Микроскопическое исследование ткани стало возможным благодаря работам

Микроскопия – это изучение объектов и элементов чрезвычайно малых размеров. Человеческий глаз имеет предел разрешения и детализации таких объектов, диктуемый его природными свойствами. Для преодоления этого биологического ограничения используются различные приборы-микроскопы. На сегодняшний день, одним из ведущих методов исследования микрообъектов в биологических науках является оптическая (она же световая) микроскопия. Световые микроскопы являются важнейшими инструментами как при проведение некоторых рутинных медицинских анализов, так и в биологических и медико-биологических научных исследованиях. Они незаменимы при изучении морфологических свойств микробиологических объектов, к которым относятся насекомые и их части, многие паразиты, клетки растений и животных, простейшие и бактерии. Возможность изучения топографии, морфологии, ультраструктуры позволило человеку значительно расширить свои знания о микроорганизмах. В медицине, микроскопы позволяют проводить подсчёт клеток крови, анализ биопсий на структуру, морфологию и наличие определённых включений. С применением молекулярно-биологических техник, появилась возможность выявить локализацию отдельных химических веществ.

Сущность оптических методов

Современная световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч раз, что является достаточным для изучения различных форм жизни на клеточном уровне и других биологических объектов [1, 2]. Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – минимальное расстояние, на котором находятся две точки, различаемые как раздельные объекты. Контраст –возможность различать объекты и отдельные детали от их фона. Если различие в яркости объекта и фона составляет менее 3 – 4 %, то его невозможно различить, даже если оптика микроскопа теоретически способна разрешить его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики прибора уловить возникающие различия в свойствах луча. Главным ограничением для возможностей светового микроскопа является волновая природа света, которое не позволяет увидеть объекты, размеры которых сопоставимы с волновой длиной электромагнитного излучения светового диапазона, т.е. меньше 1 микрометра.

Для различных нужд создаются оптические системы различной конструкции [3, 4]:

Прямой микроскоп является наиболее часто встречаемой конструкцией. Такая схема используется чаще всего при изучение прозрачных и полупрозрачных микрообъектов размеров, сопоставимых с клетками. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в различных областях биологии (ботанике, микробиологии, цитологии) и медицины (обычно это микробиологический и гистологический анализ материала).

Инвертированная схема микроскопа отличается от прямой тем, что в ней объективы находятся не над, а под исследуемым предметом. Это позволяет оптимизировать конструкцию инструмента для работы с достаточно большими по своему объему объектами, вроде флаконов для культивирования клеток. В зависимости от назначения и особенностей конструкции, инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и др. Подобные приборы широко используются при различных научных и лабораторных исследованиях в микробиологии и медицине.

Стереоскопические или стереомикроскопы имеют в своей конструкции два расположенных под углом объектива, и благодаря этому позволяют получать стереоскопическое изображение исследуемого объекта. Стереомикроскопы обладают существенно большей глубиной резкости, чем обычные, что позволяет использовать их для изучения относительно крупных и выпуклых микрообъектов – таких как части растений, грибов, колонии микроорганизмов. Выделяют два типа конструкции световых микроскопов: схема Грену и оптическая система с общим главным объективом.

Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле [2,5]. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. У светового микроскопа максимальная разрешающая способность составляет 0,2 мкм, что обеспечивает высокоточное увеличение микроскопа до 1500х.

Фазово-контрастная микроскопия (рис. 1) используется для получения высококонтрастных изображений прозрачных образцов, таких как живые клетки, микроорганизмы, тонкие кусочки ткани, литографические узоры, волокна, латексные дисперсии, осколки стекла и субклеточные частицы, включая ядра и другие органеллы. Метод контраста участка использует оптический механизм для того, чтобы перевести мельчайшие изменения в участке в соответствующие изменения в амплитуде, которые можно визуализировать как разницы в контрасте изображения. Одно из главных преимуществ микроскопии контраста участка в том, что живущие клетки можно рассмотреть в их естественном положении, без предварительного убийства. В результате динамика протекающих биологических процессов может наблюдаться и регистрироваться в высоком контрасте, с высокой четкостью мельчайших деталей образца.

Чтобы хорошо визуализировать эти биологические материалы, они должны иметь контраст, вызванный надлежащими показателями преломления, или окраску. Поскольку красители обычно токсичны, для достижения контраста может использоваться темная поляризационная микроскопия [2, 6]. В темнопольной микроскопии конденсатор предназначен для формирования «полого» конуса света (рис. 2). В темной микроскопии объектив находится в темной полости этого конуса, а свет распространяется вокруг объектива, но не входит в зону конуса. Все поле зрения кажется темным, но когда на предметный столик помещается образец, он кажется ярким на темном фоне. Он похож на заднее освещение объекта, который может быть того же цвета, что и фон, на котором он сидит, – чтобы он выделялся. Темнопольная микрокопия позволяет увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.

Читайте также: Образовательные ткани меристемы кратко

Рис. 1. Интернет: Stormoff, stormoff.ru, 2018

Рис. 2. Интернет: Studopedia, studopedia.ru, 2018

Лазерная конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия (рис. 3) обладает такими особенностями, как контролируемая глубина резкости, устранение шумов вне фокуса и возможность сбора последовательных оптических секций из толстых образцов [5]. Конфокальная микроскопия основана на использовании пространственной фильтрации для устранения света вне фокуса и вспышки в образцах, которые толще плоскости фокусировки. Когда флуоресцентные образцы визуализируются с использованием обычного широкополосного оптического микроскопа, вторичная флуоресценция, испускаемая образцом вдали от интересующей области, часто мешает разрешению тех объектов, которые находятся в фокусе. Конфокальный метод визуализации обеспечивает незначительное улучшение как в осевом, так и в поперечном разрешении, но также обладает способностью исключить из изображения вспышку «вторичную флуоресценцию», которая возникает в густых флуоресцентно меченых образцах. Эта особенность вызвала большой рост популярности конфокальных микроскопов. Освещение достигается путем сканирования одного или нескольких фокусированных лучей света, обычно от лазера. Изображения, полученные путем сканирования образца таким образом, называются оптическими сечениями.

Рис. 3. Интернет: 5fan, 5fan.ru, 2018

Мультифотонная микроскопия схожа с конфокальной и обеспечивает четкие преимущества для трехмерной визуализации [6]. Она хорошо подходит для визуализации живых клеток, особенно в интактных тканях, таких как срезы мозга, эмбрионы, а так же целые органы или небольшие организмы. Эффективная чувствительность флуоресцентной микроскопии, особенно при работе с толстыми образцами, как правило, ограничена вспышкой без фокуса. Это ограничение значительно сокращается в конфокальном микроскопе, с помощью конфокального отверстия для отклонения фоновой флуоресценции фокуса и получения несжатых оптических секций менее 1 микрометра. Мультифотонная микроскопия имеет преимущества: 1. Вследствие значительно меньшего поглощения тканей и клеток в ИК – области по сравнению с УФ, уменьшается повреждение живых клеток фотоиндуцированными процессами. 2. Достигается большая глубина проникновения излучения в биологические объекты. 3. Отсутствует возбуждение и выцветание флуорохромов вне фокального микрообъема, поэтому конфокальная диафрагма не требуется.

Эпоха, когда оптическая микроскопия была чисто описательным инструментом прошла. В настоящее время формирование оптического изображения является лишь первым шагом к анализу данных. Микроскоп выполняет этот первый шаг в сочетании с электронными детекторами, процессорами изображений и устройствами отображения, которые можно рассматривать как расширения системы формирования изображения. Компьютеризированное управление фокусом, сценическим положением, оптическими компонентами, ставнями, фильтрами и детекторами широко распространено и позволяет проводить экспериментальные манипуляции, которые невозможны для человека при использовании механических микроскопов. Возрастающее применение электрооптики в флуоресцентной микроскопии привело к созданию оптических пинцетов, способных манипулировать субклеточными структурами или частицами, изображениями отдельных молекул и широким спектром сложных спектроскопических приложений.

Микроскопическое исследование ткани стало возможным благодаря работам

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.

Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.

Читайте также: Плащевая ткань с мембранной пропиткой

Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.

Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).

После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).

По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.

Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.

Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.

Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.

Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).

Микроскопическое исследование ткани стало возможным благодаря работам

Гистология как самостоятельная наука выделилась в начале XIX века. Предысторию гистологии составили результаты многочисленных макроскопических (визуальных) исследований составных частей различных животных и растительных организмов. Решающее значение для становления гистологии как науки о строении тканей имело изобретение микроскопа, первые образцы которого были созданы в начале XVII века (Г. и 3. Янсены, Г. Галилей и др.). Одно из самых ранних научных исследований с помощью микроскопа собственной конструкции провел английский ученый Роберт Гук (1635-1703). Он изучал микроскопическое строение многих предметов. Все изученные объекты Р. Гук описал в книге «Микрография или некоторые физиологические описания мельчайших тел, выполненные при посредстве увеличительных стекол. «, изданной в 1665 г. Из своих наблюдений Р. Гук сделал вывод о широком распространении пузырьковидных клеток, или ячеек, в растительных объектах и впервые предложил термин «клетка».

В 1671 г. английский ученый Н. Грю (1641-1712) в своей книге «Анатомия растений» писал о клеточном строении как о всеобщем принципе организации растительных организмов. Н. Грю впервые ввел в употребление термин «ткань» для обозначения растительной массы, поскольку последняя напоминала по своей микроскопической конструкции ткани одежды. В том же году итальянец Дж. Мальпиги (1628-1694) дал систематическое и детальное описание ячеистого (клеточного) строения различных растений. В дальнейшем постепенно накапливались факты, свидетельствующие о том, что не только растительные, но и животные организмы состоят из клеток. Во второй половине XVII века А. Левенгук (1632-1723) открыл мир микроскопических животных и впервые описал красные кровяные тельца и мужские половые клетки.

На протяжении всего XVIII века происходило постепенное накопление фактов о клеточном строении растений и животных. Клетки животных тканей подробно исследовали и описали чешский ученый Ян Пуркиня (1787-1869) и его ученики в начале XIX века.

Большое значение для развития знаний о микроскопическом строении организмов имело дальнейшее усовершенствование микроскопов. В XVIII веке микроскопы производились уже в большом количестве. В Россию они впервые были привезены из Голландии Петром I. Позднее при Академии наук в Петербурге была организована мастерская по изготовлению микроскопов. Для развития микроскопии в России многое сделал М.В. Ломоносов, предложивший ряд технических усовершенствований конструкции микроскопа и его оптической системы. Вторая половина XIX века знаменательна бурным усовершенствованием микроскопической техники. Были созданы новые конструкции микроскопов, и, благодаря изобретению иммерсионных объективов (водная иммерсия стала применяться с 1850 г., масляная — с 1878 г.), разрешающая способность оптических приборов увеличилась в десятки раз. Параллельно с совершенствованием микроскопа развивалась и техника приготовления микроскопических препаратов.

Читайте также: Цветы роза пион из ткани

Если раньше объекты исследовали под микроскопом сразу после их выделения из растений или животных без какой-либо предварительной подготовки, то теперь стали прибегать к разнообразным методам их обработки, которые позволяли сохранять структуру биологических объектов. Были предложены разные способы фиксации материала. В качестве фиксирующих средств нашли применение хромовая, пикриновая, осмиевая, уксусная и другие кислоты, а также их смеси. Простой и во многих случаях незаменимый фиксатор — формалин — впервые был применен для фиксации биологических объектов в 1893 г.

Изготовление препаратов, пригодных для исследования в проходящем свете, стало возможным после разработки методов заливки кусочков в плотные среды, что облегчало получение тонких срезов. Изобретение специальных конструкций для резки — микротомов — в лаборатории Я. Пуркиня значительно улучшило технику изготовления гистологических препаратов. В России первый микротом сконструировал киевский гистолог П.И. Перемежко. Для усиления контрастности структур стали прибегать к окрашиванию срезов различными красителями. Первым гистологическим красителем, окрашивающим ядра клеток, нашедшим широкое применение (начиная с 1858 г.), был кармин. Другой ядерный краситель — гематоксилин — стал применяться с 1865 г., однако долгое время его свойства не были оценены в полной мере. Ко второй половине XIX века уже употребляли анилиновые красители, были разработаны метод импрегнации тканей нитратом серебра (К. Гольджи, 1873) и окраска нервной ткани метиленовым синим (А.С. Догель, А.Е. Смирнов, 1887).

Благодаря фиксации биологического материала и получению из него тончайших окрашенных срезов исследователи конца XIX века имели возможность значительно глубже проникнуть в тайны строения тканей и клеток, на основе чего был сделан ряд величайших открытий. Так, в 1833 г. Р. Браун открыл постоянный компонент клетки — ядро. В 1861 г. М. Шультце утвердил взгляд на клетку, как на «комочек протоплазмы с лежащим внутри него ядром». Главными составными частями клетки стали считать ядро и цитоплазму. В 70-х годах XIX века группой исследователей одновременно и независимо друг от друга был открыт непрямой способ деления клеток — кариокинез, или митоз. В работах И.Д. Чистякова (1874), О. Бючли (1875), Э. Страсбургера (1875), В. Майзеля (1875), П.И. Перемежко (1878), В. Шлейхера (1878), В. Флемминга (1879) и др. были описаны и проиллюстрированы все стадии непрямого клеточного деления. Это открытие имело большое значение для развития знаний о клетке. Оно послужило также основой для более глубокого изучения такого важнейшего биологического процесса как оплодотворение. Изучение митоза и оплодотворения привлекло особое внимание исследователей к ядру клетки и выяснению его значения в процесе передачи наследственных свойств. В 1884 г. О. Гер-твиг и Э. Страсбургер независимо друг от друга высказали гипотезу о том, что хроматин является материальным носителем наследственности.

Объектом пристального внимания ученых стали хромосомы. Наряду с изучением ядра клетки, тщательному анализу была подвергнута и цитоплазма.

Успехи микроскопической техники обусловили открытие в цитоплазме органелл — постоянных и высокодифференцированных ее элементов, имеющих определенное строение и выполняющих жизненно важные для клетки функции. В 1875-76 гг. немецким биологом О. Гертвигом и бельгийским ученым Ван-Бенеденом был открыт клеточный центр, или центросома; а в 1898 г. итальянским ученым К. Гольджи — внутриклеточный сетчатый аппарат (комплекс Гольджи). В 1897 г. К. Бенда — в животных клетках, а в 1904 г. — Ф. Мевес — в растительных клетках описали хондриосомы, которые позднее стали называться митохондриями.

Таким образом, к концу XIX века на основе успешного развития микроскопической техники и анализа данных о микроскопическом строении клетки был накоплен колоссальный фактический материал, позволивший выявить ряд важнейших закономерностей в строении и развитии клеток и тканей. В это время учение о клетке выделилось в самостоятельную биологическую науку — цитологию.

Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом