Использование методики определения активности пероксидазы в растительном материале при изучении курса «Биохимия растений»
Полифенолы в свободном состоянии, в форме разнообразных соединений (гликозиды, дубильные вещества), ароматические амины как наиболее распространенные субстраты, на которые действует пероксидаза в тканях растений. Методы определения активности пероксидазы.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Использование методики определения активности пероксидазы в растительном материале при изучении курса «Биохимия растений»
Наиболее распространенными субстратами, на которые действует пероксидаза в тканях растений, являются полифенолы в свободном состоянии или в форме разнообразных соединений (гликозиды, дубильные вещества) и ароматические амины. Окисление фенолов и ароматических аминов пероксидаза осуществляет с помощью перекиси водорода или каких-либо органических перекисей, в том числе перекиси ненасыщенных жирных кислот и каротина с образованием, как правило, окрашенных соединений [3].
Большинство методов определения активности пероксидазы сводится к исследованию действия растворенного фермента на субстрат. В лабораторной практике продукты реакции определяют химическим, газометрическим, спектрофотометрическим, потенциометрическим, колориметрическим, флуоресцентным или радиохимическим методами.
В литературе наиболее распространены три методики определения активности этого фермента:
газометрический метод, основанный на том, что с пероксидом водорода пероксидаза образует комплексное соединение, в результате чего пероксид водорода активируется и приобретает способность действовать в качестве акцептора водорода. Активность пероксидазы определяется по скорости выделения кислорода [4];
колориметрический метод определения активности пероксидазы по А.М. Бояркину основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта окисления определённой концентрации, устанавливаемой на фотоэлектроколориметре [5];
спектрофотометрический метод определения активности пероксидазы основан на измерении оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении гваякола за определённый промежуток времени [4].
Так как основными аналитическими приборами в биохимических лабораториях высших учебных заведений остаются фотоэлектроколориметры и спектрофотометры, то наибольшее распространение получил колориметрический метод определения активности пероксидазы по А.М. Бояркину. Этот метод обладает лучшей воспроизводимостью и является более чувствительным. В связи с этим, метод нашел широкое применение на лабораторных занятиях в курсе «Биохимия растений» при изучении темы «Особенности действия растительных ферментов». При исследовании активности пероксидазы по методу А.М. Бояркина студентами использовались проростки сельскохозяйственных культур, подвергнутых воздействию токсических концентраций ионов свинца.
Для определения активности пероксидазы навеску проростков (до 500 мг) гомогенизировали в ацетатном буфере (рН = 4,7) и переносили в мерную колбу на 50 мл. После 10 минут настаивания с периодическим помешиванием, в результате чего пероксидаза переходила в раствор, вытяжку центрифугировали при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали в качестве ферментного препарата. В кювету шириной 2 см помещали реакционную смесь, состоящую из одинаковых объемов ферментного раствора, раствора бензидина в ацетатном буфере и воды. Измерения проводили на фотоэлектроколориметре «КФК?2» (Россия) при красном светофильтре. После установления стрелки гальванометра на нуле в опытную кювету наливали такой же объем 3% -й перекиси водорода. Сразу же после начала приливания перекиси водорода включали секундомер. При этом под действием пероксидазы происходит реакция окисления бензидина с образованием соединения синего цвета. Когда стрелка гальванометра достигала отметки Е = 0,125 или 0,250, секундомер останавливали. Активность пероксидазы вычисляли по скорости реакции в условных единицах и выражали на 1 г растительного материала:
где А — активность фермента на 1 г навески (в у. е.);
Е — экстинкция (0,125 или 0,250);
а — объем вытяжки (50 мл);
b — степень разведения вытяжки в реакционной смеси (в кювете);
m — навеска растительного материала (г);
с — толщина жидкости в кювете (2 см);
t — время (с).
биохимия растение полифенол активность пероксидаза
Активность пероксидазы определяли в проростках пшеницы яровой сорта «Дарья» и ячменя ярового сорта «Атаман», подвергнутых воздействию ионов свинца в концентрациях 10 -5 -10 -3 М.
Результаты исследований показали, что ионы свинца в концентрациях 10 -5 -10 -3 М приводили к увеличению активности пероксидазы в корешках пшеницы яровой на 3,6-89,3% (7-е сутки), 7,1-25,0% (10-е сутки) и 2,9-29,4% (14-е сутки) по сравнению с контрольными растениями (таблица 1). Увеличение активности пероксидазы наблюдалось и в побегах растений пшеницы яровой.
Таблица 1 — Активность пероксидазы в проростках пшеницы яровой при воздействии ионов свинца
Активность пероксидазы, у. е. / г сырой массы
В проростках ячменя ярового высокая концентрация ионов свинца 10 -3 М также приводила к увеличению активности пероксидазы в корнях и побегах. Так ее активность в корнях ячменя ярового возрастала на 37,4% (7-е сутки), 58,0% (10-е сутки) и 32,4% (14-е сутки) по сравнению с контрольными растениями (таблица 2).
Таблица 2 ? Активность пероксидазы в проростках ячменя ярового при воздействии ионов свинца
Активность пероксидазы, у. е. / г сырой массы
Таким образом, с увеличением концентрации ионов свинца в среде прорастания усиливается активность пероксидазы в растениях сельскохозяйственных культур. Следовательно, высокая активность пероксидазы является одним из важнейших механизмов, защищающих растения от окислительных повреждений, вызываемых высокими концентрациями ионов свинца.
Использование научно-исследовательских работ при изучении курса «Биохимия растений» дает возможность студентам познакомиться с методами биохимических исследований, научиться интерпретировать полученные результаты, закрепить знания, полученные в лекционном курсе, активизировать самостоятельную работу, развить творческий подход в исследовательской деятельности.
Cписок литературы
1. Рогожин, В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В.В. Рогожин. — СПб.: ГИОРД, 2004. — 240 с.
2. Воскресенская, О.Л. Большой практикум по биоэкологи: учеб. пособие / О.Л. Воскресенская; Мар. гос. ун-т. — Йошкар-Ола, 2006. — Ч.1. — 107 с.
3. Henriksen, A. Structure of soybean seed coat peroxidase: A plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions / A. Henriksen [et al.] // Protein Science. — 2001. — Vol.10. — P.108-115.
4. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков [и др.]. — Л.: Агропромиздат, 1987. — С.41-43.
5. Гавриленко, Л.Е. Большой практикум по физиологии растений / Л.Е. Гавриленко, Л.М. Хандобина. — Минск: Высшая школа, 1975. — С. 207-209.
Подобные документы
Комнатные растения на уроках биологии в школе. Изучение особенностей развития и размножения органического мира. Изучение основных закономерностей наследственности и изменчивости растений. Использование комнатных растений при изучении основ экологии.
курсовая работа [64,0 K], добавлен 29.09.2011
Особенности морфологии растений, ее цели и задачи, степень изученности на современном этапе. Исследование морфологических характеристик растений и разработка схемы описания. Разработка методики изучения ампельных растений в школьном курсе биологии.
дипломная работа [323,8 K], добавлен 23.05.2009
Применение математических знаний и умений в жизненных ситуациях. Система методических приемов и методов развития поисковой исследовательской активности ученика при изучении стохастики. Методические цели при формировании исследовательских компетенций.
реферат [14,4 K], добавлен 29.06.2013
Теоретико-методологические аспекты исследования квалиметрии в системе образования. Место модуля «Анатомия растений» курса ботаники в системе подготовки провизора. Использование квалиметрического подхода к оцениванию исследовательской работы студентов.
дипломная работа [794,3 K], добавлен 20.06.2017
Виды игровых форм обучения как средство стимулирования познавательной активности, особенности их использования в обучении школьников иностранному языку. Разработка и практическое применение дидактических игр при изучении новой лексики английского языка.
курсовая работа [339,2 K], добавлен 05.11.2013
Метод определения активности пероксидаз в органах растений
При окислении в организмах кислородом органических субстратов в качестве основных продуктов образуются пероксид водорода (Н2O2) или органические пероксиды, которые могут окислять различные вещества. Одним из хорошо известных ферментов, способных катализировать реакции пероксидного окисления химических веществ в живых клетках, является пероксидаза , которая с пероксидом водорода образует комплексное соединение, в результате чего пероксид переходит в активированное состояние, превращаясь в акцептор водорода.
Растительные пероксидазы — двухкомпонентные ферменты, локализованные главным образом в пероксисомах. В состав каталитического центра этих ферментов входит протогем. Действие пероксидазы можно представить в виде следующей реакции:
Пероксидазы катализируют окисление пероксидом водорода фенольных соединений, жирных кислот, аминокислот и аминов, терпенов, восстановленного глютатиона. Эти ферменты обладают высокой термоустойчивостью, поэтому после стерилизации растительной продукции тепловой обработкой для последующего хранения и переработки в ней контролируется активность пероксидаз. При ферментации чая и табака пероксидазы наряду с полифенолоксидазами участвуют в образовании окрашенных и ароматизирующих веществ в составе этих продуктов.
Принцип метода. Определение активности пероксидаз в растительной продукции основано на проведении ферментативной реакции окисления пирогаллола пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения пурпурогаллина, количество которого оценивают колориметрированием на фотоэлекгроколориметре.
Оборудование. Ступки фарфоровые с пестиками диаметром 8-10 см или гомогенизатор; марля для фильтрования; чашки фарфоровые диаметром 6-8 см; колбы конические на 50 мл; дозирующие пипетки на 1-10 см; дозирующее устройство на 5 мл для раствора серной кислоты; мерные колбы на 100 мл и на 1 л с пробками; темная склянка для раствора пероксида водорода; термостат, фотоэлектроколориметр.
Реактивы. Дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода);
концентрированный раствор пероксида водорода; концентрированная
серная кислота; 0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0); пирогаллол.
Приготовление растворов. 1% раствор пероксида водорода: готовится
свежий раствор перед каждым анализом путем разбавления концентрированного раствора в мерной колбе на 100 мл. Приготовленный раствор переливают в темную склянку. 10% раствор серной кислоты: в фарфоровый стакан на 500 мл наливают 300 мл дистиллированной воды, к шторой с помощью дозирующего устройства приливают 60,6 мл концентрированной серной кислоты, полученную смесь перемешивают и после охлаждения переливают в мерную колбу на 1 л, ополаскивая стакан дистиллированной водой. Затем объем раствора в колбе доводят водой до метки и перемешивают. 0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0): в мерной колбе на I л дистиллированной водой растворяют 17,911 г Na2HPO4 −12H2O; в мерной колбе на 500 мл дистиллированной водой растворяют 3,901 г NaH2PO4∙H2O. Затем 390 мл раствора NaHPO4∙12H2O; смешивают с 610 мл раствора Na2HPO4 12H2O . 1% раствор пирогаллола: 5 г пирогаллола растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл.
Ход определения. Навеску растительного материала 2 г (клубни
картофеля, корнеплоды, проростки семян злаковых, зернобобовых, масличных культур, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений)
взвешивают на лабораторных весах с точностью до 0,01 г и растирают в ступке или измельчают в гомогенизаторе до получения однородной массы. В случае необходимости в ступку для лучшего растирания растительного материала добавляют небольшое количество чистого кварцевого песка. К измельченному в ступке материалу приливают дозирующей пипеткой 20 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,0) для экстракции ферментного белка и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. Затем в фарфоровую чашку помещают уложенную в 4 слоя марлю и на нее переносят измельченный растительный материал из ступки, заворачивают края марлевой ткани и отжимают через 4 слоя марли растительный экстракт с растворенным ферментным белком в коническую колбу на 50 мл.
В ходе последующего анализа в 2 конические колбы на 50 мл дозирующей пипеткой вносят по 4 мл ферментного экстракта и в одну из колб для инактивации ферментного белка (контроль) с помощью дозирующего устройства приливают 5 мл 10% раствора серной кислоты, смесь перемешивают. После этого в обе колбы дозирующей пипеткой приливают по 5 мл 1% раствора пирогаллола и по 1 мл 1% раствора пероксида водорода, смеси перемешивают и помещают на 15 минут в термостатированную камеру при температуре 25°С.
Реакция проводится в отсутствии света, который активирует самопроизвольный распад пероксида водорода на кислород и воду. Отсчет времени ферментативной реакции начинается в тот момент, когда к ферментному раствору приливается раствор пероксида водорода. По истечении 15 минут теперь уже в колбу с активным ферментом для его инактивации приливается 5 мл 10% раствора серной кислоты и в этот момент фиксируется точное время колориметрируют на фотоэлекгроколориметре с использованием прекращения ферментативной реакции. После проведения ферментативной реакции окрашенные растворы образующимся под действием пероксидаз пурпурогаллином зеленого светофильтра при толщине фотометрируемого слоя 5 мм.
Обработка и оценка результатов. Активность пероксидаз рассчитывают
где А — активность пероксидаз в единицах оптической плотности раствора
пурпурогаллина, образовавшегося за 1 час под действием этих
ферментов, в расчете на 1 г растительной массы;
Di — оптическая плотность раствора в варианте с активными пе-
D2 — оптическая плотность раствора в варианте с инактивированными
20 — объем ферментного экстракта, выделенного из растительной
Н — навеска растительного материала, г;
4 — объем экстракта пероксидаз, взятый для проведения ферментативной