Биотехнология — это интеграция естественных и инженерных наук, позволяющая наиболее полно реализовать возможности живых организмов или их производные для создания и модификации продуктов или процессов различного назначения.
Чаще всего применяется в медицине, пищевой промышленности, также для решение проблем в области энергетики, охране окружающей среды, и в научных исследованиях.
В последние десятилетия биология бурно развивается и создаёт новые научные направления. Новое комплексное направление — физико-химическая биология, включающая в себя биохимию, биофизику, молекулярные биологию и генетику, биоорганическую химию и некоторые другие дисциплины, — не только помогает решать
задачи, которые давно ставила перед биологией производственно-техническая практика, но и намечает пути принципиально нового биологического производства.
В результате стремительного прогресса разных составных частей физико-химической биологии, возникло новое направление в науке и производстве, получившее наименование биотехнологии. Это направление сформировалось за последние два десятка лет и уже сейчас получило мощное развитие.
Особенно интенсивно биотехнология стала развиваться с 1981 года. Задачи физико-химической биологии очень обширны. Объединяет их то, что основу, суть каждой задачи составляет познание природы живого и использование в практике знаний о процессах и материальных структурах живых организмов. Стремительно расширяющиеся знания о процессах жизнедеятельности позволяют не только приспосабливать эти процессы для практических целей, но и управлять ими, а также создавать весьма перспективные в практическом отношении новые системы, не существующие в природе, хотя и аналогичные существующим.
Биотехнология в целом представляет собой систему приёмов направленного использования процессов жизнедеятельности живых организмов для получения промышленным способом ценных продуктов.
Меня часто спрашивали — и учителя, и школьники — нельзя ли завести какие-либо простенькие культуры, иллюстрирующие биотехнологические процессы для использования на уроках? Можно, и в этом нет ничего суперсложного. Знаменитому физику Резерфорду, который и сам ставил блестящие эксперименты, имея порой в распоряжении простое оборудование, приписывают высказывание о том, что настоящий ученый сможет провести эксперимент при помощи палки и веревки.
Ну, например, для стерилизации сред нужен автоклав. Чем его можно заменить? Очень просто — скороварка. А если вы найдете скороварку с 2 режимами работы — на 1 и 1,5 атмосферы — будет вообще замечательно. Ах, скажете вы — а где мы возьмем агар-агар[2]? Можно заменить его крахмалом или желатином. Конечно, придется немного поэкспериментировать с концентрацией и режимами стерилизации, но в конце концов, уверена, вы подберете себе что-нибудь подходящее. Да, состав пищевого желатина и пищевого крахмала далек от химически чистого, но для простых экспериментов сойдут и эти пищевые продукты. Желатин не переносит стерилизацию под давлением? Попробуйте прием «дробной стерилизации» — 3 раза с интервалом в день по полчаса обрабатывайте пробирки со средой паром в скороварке. Обычно для убивания вегетативных форм микроорганизмов этого достаточно.
Если у вас нет ни агара, ни желатина, ни крахмала — культивируйте на плотиках из фильтровальной бумаги. Когда мы проводили работы по селекции каллусов на среде с ПЭГ (очень сильный осмотик, имитирующий засуху в этих экспериментах) , то столкнулись с проблемой — агар в присутствии высоких концентраций полиэтиленгликоля не застывал после автоклавирования. Выход был найден — на дно пробирок или баночек клали комочек ваты (рыхлый), сверху — вырезанный по диаметру сосуда кусочек фильтровальной бумаги, заливали жидкой питательной средой так, чтобы ее уровень не превышал 1 мм над поверхностью бумаги. Высота столбика среды в пробирке диаметром 2 см — примерно 1-1,5 см, в баночке из под детского питания — 0,5 см.
В качестве мерной посуды можно использовать то, что продается в хозяйственных магазинах для домовитых хозяек — мерные стаканы. Для более мелких доз — в аптеке вы найдете шприцы в ассортименте, которые прекрасно заменят вам мерные пробирки и пипетки. Ультрафиолетовые лампы сейчас можно купить в хозяйственном магазине. Там же вы найдете хлорный отбеливатель для стерилизации экспланта. Сухожаровой шкаф с успехом заменит обычная духовка газовой или электрической плиты.
Правила стерильной работы в лаборатории Выращивание изолированных клеток, тканей, органов, растений-регенерантов, водных культур и грибов, используемых в биотехнологии, проводят в условиях полной асептики, т.е. стерильно. Особое внимание следует обратить на чистоту посуды, предназначенной для приготовления питательных сред и их компонентов; на подготовку объектов к пересадке, пассированию и культивированию. Только некоторые объекты (хлорелла, азолла) можно выращивать в нестерильных условиях.
Приемы и методы стерилизации
Стерилизация — полное уничтожение микроорганизмов и их покоящихся форм (например, спор). Существуют разные методы стерилизации: с помощью влажного пара, сухого пара, облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.
Обработка влажным паром производится в автоклавах. Вегетативные клетки бактерий и грибов гибнут через 5-10 минут уже при температуре около 60°С; для гибели спор дрожжей и грибов требуется температура 120°С в течение 15 минут.
Продолжительность автоклавирования зависит от величины (теплоемкости) пробирок, колб и объема питательной среды в них. Иногда автоклавируют несколько раз — дробная стерилизация. Этот прием используют для стерилизации, как питательных сред, так и посуды.
Читайте также: Ткань с рисунком париж
Стерилизация посуды.
Большинство культур в лабораторных условиях выращивают в пробирках, колбах Эрленмейера различного объема и чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика[3]) . Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:
1. Посуду выдерживают в автоклаве под давлением в течение 20-40 минут при температуре 100-130°С. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы — 20-40 минут, при 1 атм. — 15 минут.
2. При сухом способе стерилизации чашки Петри, колбы, стаканы, завернутые в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140°С в течение 2 часов, при температуре 180°С — 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.
Стерилизация инструментов.
Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т.д.) стерилизуют в сушильном шкафу способом № 2. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить.
Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и
тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают.
Стерилизация материалов.
Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25-30 мин.
Стерилизация питательных сред.
Автоклавирование питательных сред для выращивания культур тканей проводят после их разлива в пробирки или колбы под давлением 0.7-0.8 атм. при температуре 115-120°С в течение 15 — 30 минут, в зависимости от объема среды. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации[4].
Холодная стерилизация.
Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм.
Как изготовить микробиологическую пробку Для предотвращения заражения культур из воздуха и их преждевременного высыхания пробирки и колбы закрывают пробками. Пробки для посуды условно можно разделить на ватные (традиционные микробиологические) и крышечки из фольги.
С ватными пробками проще работать начинающим — меньше риска получить ожог. Пробки должны плотно входить в пробирку (колбу) на 2-3 см, или на 2/3 своей длины; при
открывании хорошо закрытой посуды раздается характерный хлопок.
Недостки микробиологических пробок — довольно трудоемки в изготовлении, часто прожигаются, не очень удобны при долговременном культивировании. Если для микробиологических культур сроки культивирования редко превышают 2 недели, то для растительных клеток продолжительность субкультивирования — как минимум 3 недели. За это время среда начинает подсыхать. Поэтому в таких случаях важно закрывать ватную пробку сверху герметично парафильмом или пищевой
Крышечка из фольги проще в работе — легко изготавливается (вырезается кружочек или квадратик по диаметру горлышка пробирки или колбы + один — полтора сантиметра для отгибания вниз).
Фольгу нужно брать плотную. Если нет плотной — тонкая фольга складывается в 3-4 раза. При обжигании краешков такой пробки нужно быть аккуратным, чтобы не получить ожог, так как фольга металлическая и хорошо проводит тепло. После одевания пробки самый краешек, загнутый вниз на пробирку или колбу, оборачивается узенькой полоской парафильма или пищевой пленки в 2-3 оборота, таким образом краешки плотно прилегают к посуде, и крышка держится надежнее, герметичнее закрывает, снижается риск контаминации (занесения посторонней микрофлоры)
Изготовление микробиологической пробки
Сложить вдвое кусок марли, накрыть им верхнюю часть пробирки. На середину куска, закрывающего отверстие пробирки, положить вату, протолкнуть в пробирку на глубину примерно 3-4 см. Вату очень плотно утрамбовать, затем концы марли скрутить в центре, обвязать ниткой, лишнее обрезать. Обрезки марли можно использовать вместе с ватой при изготовлении пробок. Проверить качество пробок: хлопок в момент открывания пробирки, очень твердая («каменная») на ощупь.
Для колб пробки готовят следующим образом: прямоугольный слой ваты скатать в виде очень плотного, до твердости валика нужных размеров, учитывая диаметр и длину горла колбы, обернуть его двойным марлевым слоем.
Не использовать пробки, изготовленные только из ваты — они легко воспламеняются при обжигании!
Работа в ламинарном боксе
Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересадкой каллусов, тканей, микроорганизмов, ведут в специальных комнатах или ламинарных боксах, где обеспечиваются стерильные условия работы. Ламинарный бокс (ламинар) приспособление для работы в стерильных условиях. Асептические условия в ламинаре создаются с помощью тока воздуха. Ламинарное движение воздуха — движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Ток воздуха, проходя через ламинар, движется к исследователю[5], что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.
Читайте также: Поражение тканей под воздействием высокой температуры
Подготовка бокса к работе
В специальных комнатах (микробиологических боксах) проводят влажную уборку с дезинфицирующими агентами. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами. Облучение ультрафиолетовыми лучами (260 нанометров) — наиболее часто используется в лабораториях для стерилизации помещений, настольных боксов.
При длительном воздействии эти лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30
минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.
Непосредственно перед работой необходимо протереть настольный бокс или внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом[6], разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, простерилизованный инструмент и посуду.
Рабочее место при отсутствии ламинара
Наличие ламинара — это отлично, просто замечательно. Но что делать, если его нет? Или появится в обозримо-необозримом будущем, а культуры клеток заводить нужно уже сейчас?
Шаг первый — постарайтесь найти малопосещаемое людскими массами помещение — чем меньше посетителей — тем меньше источников загрязнения.
Шаг второй — всегда перед работой проводите влажную уборку всей комнаты и стерилизуйте ее кварцевой (ультрафиолетовой) лампой.
А теперь, собственно — о рабочем месте. В нашем случае оно выглядело примерно так: стол, покрытый ламинатом. Лучше — железный, но сойдет и покрашенный масляной краской. В идеале — поверхность стола должна быть негорючей.
Именно поэтому железный стол — лучше всего. Ламинат тоже загорается не сразу, хуже всего в этом отношении масляная краска, а еще пуще всякие дерматины и сукно. Они противопоказаны категорически.
Прямо перед вами на столе должны лежать следующие предметы: кафельная плитка или кусок стекла размером 15×15 см или чуть больше. Кафельная плитка — лучше, она выдерживает нагрев, а стекло может лопнуть. Спиртовка, стаканчик с 96% спиртом (или 200-300 граммовая высокая баночка из-под кофе, детского питания, фруктовых пресервов), широкая кисточка для рисования, мокрая марлевая салфетка или тряпочка размером 30X30, свернутая в несколько раз (смочена водой!), пинцет, скальпель, пробирки/баночки с питательной средой, пробирки/чашки Петри с материалом для размножения.
Порядок работы
Протираете влажной тряпочкой поверхность стола, ополаскиваете тряпочку и выжимаете ее. Кладете свернутую под ПРАВУЮ руку, справа от кафельной плитки.
Располагаете подручные средства. Кафельная плитка лежит прямо перед вами, в центре рабочего места. За кафельной плиткой по центру стоит спиртовка. Рядом с ней, на расстоянии 10 см или чуть больше стоит стаканчик со спиртом, получается, он будет находиться сразу за тряпочкой справа от вас. Слева от плитки располагаются пробирки со средой и материал, который вы будете вводить в культуру или пассировать. Расстояние от плитки до среды и от плитки до тряпочки не менее 10 см влево и вправо, соответственно. Скальпель и пинцет погружены в спирт примерно на 2/3 своей длины (поэтому важно, чтобы баночка была узкой и высокой и была почто до верха наполнена спиртом. Кисточка также стоит в стаканчике со спиртом.
Берете кисточку, мажете спиртом поверхность плитки. Ставите кисточку в спирт. Зажигаете спиртовку, вынимаете скальпель, поджигаете в пламени спиртовки и поджигаете горящим скальпелем спирт на поверхности плитки. Кладете скальпель справа на кафельную плитку (она может еще продолжать гореть) так, чтобы острие скальпеля смотрело вверх (то есть на ребро плитки), но так,
чтобы большая часть скальпеля, включая острие, находилось именно над плиткой, в пламени. Правой рукой берете пинцет из баночки со спиртом, перекладываете в левую руку, поджигаете от спиртовки и кладете слева на плитку — аналогично скальпелю. ВНИМАНИЕ — если вы проводите эти процедуры впервые — отрабатывайте навыки, окуная инструменты в спирт на четверть длины и не пугайтесь пламени, оно исчезает в течение минуты. Влажная тряпочка — ваша страховка на случай, если вы подожжете что-то не то, например, запаникуете и бросите горящий инструмент в баночку со спиртом. Тогда сразу накрывайте влажной тряпкой источник огня, без доступа кислорода огонь тухнет моментально.
В результате этих манипуляций вы имеете абсолютно стерильную поверхность плитки со стерильными инструментами на ней. Постарайтесь контролировать свои движения и доставать экспланты, открывать пробирки не над плиткой непосредственно, а в зоне между плиткой и горящей спиртовкой, то есть за плиткой. На стерильной плитке вы можете резать эксплант, класть его пинцетом на кончик скальпеля для последующего переноса на питательную среду и она должна оставать стерильной. Старайтесь не трясти над ней рукавами халата. Использованные инструменты снова погружаете в спирт. Перед каждым новым эксплатном все операции по стерилизации, начиная с обжигания поверхности плитки, повторяются.
Помните, что скальпель вы держите указательным и большим пальцем (он лежит на указательном и среднем, зажатый большим пальцем, а крышки с пробирок снимаете мизинцем, предварительно пронеся горлышко пробирки через пламя спиртовки.
Читайте также: Ткань яичника с гиперэхогенными включениями
Стерилизация растительного экспланта
Стерильная культура — культура, свободная от эпифитных и ризосферных микроорганизмов.
Работающий должен вымыть руки с мылом и протереть их спиртом, надеть стерильный халат, завязать волосы стерильной косынкой.
Перед стерилизацией объекта его тщательно моют теплой водой с мылом, промывают дистиллированной водой, очищают от излишних тканей, снимают кожуру у корнеплодов и корней, кору у побегов, поверхностные листья у верхушек побегов, промывают дистиллированной водой и помещают на несколько секунд в 70% спирт (семена на 1-2 минуты). После этого сегменты корней, побегов, стеблей, клубней или семена переносят в стерилизующий раствор.
Вид стерилизующего агента, его концентрация и время действия, зависящие от особенностей тканей исходных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить микроорганизмы и не повредить ткани экспланта. Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяют следующие средства стерилизации:
сулему (двуххлористая ртуть) (0.1%), хлорамин (2-10%), гипохлорит кальция (7-10% Са(СlO)2) или натрия (NaOCl) , перекись водорода (13-18%) и др. Хлорамин можно купить в аптеке. Для стерилизации можно использовать также хлорсодержащие растворы отбеливателей из хозяйственных магазинов, например, средство «Белизна». Свежие растворы отбеливателей при стерилизации нежных эксплантов, таких как молодые листочки, нужно разводить в 2 или даже в 3 раза.
Эффективность стерилизации возрастает при добавлении нескольких капель твина-80 и твина-20 на литр стерилизующего раствора.
Продолжительность стерилизации меристем сулемой — 5 минут, семян — 15-20 минут, пергидролем соответственно 15 и 30 минут.
После стерилизации материал переносят в стерильную дистиллированную воду, выдерживают 10 минут, затем меняют воду ещё два раза, выдерживая в каждой порции по 15-20 минут. В стерильных чашках Петри или на стерильных листах бумаги, или на обожженной кафельной плитке обрезают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для образования каллусов. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафинировать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может привести к интоксикации ткани.
Ход работы
Простерилизовать инструменты, посуду и питательные среды, необходимые для проведения работ по выращиванию стерильных проростков и выращивания каллусных тканей.
1. Завернуть в плотную бумагу и простерилизовать сухим жаром в сушильном шкафу стеклянную посуду — колбы, чашки Петри.
2. Подвергнуть предварительной стерилизации в сушильном шкафу скальпели и пинцеты. Перед помещением в сушильный шкаф завернуть инструменты в плотную бумагу.
3. Простерилизовать в автоклаве дистиллированную воду в колбе. Для получения стерильной воды налейте в колбу 1/3 часть объема дистиллированной воды, закройте ватной пробкой, а сверху плотной бумагой или целлофаном, можно обернуть горлышко фольгой. Автоклавировать 30 минут при 1 атмосфере.
4. Простерилизовать в автоклаве в течение 20 мин при давлении 1 атм. пробирки с питательной средой, закрытые фольгой или ватными пробками, обернутыми плотной бумагой или целлофаном.
Питательные среды для растительных биотехнологических объектов Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, Р, К, Са, S, Mg, Fe, В, Zn, Си, Со, Mn, J, Мо); витамины B1, B6, B12, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей.
На средах без гормонов растут «привыкшие» и опухолевые ткани.
Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов.
Из ауксинов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)
— 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) — 0.1-2 мг/л, ИУК — 1-30 мг/л.
Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.
В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (ВАЛ), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК) . В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.
Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания:
— среда без глюкозы — для хлореллы, цианобактерий;
— среда без витаминов и гормонов — для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);
— среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами — для культивирования клеток и тканей высших растений.
Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Составы питательных сред, получивших наибольшее распространение, приведены в справочниках по физиологии растений и биотехнологии. Ниже вы найдете прописи для базовых сред для культивирования растительных клеток: среда Мурасиге-Скуга и среда Гамборга, некоторые микробиологические среды.
Состав питательных сред для растительных клеток
Компоненты Концентрация солей Объем маточного р-ра,