования вирусов.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток.Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.
Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.
Куриные эмбрионы.Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.
Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.
О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные.Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.
2.Культивирование вирусов в культуре ткани
Характеристика культур тканей. Культуры тканей (или культуры клеток)- это клетки тканей, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др., а также культуры клеток злокачественных опухолей). Для выращивания культур клеток наибольшее распространение получили синтетические и полусинтетические среды, которые содержат все необходимые вещества (соли, витамины, аминокислоты и т.д.). Например, среда 199, среда Игла, раствор альбумина бычьей плазмы, солевой раствор Хенкса с сывороткой.
Однослойные первичные культуры тканей — это взвесь клеток, полученная путем обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папаин и др.). Трипсинизацией достигается разделение клеток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду, растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани.
Перевиваемые клетки — это культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях мира имеется много перевиваемых культур, полученных из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Hela- клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер -2- клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штаммы клеток Детройт 6- клетки, выделенные из костного мозга человека больного раком легких;
4) штаммы клеток А-О и А-I- клетки амниона человека; 5) штаммы клеток СОЦ- клетки сердца обезьяны и др.
Техника заражения культур клеток состоит в следующем. Берут пробирку с заранее выращенной монослойной культурой клеток. Вирус (например, вирус вакцины) разводят средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой клеток стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят 1 мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают помещают в термостат в горизонтальном положении.
3.Обнаружение вирусов в культуре клеток
а) Изучение внутриклеточных включений. Универсальным методом окраски внутриклеточных включений является окраска по Манну. Внутриклеточные включения при бешенстве (тельца Негри) обнаруживается в нервных клетках аммонова рога и в клетках Пуркинье мозжечка. При окраске по Манну- тельца Негри красного цвета на голубом фоне цитоплазмы.
б) Цитопатический эффект (или цитопатическое действие)- это дегенерация клеток, возникающая под воздействием вируса размножающегося в культуре ткани. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток.
в) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности поврежденных вирусом клеток.
г) Метод бляшек предложен Дюльбеком для получения изолированных колоний вируса. Метод заключается в следующем. В специальном флаконе выращивают на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор- нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.
д) Метод флюоресцирующих антител.
Основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флюоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препараты промывают физ.раствором, подсушивают и фиксируют ацетоном. Затем обрабатывают специфической сывороткой. Просмотр препарата производят с помощью люминисцентного микроскопа. В местах локализации вируса появляется специфическое свечение под воздействием флюоресцирующих антител.
е) Обнаружение вируса в культуре ткани методом «цветной пробы».
В основу «цветной реакции» положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, сдвигающие рН среды в кислую сторону. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, метаболизм их подавляется и не происходит изменения рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7- оранжевый, рН ниже 7- желтый. Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой) рН питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. Если вирус размножается, то клетки дегенерируют и среда сохраняет исходный красный цвет.