Нуклеотидный пул это косвенный показатель пролиферативной активности ткани

Пролиферативная активность и апоптотическая реактивность клеток шейки матки при предраковых состояниях и неоплазии шейки матки

Читинская государственная медицинская академия

Рак шейки матки (РШМ) является одной из самых распространенных онкологических патологий во всем мире, в динамичном и стадийном патогенезе которого главную роль играет инфекция, индуцированная вирусом папилломы человека (ВПЧ). В настоящее время убедительно доказано, что ключевыми моментами канцерогенеза опухолей различных локализаций являются неограниченная пролиферация, ослабление апоптоза, дестабилизация фаз клеточного цикла [2].

Цель настоящего исследования дать оценку апоптотической реактивности, пролиферативной способности и кинетики клеточного цикла клеток шейки матки при предраковых состояниях и неоплазии.

Материалы и методы. В исследование были включены 58 женщин в возрасте от 26 до 48 лет, проходивших обследование и лечение в Забайкальском краевом онкологическом диспансере. Средний возраст пациенток составил 38±8,26 лет. В качестве образцов для исследования служили фрагменты ткани шейки матки, полученные путем прицельной ножевой биопсии или интраоперационно входе проведения оперативного пособия (радиоволновая эксцизия шейки матки, экстирпация матки). Одновременно проводился их морфологический контроль. В соответствии с данными гистологического исследования было выделено 2 сопоставимых клинических группы:

I – пациентки с неоплазией шейки матки (n=20 — гистологически плоскоклеточный рак Iа1 стадии),

II – больные с предраковыми заболеваниями шейки матки: цервикальная интраэпителиальная неоплазия (ЦИН) II-III степени (n=20),

Контрольную группу составили практически здоровые женщины (n=18), проходившие диспансерное обследование.

Все обследуемые лица были информированы о проводимой работе и дали свое письменное согласие на участие в ней. Исследование проведено с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (The World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2013 ред.) [11].

Для реализации поставленных целей в каждой группе выделены 2 фрагмента исследования: А – участок злокачественной трансформации или предопухолевое поражение шейки матки; В – пограничная ткань без признаков злокачественного роста и воспаления.

Для получения клеточной суспензии кусочки биоптата измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе «Gentle MACS Dissociator» (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) с пробирками С типа и с использованием набора реагентов Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Затем суспензию клеток фильтровали через капроновый фильтр размером ячеек 30 мкм. Полученные клетки отмывали в среде RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium-1640) с добавлением 10 % телячьей сыворотки и стандартного набора антибиотиков.

Регистрацию апоптоза, фаз клеточного цикла в выделенных клетках осуществляли с помощью проточной цитофлуометрии «FC500» (Beckman Coulter, Соединенные Штаты Америки) с использованием набора реагентов Annexin V Kit (Beckman Coulter, Соединенные Штаты Америки), окрашивание проводилось согласно прилагаемой инструкции. Измеряли процент позитивных клеток по аннексин-V-FIТС и йодистому пропидию, собирали не менее 10000 событий. Первоначально производилось типирование клеток шейки матки из общей популяции по отсутствию экспрессии на них лейкоцитарного антигена CD45. Из всей массы CD45 негативных клеток гейтировались Ki-67 позитивные.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью компьютерной программы «BIOSTAT». Полученные результаты представлены как медиана с указанием 25-го и 75-го перцентилей. Использовались методы непараметрической статистики с применением U-критерия Манна–Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне достоверности р 0,05).

Наименьший пул CD45(+) клеток зарегистрирован в очаге предрака 50,03% (34,73%; 65,33%), что на 18,5% и 28,4% меньше соответствующих показателей в образцах неоплазии (61,35% (52,92%; 72,12%)) и контроле (69,91% (58,81%; 71,11%)) (p 0,05).

Наибольшее количество клеток, неэкспрессирующих лейкоцитарный CD45 маркер, верифицировано в локусе предрака – 49,97% (34,67%; 65,27%), что больше, чем в очаге злокачественной трансформации и в группе контроля на 11,3% и 15,4% соответственно (p 0.005). Для клеток этой локализации не обнаружено достоверных отличий по пулу апоптотирующих и некротических клеток по сравнению с соответствующими показателями клеток неоплазии шейки матки.

Таблица 1. Апоптотическая реактивность клеток шейки матки, негативных по CD45 и экспрессирующих Ki-67, при цервикальном раке и ЦИН III степени

Примечание: здесь и далее достоверность различий между патологическими подгруппами указана в тексте.

Полученные данные согласуются с данными литературных источников. З.Ф. Хараева и соавт. (2013), указывают на снижение интенсивности апоптоза в клетках цервикального эпителия при их злокачественной трансформации. Ученые обнаружили уменьшение количества лигандов апоптоза (sFasl и TRAIL) в сыворотки крови у больных с предопухолевыми состояниями и цервикальным раком [3]. И.И. Антонеева и соавт. (2012) сообщают о снижении экспрессии проапоптотического гена р53 и повышении экспрессии антиапоптотического гена Bcl-2 в клетках рака шейки матки [5].

Читайте также: Какая ткань по французски означает тряпка

Определение клеточного цикла. У больных с цервикальным раком в CD45 (-) клетках, экспрессирующих Ki-67, независимо от их локализации наблюдается нарушение кинетики клеточного цикла по всем фазам по сравнению с группой контроля (табл. 2).

В очаге злокачественной трансформации большинство CD45 негативных клеток (84%), экспрессирующих Ki-67, находятся в фазах G0-G1, что достоверно больше, чем в контрольных образцах тканей на 30% (p опухоль > предопухолевый очаг > условно здоровая зона, его окружающая > контроль.

Наиболее высокий уровень апоптотической активности зафиксирован в клетках паранеопластической зоны. В локусе цервикального рака наблюдается ослабление апоптоза на фоне высокой пролиферативной активности клеток.

Выявленные закономерности подлежат дальнейшему изучению и могут быть использованы в качестве маркера ранней злокачественной трансформации клеток шейки матки.

Гистология: Пролиферативная активность экспрессии Ki-67

Иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности по экспрессии Ki-67

Иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности по экспрессии Ki-67 (1 антитело) проводится для выявления в организме человека активного опухолевого роста. Если рак уже был выявлен ранее, то методика позволит выяснить, насколько хорошо он будет реагировать на паллиативное лечение. Ki-67 — это белковая структура, которая находится в раковых клетках.

Экспрессия Ki-67 помогает выявить раковые клетки в активной фазе клеточного цикла (G1-, S-, G2- и M-фазы). Только в период G0 отсутствует Кi-67. Активно пролиферирующие раковые клетки представляют «фракцию роста» опухоли. Пролиферативная активность является показателем определения фенотипа новообразования, определяющая скорость роста опухоли, риск метастазирования и ответ на терапию. Изменение пролиферативной активности влияет на течение и исход онкологического заболевания.

Что такое индекс пролиферации?

Индекс пролиферации при исследовании экспрессии Ki-67— это цифровое значение степени активности опухолевой прогрессии. Выражается в процентном соотношении. Суть определения этого значения основана на том, что все онкологические структуры в организме имеют интенсивный рост и деление. Этот показатель намного выше, чем процессы пролиферации в других органах, причем не только в физиологическом состоянии, но и при воспалениях. Получается, что при значительном увеличении индекса пролиферации, в организме имеется активный злокачественный рост.

В то же время, при наличии опухоли, существуют референсные показатели для каждого онкологического заболевания. При превышении этого порога, рак будет плохо отвечать на консервативное лечение. Наоборот, если показатель низкий, то можно рассчитывать, что стабилизация болезни произойдет на фоне специфической неоперативной терапии.

Когда проводят иммуногистохимическое исследование?

Показаниями к проведению иммуногистохимического исследования пролиферативной активности по экспрессии Ki-67 являются:

рак любой локализации;
подозрение на наличие опухолевого роста в организме;
множественные доброкачественные образования с целью исключения озлокачествления;
опухоль молочной железы для оценки возможности лечения гормонами.

Анализ пролиферативной активности

Материалом для иммуногистохимического исследования пролиферативной активности служит биоптат любого ракового образования. Если опухоль только предполагается, то берется один кусочек с каждого подозрительного участка. Необходима прямая биопсия. Проводится либо щипцами, либо секторальной резекцией части органа. Пункционный биоптат не пригоден.

Материал заливают формалином, отправляют в гистологическую лабораторию. Готовится стандартный препарат с помощью микротомирования после парафинизации. Он фиксируется на предметном стекле и окрашивается маркером для определения белка Ki-67. В результате окрашивания белок становится отличим от других тканей. Врачу-гистологу под микроскопом предстоит подсчитать количество окрашенных фрагментов.

Расшифровка анализа

Заключение врача является важной информацией для лечащего специалиста. Первый вопрос, на который даст ответ гистолог — есть или нет экспрессия Ki-67.

Если окрашивание не произошло, то ответ отрицательный. Опухоли в организме нет.

При положительном варианте проводится подсчет окрасившихся клеток по сравнению с неокрашенными. Результат умножается на 100 и выражается в процентах. Этот показатель врач также включает в ответ. Показатели процентной активности для каждой опухоли индивидуальные, но чем выше процентное соотношение, тем агрессивнее новообразование.

Читайте также: Как правильно пишется флис ткань

Нуклеотидный пул это косвенный показатель пролиферативной активности ткани

Пролиферативная активность клеток отражает интенсивность роста опухолей. В статье приведены данные изучения уровня пролиферации клеток базалиомы — наиболее частой злокачественной опухоли кожи. Исследование проводили иммуногистохимическим методом с маркером пролиферации Ki67. По характеру пролиферации базалиома представляла гетерогенную группу. Солидный, аденоидный, поверхностный мультицентрический тип базалиомы отличались низкой пролиферативной активностью с преимущественным распределением клеток, экспрессирующих Ki67, по периферии комплексов. Высокую пролиферативную активность выявляли в инфильтративном, склерозирующем и микронодулярном типе при равномерном распределении пролиферирующих клеток.

В структуре злокачественных эпителиальных опухолей кожи первое место занимает базалиома, на долю которой приходится от 75 до 94% [1, 2]. В подавляющем большинстве случаев регистрируются солитарные опухоли, локализующиеся на открытых участках кожи, подверженных инсоляции. Опухоль отличается медленным течением и относительно благоприятным прогнозом. Однако в ряде случав она может значительно увеличиваться в размере, характеризуясь выраженным экзофитным ростом, либо приобретать инвазивные черты, проникая в окружающие и подлежащие ткани, приводя к их разрушению. Подобный рост опухоли обычно ассоциируется с определенными морфологическими типами, которые рассматривают как агрессивные [3].

Показателем интенсивности роста ткани является пролиферативная активность клеток. Она относительно спокойна в доброкачественных процессах и резко возрастает в злокачественных опухолях. Аналогичные тенденции присущи и эпителиальным опухолям кожи. Так, пролиферативная активность клеток базальноклеточного рака кожи выше, чем в очагах лейкоплакии [4], а при раке in situ индекс пролиферации превосходит таковой при предраковом актиническом кератозе [4,5]. Плоскоклеточный рак кожи отличается высоким уровнем пролиферации, который следует за снижением степени его дифференцировки [6, 7, 8].

Предыдущие исследования показали, что по характеру пролиферативной активности клеток базалиома представляет гетерогенную группу. Наиболее интенсивный рост имела язвенная форма, тогда как нодулярная и поверхностная характеризовались умеренными и низкими показателями [9]. Высокий уровень пролиферации отмечали в микронодулярном, метатипическом типе базалиомы и типе морфеа [10, 12]. Также отмечали повышение индекса Ki67 в инфильтративном и метатипическом типе по сравнению с нодулярным и поверхностным [11, 13]. В то же время единого мнения о связи уровня пролиферации с гистологическим типом базалиомы до сих пор нет, так как другие исследования свидетельствовали, что индекс Ki67 в нодулярном и поверхностном мультицентрическом типе базальноклеточного рака значительно превосходил аналогичный показатель в склерозированном и типе морфеа [14, 15]. Учитывая противоречивые данные, представляется интересным и актуальным продолжить изучение пролиферативной активности клеток в различных морфологических типах базалиомы, что позволит более детально понимать маркеры и предикторы агрессивного течения опухоли.

В работе исследования использовали 36 биоптатов кожи больных базальноклеточным раком кожи. Биопсию кожи размером 0,5 х 0,5 см проводили под местной анестезией 2% раствором новокаина, биоптаты фиксировали в 10% растворе формалина, забуфференом по Лилли при рН-7,4. Материал заливали в парафин по обычной методике. Серийные срезы толщиной 3–5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Парафиновые срезы наносили на стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали по стандартному протоколу. Срезы, погруженные в цитратный буфер, инкубировали в микроволновой печи при мощности 690 Вт два раза по пять минут. Двадцать минут при комнатной температуре, срезы охлаждали, подсушивали и наносили первичные антитела. Для определения уровня пролиферации использовали моноклональные антитела к протеину Ki67 (DAKO), разведение 1:200. Использовались соответствующие позитивные и негативные контроли – иммунные и неиммунные сыворотки. Срезы промывали в буфере, подсушивали, затем на них наносили EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) на 30–40 минут. Для визуализации реакции наносили DAB+ (3, 3 ґ– диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску. Затем срезы докрашивали гематоксилином Майера. Определение уровня пролиферации оценивалась с помощью индекса, который вычислялся как среднее от числа меченных ядер на 100 учтенных ядер (при учете 500–1000 опухолевых клеток). Подсчет меченных ядер проводился в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Клетки на периферии срезов, где чаще всего наблюдается фоновое окрашивание, не учитывались.

Читайте также: Вид отделки ткани полученная в результате переплетения нитей разного цвета

Для статистической обработки данных использовались методы t-Стьюдента с поправкой для множественных сравнений; хи-квадрат. Расчеты проводились при помощи программы BIOSTAT. Полученные различия считались достоверными при значениях p ? 0,05.

Среди 36 базалиом пять имели поверхностный мультицентрический тип строения, четыре – поверхностный мультицентрический в сочетании с солидным, семь – солидный, два – аденоидный, два – солидно-аденоидный, пять – инфильтративный, три – микронодулярный. В восьми случаях отмечали различные варианты сочетания солидного, инфильтративного, микронодулярного, склерозирующего строения.

Индекс пролиферации Ki67 в поверхностном мультицентрическом типе и при сочетании его с солидным компонентом варьировал от 14,9 до 31,1%. Средний индекс составлял 22,2%. Пролиферирующие клетки в шести случаях располагались преимущественно по периферии клеточных комплексов, в трех – равномерно по клеточным комплексам. При солидных опухолях средний индекс составил 26,5%, он варьировал от 14,5 до 38,2% (рис.1). Периферическое распределение наблюдали в четырех случаях, равномерное – в трех. При аденоидном строении пролиферирующие клетки распределялись равномерно, индекс пролиферации составлял 22,6 и 31,3%. В случаях, когда имелось сочетание солидного и аденоидного компонентов, индекс пролиферации составлял 36,8 и 19,2%, В первом случае клетки распределялись равномерно, во втором – равномерно в аденоидном компоненте и по периферии – в солидном. В опухолях инфильтративного, микронодулярного строения и при их сочетании клетки, экспрессирующие маркер Ki67, диффузно регистрировались по всем клеточным комплексам. В инфильтративном типе минимальное и максимальное значение индекса было 27,6 и 47,8% (среднее значение – 35,4%) (рис.2). Микронодулярные базалиомы имели средний индекс Ki67 26,9%. В случаях инфильтративно-склерозирующего строения индекс имел значение 40,2 и 31,6%, пролиферирующие клетки равномерно распределялись в комплексах (рис.3). При сочетании инфильтративного, солидного и микронодулярного строения преимущественно отмечали равномерное распределение пролиферирующих клеток, и средний индекс составлял 36,5% (значения варьировали от 22,1 до 50,4%). Солидное строение в сочетании с инфильтративным склерозирующим имели опухли с индексом Ki67 26,7 и 35,3%, в солидном компоненте пролиферирующие клетки располагались преимущественно по периферии комплексов, инфильтративном склерозирующем – равномерно.

При анализе пролиферативной активности клеток мы сгруппировали опухоли в зависимости от характера течения и роста. В группу неинвазивного роста мы включили опухоли, имеющие поверхностный мультицентрический, солидный, аденоидный, сочетание поверхностного мультицентрического и солидного компонентов. В группу с инвазивным ростом нами были включены опухоли инфильтративные, микронодулярные, инфильтративно склерозирующие, а также опухоли сложного строения (инфильтративный + микронодулярный + солидный и солидый + инфильтративный склерозирующий).

Средний индекс пролиферации неагрессивных типов составил 24,77 ± 7, 47 с доверительным интервалом 95% 21,27–28,26 (табл. 1). Средний индекс Ki67 агрессивных типов составлял 33,53 ± 8,94 с доверительным интервалом 95% 28,77–38,29 (табл. 1). Различия в уровне пролиферации между агрессивными и неагрессивными типами носили статистически значимый характер (р = 0,003). Анализ характера распределения пролиферирующих клеток в опухолевых комплексах показал, что в неагрессивных типах периферическое распределение клеток наблюдалось в 50% случаев, равномерное – в 45%, в 5% случаев ряд комплексов в опухоли имели один тип распределения, другие комплексы – иной тип распределения (табл.2). В агрессивных типах 81,25% случаев имели равномерное распределение пролиферирующих клеток, сочетание двух типов распределения – 18,75% (табл. 2). Периферическое распределение пролиферирующих клеток в агрессивных типах не встречалось. При сравнении распределения клеток между агрессивными и неагрессивными типами опухоли было показано, что различия носят статистически достоверный характер (р = 0,003).

Таблица 1. Индекс пролиферации Ki67 в агрессивных и неагрессивных морфологических типах базалиомы

Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом