Определение сиаловых кислот в тканях

Сиаловые кислоты слюны в первичной и дифференциальной диагностике рака легкого

Цель исследования — определение возможности использования уровня сиаловых кислот в слюне в качестве маркера в первичной и дифференциальной диагностике рака легкого.

Материалы и методы. В исследование включены 1903 человека, которые были разделены на группы: основную (рак легкого, n=337, и незлокачественные патологии легких, n=108); группу сравнения (другие виды онкологических заболеваний, n=1033) и контрольную (условно здоровые, n=425). Всем участникам были проведены анкетирование, биохимическое исследование слюны, гистологическая верификация диагноза. Уровень сиаловых кислот и содержание муцина в слюне определены спектрофотометрически.

Результаты. Установлено, что средний уровень сиаловых кислот в контрольной группе (0,270±0,037 ммоль/л) существенно выше, чем на фоне рака легкого (0,138±0,006 ммоль/л) и неопухолевых патологий легких (0,148±0,003 ммоль/л). Содержание сиаловых кислот при различных гистологических типах рака легкого статистически значимо не отличается (0,175±0,027 и 0,166±0,024 ммоль/л для плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы соответственно). Отмечено, что при метастатическом поражении легких уровень сиаловых кислот в слюне максимально снижен по сравнению с уровнем у условно здоровых пациентов.

Заключение. Уровень сиаловых кислот в слюне снижается как на фоне рака легкого, так и при неопухолевых патологиях легких, что подтверждает возможность применения этих кислот в качестве маркера для первичной диагностики патологий легких в целом, однако для дифференциальной диагностики заболеваний легких определение только уровня сиаловых кислот является малоинформативным.

Рак легкого (РЛ) является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и входит в число основных причин смерти от онкологических заболеваний [1, 2]. Для диагностики РЛ были апробированы и показали свою неэффективность такие методы, как рентгенография грудной клетки и цитологическое исследование мокроты [3]. В настоящее время для его выявления рекомендована низкодозовая компьютерная томография грудной клетки, однако ее применение ограничено возрастной группой — 55–74 года — и целевой аудиторией — заядлые курильщики или отказавшиеся от курения менее 15 лет назад. Большие надежды возлагаются на выявление ранних молекулярных маркеров РЛ (CEA, Cyfra 21-1, CA 72-4 — для аденокарциномы; Cyfra 21-1, SCC, CEA — для плоскоклеточного и крупноклеточного РЛ; ProGRP, HCE, CEA — для мелкоклеточного РЛ) [4, 5]. Однако их использование зачастую ограничивается уточняющей диагностикой, оценкой эффективности лечения, прогнозом течения опухолевого процесса и доклиническим выявлением развития рецидивов, и только в ряде случаев их используют для активного выявления рака. В последние годы широко изучается возможность применения известных и новых опухолевых маркеров в первичной и дифференциальной диагностике РЛ. Еще в конце прошлого века появилась идея использования для этих целей сиаловых кислот [6]. В ряде исследований показана потенциальная применимость определения уровня сиаловых кислот для диагностики колоректального рака [7], рака щитовидной железы [8], предстательной железы [9], яичников [10] и полости рта [11]. Однако тема диагностики РЛ с использованием в качестве маркера сиаловых кислот не разрабатывалась. Следует отметить, что во всех описанных работах уровень сиаловых кислот определяли в крови или тканях, тогда как потенциально более информативно использование для этих целей слюны [12, 13].

Сиаловые (нейраминовые) кислоты являются полифункциональными соединениями, присутствующими во всех тканях и жидкостях организма человека, однако наибольшее их количество обнаруживается в слюне человека [12, 13]. Как правило, в норме сиаловые кислоты не встречаются в свободном виде, а входят в состав различных углеводсодержащих веществ, таких как гликопротеины (в слюне в основном муцины), гликолипиды и олигосахариды [14, 15]. Гликопротеины — сложные белки, содержащие до 80% углеводов, а именно: N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, галактозу, фукозу, маннозу и нейраминовую кислоту. Присутствие сиаловых кислот, обычно N-ацетилнейраминовой, и (или) сульфатных остатков придает отрицательный заряд молекуле гликопротеина, что влияет на способность клеток к адгезии. Сиаловые кислоты являются компонентами многих рецепторов клеточных мембран и способны маскировать раковые клетки от распознавания иммунной системой [16]. Существует обширная статистика, показывающая связь между нарушениями процессов сиалирования гликопротеинов и канцерогенезом [14, 17, 18].

Материалы и методы

В исследовании «случай–контроль» приняли участие 1903 добровольца, из которых сформировали три группы: основную (с патологиями легких), группу сравнения (с другими видами онкологических заболеваний) и контрольную (условно здоровые). Включение в группы происходило параллельно. Всем участникам выполнено биохимическое исследование слюны.

Основная группа включала 445 пациентов с патологиями легких, в том числе 337 пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом РЛ (98 женщин, 239 мужчин) и 108 больных — с незлокачественной легочной патологией, из них 7 — с хронической пневмонией, 20 — с туберкулезом легких, 28 — с гамартомой, 10 — с саркоидозом, 24 — с фиброзом и др. Группа больных РЛ дополнительно была разделена на подгруппы по следующим признакам: пол и возраст пациентов, гистологический тип опухоли (аденокарцинома, плоскоклеточный рак), стадия заболевания по Международной системе TNM.

Читайте также: Что за ткань футер двунитка с лайкрой что за ткань

Группа сравнения включала 1033 пациента с другими видами онкологических заболеваний и состояла из двух подгрупп. В первую вошли 302 пациента мужского пола, в том числе 129 пациентов со злокачественными новообразованиями (ЗНО) желудочно-кишечного тракта, 59 — с ЗНО мочеполовой системы, 114 — с ЗНО предстательной железы. Вторая состояла из 731 пациентки женского пола, в том числе 400 — с ЗНО тела, шейки матки и яичников, 180 — с ЗНО молочной железы, 118 — с ЗНО желудочно-кишечного тракта, 33 — с ЗНО мочеполовой системы.

Контрольная группа включала 425 условно здоровых пациентов (192 мужчины, 233 женщины), у которых при проведении плановой диспансеризации не было выявлено онкологической патологии.

Группы обследуемых были сформированы согласно правилам проведения клинических испытаний после получения информированного согласия.

В качестве критериев включения рассматривались следующие: возраст пациентов 30–75 лет; отсутствие какого-либо лечения на момент проведения исследования, в том числе хирургического, химиотерапевтического или лучевого; отсутствие признаков активной инфекции (включая гнойные процессы); проведение санации полости рта.

Критерий исключения — отсутствие гистологической верификации диагноза.

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и одобрено на заседании Комитета по этике Клинического онкологического диспансера.

У всех пациентов до начала лечения проводили забор слюны в количестве 1 мл. Используемый метод определения сиаловых кислот заключался в гидролизе безбелкового фильтрата, в результате чего из состава сиалогликопротеинов выделяли сиаловые кислоты, которые взаимодействуют с уксусной и серной кислотами в условиях повышенной температуры (создаваемой в кипящей водяной бане) и дают окрашенные соединения, изменяющие цвет раствора [19]. В пробирки вносили по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл дистиллированной воды и 0,6 мл слюны. Пробирки после тщательного перемешивания содержимого ставили в кипящую водяную баню на 5 мин, затем охлаждали, центрифугировали при 2000 об./мин для отделения осадка. К надосадочной жидкости добавляли 0,4 мл уксусно-сернокислой смеси, пробы повторно нагревали в кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждали и добавляли 2 мл дистиллированной воды. После этого измеряли оптическую плотность растворов относительно холостой пробы с зеленым светофильтром (500–560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Количество муцина в слюне определяли спектрофотометрическим методом по разнице концентрации белка в исходном материале и надосадочной жидкости, образующейся после кислотного осаждения муцина. Для этого готовили две опытные пробы: первая содержала слюну и рабочий реагент; вторая — надосадочную жидкость и рабочий реагент; а также стандартную пробу, содержащую водный раствор альбумина с концентрацией 0,25 г/л и рабочий реагент. Также готовили контрольную пробу, содержащую дистиллированную воду и рабочий реагент, который получали смешиванием раствора бромфенолового синего в концентрации 1,2 г/л и буферного раствора (рН=3,0), содержащего 320 ммоль/л лимонной кислоты и 160 ммоль/л натрия фосфата в соотношении 2:23. Содержимое каждой пробы перемешивали и инкубировали 10 мин. Определяли оптическую плотность опытных и стандартной проб относительно контрольной при длине волны 620 нм.

Статистический анализ полученных данных выполнен при помощи программ Statistica 10.0 (StatSoft) и пакета R (версия 3.2.3). Графики плотностей построены при помощи пакета ggplot2 (версия 2.0.0).

Результаты и обсуждение

Определение уровня сиаловых кислот в слюне в норме. На первоначальном этапе исследования было проведено определение нормального содержания сиаловых кислот в слюне. Установлено, что для женщин (средний возраст 45,89±1,59 года) в норме концентрация сиаловых кислот составляет 0,244±0,023 ммоль/л, для мужчин (средний возраст — 41,86±1,53 года) — 0,285±0,025 ммоль/л, что хорошо согласуется с литературными данными, несмотря на отличия в методике определения сиаловых кислот [20].

Установлено, что содержание сиаловых кислот в норме незначительно повышается с возрастом, однако статистически значимых половозрастных отличий не выявлено (табл. 1), что позволяет использовать средние значения в качестве референтных при дальнейших расчетах.

Читайте также: Ткань для задника фотостудии

Таблица 1. Половозрастные особенности содержания сиаловых кислот в слюне, ммоль/л

Определение уровня сиаловых кислот при разных видах онкологических заболеваний. Для определения потенциальной возможности применения уровня сиаловых кислот в диагностике рака проведено два исследования среди мужчин и женщин. Сначала сравнение плотности распределения концентраций сиаловых кислот выполнено у 624 пациентов мужского пола, включая 192 условно здоровых, 130 пациентов с РЛ, 129 больных с ЗНО желудочно-кишечного тракта, 59 — с ЗНО мочеполовой системы, 114 — со ЗНО предстательной железы (рис. 1).

Рис. 1. Плотность распределения концентраций сиаловых кислот в группах условно здоровых мужчин (ZDOR), пациентов мужского пола со злокачественными новообразованиями легкого (ZNO_LEGKOE), желудочно-кишечного тракта (JKT), мочеполовой системы (MPS), предстательной железы (PROSTATA)

Установлено, что средние уровни сиаловых кислот в контрольной группе (0,285±0,025 ммоль/л) и в группах пациентов со ЗНО желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы и предстательной железы близки (0,231±0,021, 0,231±0,049 и 0,236±0,009 ммоль/л соответственно), тогда как для РЛ это значение существенно ниже (0,138±0,006 ммоль/л).

Аналогично были обследованы 1014 пациенток женского пола: 233 условно здоровых, 400 — с ЗНО тела, шейки матки и яичников, 180 — с ЗНО молочной железы, 118 — с ЗНО желудочно-кишечного тракта, 50 — с РЛ, 33 — с ЗНО мочеполовой системы. Средняя концентрация сиаловых кислот в контрольной группе составила 0,244±0,023 ммоль/л. Отмечен существенно более низкий уровень сиаловых кислот в группах с РЛ, а также с ЗНО тела, шейки матки и яичников (0,148±0,003 и 0,169±0,003 ммоль/л соответственно) (рис. 2). Во всех остальных группах отличий от среднего содержания сиаловых кислот в группе условно здоровых не выявлено.

Рис. 2. Плотность распределения концентраций сиаловых кислот в группах условно здоровых женщин (ZDOR), пациентов женского пола со злокачественными новообразованиями легкого (ZNO_LEGKOE), тела, шейки матки и яичников (ZNO_GYN)

На основании полученных результатов была сформулирована научная гипотеза, что для больных РЛ уровень сиаловых кислот статистически значимо отличается от уровня всех остальных групп, включенных в исследование. С этой целью выполнена оценка характера распределения и гомогенности дисперсий в группах. Согласно тесту Шапиро–Уилка, распределение уровня сиаловых кислот не соответствует нормальному (p 0,05). Поэтому график плотности рассматриваемого признака для группы РЛ смещен ближе к оси Y относительно всех остальных групп.

Полученный результат согласуется с литературными данными, согласно которым определение уровня сиаловых кислот может быть использовано при диагностике РЛ и рака яичников [10, 21]. Однако наши исследования показали, что данный метод можно расширить также на ЗНО тела и шейки матки.

Оценка возможности применения сиаловых кислот для дифференциальной диагностики заболеваний легких. Дополнительно исследован уровень сиаловых кислот при РЛ и неопухолевых патологиях легких. Установлено, что снижение уровня сиаловых кислот наблюдается в обоих случаях до 0,138±0,006 и 0,148±0,003 ммоль/л (рис. 3).

Рис. 3. Плотность распределения концентраций сиаловых кислот в группах условно здоровых людей (ZDOR), пациентов со злокачественными новообразованиями легкого (ZNO_LEGKOE) и неопухолевыми заболеваниями легкого (DNO_LEGKOE)

Индивидуально для гамартомы, туберкулемы и воспалительных заболеваний легких среднее содержание сиаловых кислот составило 0,154±0,035, 0,163±0,054 и 0,098±0,030 ммоль/л соответственно. По-видимому, наличие активного воспалительного процесса в легких смещает уровень сиаловых кислот до значений ниже, чем на фоне РЛ, что может привести к ложноположительному результату и должно учитываться в качестве критерия ограничения предлагаемого метода. Среди неопухолевых заболеваний легких выделяется саркоидоз легких (0,201±0,041 ммоль/л), поскольку это воспалительное заболевание характеризуется формированием неказеозных гранулем в различных органах и тканях, в том числе в легких [22, 23]. Таким образом, понижение уровня сиаловых кислот наблюдается как в случае РЛ, так и при неопухолевых патологиях легких, что подтверждает возможность применения данного параметра для диагностики заболеваний легких в целом, однако целесообразность его применения для дифференциальной диагностики не доказана.

Оценка возможности применения сиаловых кислот для диагностики при разных типах рака легкого. Подавляющее количество случаев РЛ составляют аденокарцинома и плоскоклеточный рак, их общая доля в числе всех случаев — порядка 85%. Содержание сиаловых кислот для различных гистологических типов РЛ статистически значимо не отличается и составляет 0,189±0,066 ммоль/л для мелкоклеточного РЛ, 0,175±0,027 ммоль/л для плоскоклеточного РЛ, 0,166±0,024 ммоль/л — для аденокарциномы, что позволяет использовать данный параметр в общей диагностике наиболее распространенных гистологических типов РЛ независимо от размеров опухоли (табл. 2), но не дифференцировать их.

Читайте также: Узи мягких тканей лба у взрослого

Таблица 2. Концентрация сиаловых кислот в зависимости от гистологического типа и размеров опухоли, ммоль/л

Полученные данные показали, что при метастатическом поражении легких уровень сиаловых кислот максимально снижен по сравнению с группой условно здоровых лиц (см. табл. 1, 2).

Половозрастные характеристики пациентов с РЛ, по нашим данным, также не влияют на возможности использования концентрации сиаловых кислот в слюне в качестве диагностического параметра (табл. 3).

Таблица 3. Половозрастные особенности содержания сиаловых кислот в слюне пациентов с раком легкого, ммоль/л

Таким образом, уровень сиаловых кислот в слюне снижается как на фоне РЛ, так и при неопухолевых патологиях легких. Это подтверждает принципиальную возможность применения данного маркера для первичной диагностики патологии легких в целом, однако для дифференциальной диагностики данных заболеваний определение уровня сиаловых кислот является малоинформативным.

Обоснование выявленной динамики уровня сиаловых кислот в слюне. Существуют противоречивые литературные данные о содержании сиаловых кислот в крови больных РЛ. Согласно одним авторам [6], их уровень достоверно превышает показатели здоровых доноров, а также пациентов с неопухолевыми заболеваниями легких. В других работах [24] статистически значимых отличий уровня сиаловых кислот в крови и жидкости бронхиального лаважа у пациентов с РЛ и неопухолевыми заболеваниями легких не обнаружено. Авторы [25] отмечают, что увеличение уровня сиаловых кислот в крови при РЛ положительно коррелирует со степенью метастазирования данной опухоли.

Следует отметить, что содержание сиаловых кислот связано с уровнем острофазовых белков, в частности α-1-кислого гликопротеина, концентрация которого может возрастать при любом патологическом процессе [16]. Большая часть молекулы α-1 кислого гликопротеина представлена углеводным компонентом, характеризующимся наличием концевых N-ацетилнейраминовых остатков — сиаловых кислот. Повышенная сиалированность углеводных цепей способствует маскировке гликановых антигенных детерминант при онкологических процессах [17]. Уменьшение количества концевых N-ацетилнейраминовых остатков обусловливает появление свободных сиаловых кислот в крови. В норме, как правило, в свободном виде сиаловые кислоты встречаются в незначительном количестве [26]. Поскольку общий уровень сиаловых кислот является суммой двух фракций: связанных с гликоконъюгатами и свободно циркулирующих в кровотоке, его определение дает полную информацию об активности процессов сиалирования и десиалирования белков в организме [15]. Показана отрицательная корреляционная связь между концентрацией сиаловых кислот и α-1-кислого гликопротеина при миелопролиферативных заболеваниях, которая отсутствует в норме [15]. Известно, что нарушенное гликозилирование раковых клеток, в частности повышенный уровень сиалирования клеточных мембран, связано с процессом малигнизации, с инвазивным и метастатическим потенциалом клеток [27]. Установлено, что использование некоторых ингибиторов сиалирования позволяет снизить злокачественность раковых клеток. Десиалирование опухолевых клеток снижает их потенциал роста, делая более уязвимыми для клеток иммунной системы.

Однако в отличие от крови, где наблюдается увеличение уровня сиаловых кислот на фоне неопластического процесса, в слюне отмечаются противоположные изменения, а именно уменьшение их содержания. По-видимому, это обусловлено спецификой данной биологической жидкости, в частности высоким содержанием муцина. Для проверки этой гипотезы было проведено определение содержания муцина в слюне пациентов исследуемых групп. Установлено, что в слюне условно здоровых пациентов содержание муцина выше, чем у пациентов с РЛ (табл. 4), при этом наблюдается слабая положительная корреляционная связь между содержанием муцина и сиаловых кислот в слюне (R=0,34; p=0,000).

Таблица 4. Половозрастные особенности содержания муцина в слюне пациентов с раком легкого и условно здоровых, мг/л

По всей вероятности, в норме преобладают сиаломуцины слюны, тогда как при патологиях легких секретируются нейтральные и кислые муцины [28], при этом опухолевые клетки интенсивно связывают сиаловые кислоты [29], в результате чего уровень свободных сиаловых кислот в слюне в норме существенно выше, чем при РЛ.

Уровень сиаловых кислот в слюне снижается как на фоне рака легкого, так и при неопухолевых патологиях легких, что позволяет применять данный маркер для первичной диагностики патологий легких в целом, однако для дифференциальной диагност ики заболеваний легких определение только уровня сиаловых кислот является малоинформативным.

Среди включенных в исследование онкологических заболеваний определение уровня сиаловых кислот потенциально информативно лишь для пациентов с раком легкого, яичников, тела и шейки матки.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом