Питательная среда для каллусной ткани

питательная среда для получения каллусной ткани lemna minor l.

Классы МПК:	C12N5/04 клетки или ткани растений
Автор(ы):	Гюнтер Е.А. , Оводов Ю.С.
Патентообладатель(и):	Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН
Приоритеты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей, и может быть использовано в медицинской промышленности. Стерильные экспланты листецы Lemna minor L. помещают на агаризованную модифицированную питательную среду, содержащую смесь макро- и микросолей по Мурасиге и Скугу, смесь витаминов: фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Ca-пантотенат, пиридоксин, тиамин хлорид, никотинамид, кобаламин; фитогормоны: 6-БАП и 2,4-Д; сахарозу; агар-агар с последующей инкубацией при 261 o С в условиях темноты. Оптимизированная питательная среда позволяет получить каллусную ткань из водного растения Lemna minor L. (класс Monocotyledones) с достаточной частотой каллусогенеза. 1 табл.

Формула изобретения

Питательная среда для получения каллусной ткани Lemna minor L., характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
КNО 3 — 1900
NН 4 NО 3 — 1650
СаСl 2 — 332
МgSО 4 7Н 2 О — 370
КН 2 РО 4 — 170
FeSO 4 7Н 2 О — 27,85
Nа 2 ЭДТА — 37,25
Н 3 ВО 3 — 6,2
MnSО 4 5Н 2 О — 24,1
ZnSO 4 7Н 2 О — 8,6
Nа 2 МоО 4 — 0,25
КI — 0,83
CuSO 4 5Н 2 О — 0,025
СоСl 2 6Н 2 О — 0,025
Фолиевая кислота — 0,5
Рибофлавин — 0,5
Биотин — 1,0
Са-пантотенат — 1,0
Пиридоксин — 1,0
Тиамин хлорид — 1,0
Никотинамид — 2,0
Кобаламин — 0,0015
6-БАП — 1,0 — 1,5
2,4-Д — 0,5 — 2,0
Сахароза — 30000
Агар-агар — 8000
Вода — До 1 лк

Описание изобретения к патенту

Питательные среды для получения каллусной ткани Lemma minor L. из патентных и литературных источников нами не выявлены. Наиболее близкой к заявленному изобретению является питательная среда для получения каллусной ткани бегонии краснолистной (RU патент 1654841, МКИ C 12 N 5/04) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины: пиридоксинт 0,1 мг/л; тиамин 0,1 мг/л; никотиновая кислота 0,5 мг/л; инозитол 40 мг/л; сахароза 3%; 6-БАП 1 мг/л; 2,4-Д 1 мг/л. Данный состав питательной среды не позволяет получить каллусную ткань Lemma minor L.

Задачей настоящего изобретения является определение состава питательной среды для получения каллусной ткани водного растения Lemna minor L. (класс Monocotyledones).

В этом состоит новый технический результат.

Технический результат достигается тем, что стерильные экспланты листецы Lemna minor L. помещаются на агаризованную модифицированную питательную среду, которая в отличие от прототипа содержит дополнительно витамины: фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Ca-пантотенат, кобаламин при следующем количественном соотношении компонентов, мг/л:
KNO 3 — 1900
NH 4 NO 3 — 1650
CaCl 2 — 332
MgSO 4 7H 2 O — 370
KH 2 PO 4 — 170
FeSO 4 7H 2 O — 27,85
Na 2 ЭДТА — 37,25
H 3 BO 3 — 6,2
MnSO 4 5H 2 O — 24,1
ZnSO 4 7H 2 O — 8,6
Na 2 MoO 4 — 0,25
KI — 0,83
CuSO 4 5H 2 O — 0,025
CoCl 2 6H 2 O — 0,025
Фолиевая кислота — 0,5
Рибофлавин — 0,5
Биотин — 1,0
Ca-пантотенат — 1,0
Пиридоксин — 1,0
Тиамин хлорид — 1,0
Никотинамид — 2,0
Кобаламин — 0,0015
6-БАП — 1,0 — 1,5
2,4-Д — 0,5-2,0
Сахароза — 30000
Агар-агар — 8000
Вода — До 1 л
Пример 1. Для подтверждения получения каллусной ткани Lemna minor готовят питательную среду, используя химически чистые реактивы (хч, чда). Предварительно готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП, 2,4-Д, сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г агар-агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180 o C, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливают по 30 мл питательной среды.

Стерилизацию эксплантов проводят путем обработки 70%-ным этанолом (10-15 с), затем 5%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 5 мин с последующим 3-кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Индукцию каллуса проводят на модифицированной питательной среде следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины: фолиевая кислота 0,5 мг/л, рибофлавин 0,5 мг/л, биотин 1,0 мг/л, Ca-пантотенат 1,0 мг/л, пиридоксин 1,0 мг/л, тиамин хлорид 1,0 мг/л, никотинамид 2,0 мг/л, кобаламин 0,0015 мг/л; 6-БАП 1,0 мг/л; 2,4-Д 0,5 мг/л; сахароза 30000 мг/л; агар-агар 8000 мг/л.

Чашки Петри содержат в термостате при 261 o C в условиях непрерывной темноты. Спустя 4-5 недель на эксплантах происходит каллусообразование. Образовавшийся каллус желтого цвета, плотный. Первичный каллус, достигший размера 0,5 см, отделяют от экспланта и пассируют на агаризованную питательную среду для дальнейшего культивирования.

Примеры 2-5. Получение каллусной ткани проводят аналогично примеру 1, различиями являются модификации питательных сред, включающие различные концентрации 2,4-Д и 6-БАП. Результаты испытания 5 модификаций питательных сред на основе среды Мурасиге и Скуга представлены в таблице.

Таким образом, применение предлагаемого состава питательной среды позволяет получить каллусную ткань из водного растения Lemna minor L. (класс Monocotyledones).

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ SILENE VULGARIS (MOENCH) GARCKE Российский патент 2001 года по МПК C12N5/04

Описание патента на изобретение RU2171841C2

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей и может быть использовано в медицинской промышленности.

Питательные среды для получения каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke из литературных источников нами не выявлены. Наиболее близкой к заявленному изобретению является питательная среда для получения каллусной ткани бегонии краснолистной (RU патент 1664841, мки С 12 N 5/04) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: пиридоксин 0,1; тиамин 0,1; никотиновая кислота 0,5; инозитол 40; сахароза 3%; 6-БАП 1 мг/л; 2,4-Д 1 мг/л.

Задачей настоящего изобретения является определение состава питательной среды для получения каллусной ткани Silene vulgaris, которая способствует эффективному каллусообразованию за короткий срок культивирования.

В этом состоит новый технический результат, находящийся в причинно-следственной связи с существенными признаками изобретения.

Технический результат достигается тем, что стерильные экспланты прикорневые почки Silene vulgaris (М.) G. помещаются на агаризованную модифицированную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевая кислота 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Ca-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахароза 1,5%; глюкоза 1,5%; бакто-агар 8000 мг/л, с последующей инкубацией при 26±1 o C в условиях непрерывной темноты.

Для приготовления питательной среды используют химически чистые реактивы (хч, чда). Готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП, 2,4-Д, сахарозу, глюкозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г бакто-агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180 o C, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливают по 30 мл питательной среды.

В качестве эксплантов используют прикорневые почки, которые показали в ходе изучения каллусообразования эксплантов различного происхождения высокую эффективность (82%). Стерилизацию эксплантов проводят путем обработки 70%-ным этанолом (10-15 сек), затем 5%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 10 мин с последующим 3-кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Индукцию каллуса прикорневых почек проводят на модифицированной питательной среде следующего состава, мг/л:
Макросоли:
KNO₃ — 1900
NH₄N0₃ — 1650
CaCl₂ — 332
MgSO₄•7H₂O — 370
KH₂PO₄ — 170
Микросоли:
FeSO₄ • 7H₂O — 27,85
Na₂ЭДTA — 37,25
H₃ВО₃ — 6,2
MnSO₄ • 5H₂O — 24,1
ZnSO₄ • 7H₂O — 8,6
Na₂MoO₄ — 0,25
Kl — 0,83
CuSO₄ • 5H₂O — 0,025
CoCl₂ • 6H₂) — 0,025
Витамины:
Фолиевая кислота — 0,5
Рибофлавин — 0,5
Биотин — 1,0
Ca-пантотенат — 1,0
Пиридоксин — 1,0
Тиамин хлорид — 1,0
Никотинамид — 2,0
Кобаламин — 0,0015
Кинетин или — 1,5
6-БАП — 0,5
2,4-Д — 1,5-2,0
Сахароза — 15000
Глюкоза — 15000
Бакто-агар — 8000
Вода — до 1 л
Чашки Петри содержат в термостате при 26±1 o C в условиях непрерывной темноты. Спустя 6 дней на эксплантах происходит каллусообразование. Через 4 недели каллусную ткань отделяют от экспланта и пассируют на агаризованную питательную среду для дальнейшего культивирования. Для индуцирования каллусогенеза использовали 8 модификаций питательных сред на основе среды Мурасиге и Скуга.

Результаты исследований представлены в таблице.

Как видно из таблицы частота каллусогенеза высокая на средах 2,3,5,7, 8, на остальных средах ниже. Однако в ряде случаев у первичных каллусов появляются признаки корневой и стеблевой дифференциации. Самая высокая частота морфогенеза имеет место на средах 2 и 6. На средах 3, 5, 7 образуется плотный со слабым ростом каллус, клетки которого быстро приобретают бурую окраску и погибают. На средах 1, 2, 4 образуется рыхлый, оводненный каллус. Присутствие кинетина в среде (среды 6 и 8) также способствует формированию рыхлого, оводненного каллуса.

Наиболее благоприятными для получения каллусной ткани Silene vulgaris (М. ) G. являются сочетания фитогормонов кинетин (1,5 мг/л) + 2,4-Д (2,0 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л) + 2,4-Д (1,5 мг/л). Применение предлагаемого состава среды позволяет индуцировать каллусогенез за короткий срок — 6 дней с высокой эффективностью каллусообразования эксплантами (82% и 67% соответственно) и низкой частотой морфогенеза (9% и 11% соответственно). Кроме того, отмечаются хорошие качественные характеристики первичного каллуса — рыхлость и оводненность.

Иллюстрации к изобретению RU 2 171 841 C2

Реферат патента 2001 года ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ SILENE VULGARIS (MOENCH) GARCKE

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей, и может быть использовано в медицинской промышленности. Стерильные экспланты — прикорневые почки Silene vulgaris (Moench) Garcke помещают на агаризованную модифицированную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевая кислота 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Са-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахароза 1,5%; глюкоза 1,5%; агар 8000 мг/л, вода до 1 л с последующей инкубацией при 26±1°С в условиях непрерывной темноты. Каллусогенез индуцирован за 6 дней с высокой эффективностью каллусообразования эксплантами и низкой частотой морфогенеза. Повышаются качественные характеристики первичного каллуса — рыхлость и оводненность. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 171 841 C2

Питательная среда для получения каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke, характеризующаяся тем, что содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
КNО₃ — 1900
NН₄NО₃ — 1650
СаСl₂ — 332
МgSО₄•7Н₂О — 370
КН₂РО₄ — 170
FeSO₄•7Н₂О — 27,85
Nа₂ЭДТА — 37,25
Н₃ВО₃ — 6,2
MnSО₄•5Н₂О — 24,1
ZnSO₄•7Н₂О — 8,6
Nа₂МоО₄ — 0,25
КI — 0,83
CuSO₄•5Н₂О — 0,025
СоСl₂•6Н₂О — 0,025
Фолиевая кислота — 0,5
Рибофлавин — 0,5
Биотин — 1,0
Са-пантотенат — 1,0
Пиридоксин — 1,0
Тиамин хлорид — 1,0
Никотинамид — 2,0
Кобаламин — 0,0015
Кинетин или — 1,5
6-БАП — 0,5
2,4-Д — 1,5 — 2,0
Сахароза — 15000
Глюкоза — 15000
Агар — 8000
Вода — До 1 лв