Полимерные молекулы нуклеиновых кислот расщепляются в тканях преимущественно гидролитическим путем при участии специфических ферментов, относящихся к нуклеазам. В зависимости от характера действия на фосфодиэфирные связи и локализации остатка фосфата различают 3′-нуклеазы, расщепляющие сложноэфирные связи межнуклеозидного фосфата с С 5′ , и 5′-нуклеазы, гидролизующие связи c С 3′ . Кроме того, различают эндонуклеазы, разрывающие внутренние межнуклеотидные связи в молекуле ДНК и РНК, вызывающие деполимеризацию нуклеиновых кислот и образование олигонуклеотидов, и экзонуклеазы, катализирующие гидролитическое отщепление концевых мононуклеотидов от ДНК и РНК или от олигонуклеотидов.
Помимо гидролитических нуклеаз, имеются ферменты, катализирующие распад нуклеиновых кислот, в частности посредством трансферазной реакции. Они катализируют перенос остатка фосфорной кислоты от 5-го углеродного атома рибозы одного мононуклеотида ко 2-му углеродному атому соседнего мононуклеотида, сопровождающийся разрывом межнуклеотидной связи и образованием фосфодиэфирной связи между 2-м и 3-м углеродным атомами рибозы одного и того же мононуклеотида. К настоящему времени открыты следующие группы нуклеаз, катализирующие распад ДНК и РНК.
Дезоксирибонуклеазы I катализируют разрыв внутренних фосфодиэфирных связей в одной из двух цепей молекулы ДНК между 3′-м углеродным остатком дезоксирибозы и остатком фосфата с образованием низкомолекулярных олигодезоксирибонуклеотидов:
ДНК + (n — 1) Н2O —> n Олигодезоксирибонуклеотиды
Среди продуктов реакции открываются также моно- и динуклеотиды. Типичными представителями этих ферментов являются ДНК-азы поджелудочной железы. Одна из них была получена в чистом виде, расшифрована последовательность всех ее 257 аминокислот. Фермент наиболее активен при pH 6,8-8,0, активируется дивалентными ионами Mg 2+ и Мn 2+ и ингибируется конечными продуктами ферментативной реакции — олигонуклеотидами.
Дезоксирибонуклеазы II вызывают деполимеризацию молекулы ДНК в результате парных разрывов фосфодиэфирных связей обеих цепей ДНК с образованием более крупных олигодезоксирибонуклеотидов. Представителем их является ДНКаза II, выделенная из селезенки, имеющая молекулярную массу 38 000 дальтон и состоящая из 343 аминокислот. В составе этой ДНК-азы открыт глюкозамин. Фермент также активируется ионами металлов, ингибируется анионами; его оптимум pH колеблется между 4,5 и 5,5.
Помимо этих ферментов, открыты (преимущественно у микроорганизмов) еще экзодезоксирибонуклеазы, гидролизующие фосфодиэфирные связи молекулы ДНК с отщеплением концевых 5′-дезоксирибонуклеотидов; в частности, из Е. coli выделено 4 таких фермента, обозначаемых экзодезоксирибонуклеазами I, II, III и IV.
Рестриктазы — ферменты ДНК-азного действия, катализируют распад чужеродной (в основном фаговой) ДНК в строго определенных зонах молекулы, имеющих структуру палиндромов. Из Е. coli выделены и охарактеризованы две такие рестриктазы, обозначаемые EcoRI и EcoRII соответственно. Поскольку рестриктазы действуют на строго определенные участки молекулы, они используются для расшифровки последовательности нуклеотидных остатков в ДНК фагов и вирусов. Более того, это уникальное свойство рестриктаз находит все большее практическое применение в генной инженерии по «вырезанию» определенных фрагментов ДНК и «встраиванию» их в геном бактериальной ДНК, способствуя тем самым передаче клетке ряда не свойственных ей прежде наследственных свойств. Теоретическое и главным образом практическое значение подобных исследований трудно переоценить. Этим объясняется пристальное внимание многих ученых к разработке проблем генной инженерии. Свидетельством огромного интереса к подобным исследованиям является создание в рамках АН СССР и стран — участниц СЭВ комплексной программы — проекта «Рестриктазы».
Из ферментов, катализирующих гидролитический распад РНК, наиболее изученными являются рибонуклеазы I. Они гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри молекулы РНК. К настоящему времени выделена РНК-аза из поджелудочной железы многих животных. Она состоит из 124 аминокислот во всех РНК-азах, хотя последние несколько различаются по последовательности аминокислотных остатков; выяснена также третичная структура ряда РНК-аз.
Получен в гомогенном состоянии из плесневого гриба аспергилла другой фермент — гуанилорибонуклеаза, катализирующая деполимеризацию РНК с образованием гуанозин-3-фосфата и олигонуклеотидов.
Читайте также: Как сшить помпон из ткани
Из ферментов, осуществляющих распад ДНК и РНК не по гидролитическому пути, следует назвать полинуклеотидфосфорилазу и группу ДНК-гликозидаз. Первая открыта в лаборатории С. Очоа еще в 1955 г. В настоящее время подробно изучены физико-химические свойства и биологическая роль микробной полинуклеотидфосфорилазы в лаборатории С. С. Дебова; в той же лаборатории фермент открыт в животных тканях. Механизм действия фермента сводится к переносу нуклеотидных остатков с РНК на неорганический фосфат:
Предполагают, что in vivo фермент катализирует распад клеточных РНК, предпочтительнее мРНК, до нуклеозиддифосфатов, участвуя тем самым в регуляции концентрации клеточного неорганического фосфата. Следует указать еще на одну не менее важную уникальную функцию полинуклеотидфосфорилазы — способность фермента катализировать в опытах in vitro синтез из свободных нуклеозиддифосфатов полирибонуклеотидов с заданной последовательностью. Эта функция фермента сыграла выдающуюся роль в расшифровке кода белкового синтеза (см. ниже) в лабораториях лауреатов Нобелевской премии С. Очоа и М. Ниренберга.
Группа ДНК-гликозидаз участвует в акциях отщепления модифицированных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, урацила, образовавшегося при дезаминировании остатка цитозина в одной из цепей ДНК). В серии последующих реакций при участии ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы брешь восполняется включением соответствующего и отсутствующего мононуклеотида. Таким образом, ДНК-гликозидазы выполняют важную функцию в процессах репарации (восстановления структуры) молекулы ДНК.
В результате последовательного действия разнообразных клеточных экзо- и эндонуклеаз нуклеиновые кислоты подвергаются распаду до стадии рибо- и дезоксирибонуклеозид-3′- и 5′-фосфатов.
Дальнейший распад образовавшихся продуктов связан с ферментативными превращениями мононуклеотидов и нуклеозидов, далее свободных азотистых оснований. Известно, что адениловая кислота, кроме того, подвергается в животных тканях обратимому дезаминированию в инозиновую кислоту. На первом этапе гидролиза действуют 3′- или 5′-нуклеотидазы, катализирующие гидролитический распад мононуклеотидов по уравнению:
На втором этапе распада имеет место перенос остатка рибозы от нуклеозида на свободную фосфорную кислоту с образованием рибозо-1-фосфата и свободного азотистого основания. По этому пути окисляются преимущественно пиримидиновые нуклеотиды (см. ниже).
Распад пиримидиновых нуклеозидов
Последовательность ферментативных реакций гидролиза пиримидиновых нуклеозидов можно видеть из представленной схемы:
Как видно из приведенной схемы, начальные этапы реакции распада пиримидиновых нуклеотидов катализируются специфическими ферментами; конечными продуктами реакции являются СO2, NH3, мочевина, β-аланин и β-аминоизомасляная кислота. Следует указать, что гидролитический путь распада пиримидинов является, очевидно, главным путем образования β-аланина, который может служить источником для синтеза ансерина и карнозина (см. Биохимия мышц), а также для образования коэнзима А. Известно, кроме того, что β-аланин в животных тканях подвергается дальнейшему распаду. В частности, в тканях животных открыта специфическая трансаминаза, катализирующая трансаминирование между β-аланином и пировиноградной кислотой. В процессе этой обратимой реакции синтезируются β-аланин и формилацетат (полуальдегид малоновой кислоты):
Образовавшийся формилацетат далее подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием углекислоты и ацетил-КоА:
Распад пуриновых нуклеозидов
Последовательность ферментативных реакций гидролиза пуриновых нуклеозидов можно видеть из представленной схемы:
Как видно из приведенной схемы, образовавшиеся при гидролизе пуриновые мононуклеозиды — аденозин и гуанозин подвергаются ферментативному (см. ниже) распаду в организме животных вплоть до образования конечного продукта — мочевой кислоты, которая выводится с мочой из организма.
У человека, приматов, большинства животных, у птиц и некоторых рептилий мочевая кислота является конечным продуктом пуринового обмена; у других рептилий и млекопитающих мочевая кислота расщепляется до аллантоина, а у рыб — до аллантоиновой кислоты и мочевины. Последовательность всех этих превращений катализируется специфическими ферментами, указанными на схеме.