Восстановление дефектов костной ткани нижней челюсти является одной из наиболее актуальных проблем современной стоматологии и ортопедии. Причины потери костной ткани разнообразны: удаление зубов, воспалительные процессы, травмы, опухоли, остеопороз. В ряде случаев в стоматологической практике процесс ортопедической реабилитации связан с необходимостью заживления костных дефектов нижней челюсти. В связи с этим поиск оптимального материала для пластического замещения дефектов нижней челюсти является актуальным.
В последние годы широкое распространение получили методы клеточной терапии, основанные на применении остеогенных клеток, полученных из различных тканевых источников: костного мозга, жировой ткани [4], пульпы зуба, периферической крови и т.д. [1]. По мере накопления и анализа данных, касающиеся клеточной инженерии формируется новое направление: разработка различных конструкций по своим биологическим свойствам, приближающимся к нативной костной ткани [2, 3].
Совершенно очевидно, что использование тканеинженерных конструкции должно быть четко аргументировано в зависимости от характера, типа и локализации повреждения. В связи с этим, накопленный в настоящее время достаточно обширный материал нуждается в дальнейших экспериментальных и клинических подтверждениях эффективности конструкций и выработке четких показаний к их использованию. Одним из требований к пластическому материалу при ортопедической и любой другой патологии является тканеспецифичность, отсутствие токсичности, высокий регенераторный потенциал и формирование органоспецифической ткани в зоне трансплантации [5].
Выбор пластического материала для замещения дефекта костной ткани связан особенностями гистогенеза нижней челюсти. Известно, что в процессе эмбрионального развития и при регенерации костная ткань формируется на основе десмального остеогенеза.
Подобным требованиям отвечает разработанный в Новосибирском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. Я.Л.Цивьяна трехмерный остеотрансплантат. Структурная композиция трехмерного остеотрансплантата представлена клетками, матриксом и сосудами, что обеспечивает быструю адаптацию в условиях трансплантации.
Преимуществом остеотрансплантата являются: отсутствие антигенной активности, что позволяет производить ксенотрансплантацию.
Цель: исследовать остеорегенераторные потенции остеотрансплантата при замещении дефекта костной ткани нижней челюсти в эксперименте.
Исследование выполнено на животных с соблюдением положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации и Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (утв. Приказом Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 19.03.2003 г. №226).
Материалом для культивирования служили хондробласты, извлеченные в стерильных условиях из позвоночника новорожденного мини – поросенка. В стерильных условиях выделяют пластинки роста тел позвонков. Пластинки роста дважды промывают раствором фосфатного буфера и измельчаются в чашке Петри скальпелем. Кусочки переносятся в пробирки с раствором 1,5 % коллагеназы в среде RPMI 1640 с добавлением 20% FBS. Инкубируют в течение 12 часов. Далее суспензию дважды промывают от коллагеназы раствором фосфатного буфера. Клетки ресуспензируют в PBS. Жизнеспособность клеток хондробластов оценивают с помощью красителя трипанового синего в счетной камере Горяева.
Выделенные хондробласты культивируют в условиях инкубатора при 37°С при 90% влажности и 5% СО2 в чашках Петри в культуральной среде RPMI 1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л в течение 3-4 недель. Далее производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА. Клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат культивируют в 6-луночном планшете с питательной средой 10% FBS в течение 4-6 недель. Смену среды осуществляли 2 раза в неделю до получения хондротрансплантата.
Остеогенную дифференцировку хондротрансплантата производили путем помещения в питательную среду, содержащую индукторы остеогенной дифференцировки: 10 милимоль/л ß-глицерофосфа, 100 наномоль/л дксаметазона и 0,2 милимоль/л аскорбиновой кислоты.
Остеогенную дифференцировку трансплантата подтверждали методами традиционной морфологии, гитстохимии.
Основными структурными компонентами трехмерного остеотрансплантата являются остеогенные клетки (остеобласты), предкостный матрикс, содержащий гидроксиаппатит, коллаген I типа и протеогликаны. Наличие сформированных каппилляров является фактором быстрой остеоинтеграции в условиях трансплантации.
Благодаря данным особенностям трехмерный остеотрансплантат обладает потенциями к формированию диффинитивной костной ткани.
Экспериментальная проверка регенераторных потенций остеотрансплантата выполнена на 10 самцах крыс линии Wistar, возрастом 1 месяц. Под общим наркозом, скальпелем произвели разрез 5 мм в проекции угла нижней челюсти. Распатором отслоили жевательную мышцу – обнажили кость. При помощи твердосплавного шаровидного бора, с вестибулярной поверхности ветви нижней челюсти на расстоянии 3 мм выше угла нижней челюсти, сформировали трепанационное отверстие диаметром 1 мм. Животным I группы дефект заполняли трехмерным остеотрансплантатом диаметром 1,2 мм. За счет трехмерной структуры и упруго эластических свойств остеотрансплантат плотно прилегал к стенкам артифициального дефекта. Замещенный трехмерный остеотрансплантатом дефект закрывали фасцией и жевательной мышцей. Десяти животным контрольной группы формировали трепанационное отверстие диаметром 1 мм, и закрывали фасцией и жевательной мышцей, не заполняя дефект. Рану ушили материалом «Vicryl».
Читайте также: Изменение тканей полости рта при агранулоцитозах
Животных выводили из эксперимента через 2 недели, 1, 3, 6 месяцев. Визуально оценивали наличие остаточного дефекта и выраженность гипертрофии мягких и костных тканей в области трансплантации. Зону трансплантации исследовали рентгенологически. Препараты нижней челюсти фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальцинировали в трилоне «Б», после проводки заливали в парафин и окрашивали гематоксилинэозином и по Ван Гизону. Оценку процесса репаративного остеогенеза проводили под микроскопом «Carl Zeiss».
Через 2 недели эксперимента (рис 1) зона бывшего дефекта заполнена остеогенной тканью, среди которой сформированы первичные костные структуры. Вокруг первичных костных балочек располагаются активные остеобласты в виде цепочек. Межбалочное пространство занято остеобластами на разной стадии дифференцировки и сосудистыми полостями, выстланными эндотелием. Зона трансплантации окружена костной тканью с признаками активации остеогенеза: на внутренней поверхности костных балок располагаются активные остеобласты.
Через 1 месяц эксперимента (рис.2) в зоне трансплантации сформирована примитивная костная ткань балочного строения. Между балками располагается костный мозг и сосуды, заполненные эритроцитами. Костные балки имеют мозаичное строение. Участки более зрелой костной ткани с регулярным расположением остеобластов и линиями склеивания чередуются с зонами примитивной костной ткани. Остеобласты располагаются нерегулярно, матрикс гомогенный, линии склеивания отсутствуют. Костные структуры окружены цепочками остеобластов. Активный процесс остеогенеза продолжается.
Через 3 месяца эксперимента (рис.3) зона трансплантации заполнена костной тканью балочного строения. В некоторых участках процесс трансформации в органоспецифическую костную ткань все еще не завершен. Участки примитивной костной ткани располагаются среди зрелых структур. Процесс остеогенеза еще не закончен. Вокруг костных балок располагаются активные остеобласты. Между костными структурами сформированы очаги костного мозга.
Через 6 месяцев эксперимента (рис.4) в области пластического замещения дефекта остеотрансплантатом образовался единый костный массив. Зона трансплантации слилась с материнским ложем, границы бывшего дефекта установить невозможно. В центре сформированной костной ткани происходит процесс ремоделирования в пластинчатую костную ткань органоспецифичную для нижней челюсти. На поверхности располагается костная пластинка зрелого строения, в центральных отделах более зрелые структуры чередуются с участками в состоянии ремоделирования.
Через 6 месяцев эксперимента (контроль) (рис.5) артифициальная полость заполнена соединительно-тканным регенератом плотноклеточной структуры, между фибробластами и единичными сосудами располагаются коллагеновые волокна. Процесс костеобразования отсутствует.
Рис 1. Зона бывшего дефекта заполнена примитивной костной и остеогенной тканью. Гематоксилин-эозин х 400
Регенерация костная ткань экспериментальная
Приоритетом научных изысканий в регенеративной медицине является формирование тканеинженерных конструкций, способных в короткие сроки восстановить дефекты костной ткани. Непременными условиями, предъявляемыми к подобным конструкциям, является биосовместимость, иммунотолерантность и возможность формирования костной ткани denovo на месте замещенного дефекта [2,3,6,7]. В этой связи вопрос о выборе материала для замещения костного дефекта, близкого к ткани реципиента, остается весьма актуальным.
Формирование регенерата костной ткани в некоторых анатомических областях человека имеет ряд эволюционных особенностей, проявляющихся на стадиях эмбриогенеза. Так, замещение костного дефекта лицевого черепа ограничено особенностями эмбрионального развития этой анатомической области, в которой основой для остеогенеза служат клетки, являющиеся производными нервного гребня. И забор материала для регенерации костной ткани нейрального генеза в этом случае должен производиться из пульпы зуба, периодонтальной связки, зубного фолликула и т.д. [1].
Другой областью, представляющей значительный интерес исследователей, является позвоночник – основа опорно-двигательного аппарата. Действительно повреждения позвоночника относятся к числу наиболее тяжелых травм [2,8]. Нарушение целостности костной ткани, возникающее при переломе тела позвонка, требует реконструктивного хирургического вмешательства и замещения образовавшегося дефекта с помощью имплантации различных материалов [4]. Альтернативой аутотрансплантатам и аллотрансплантатам являются костные имплантаты на основе скаффолдов и трехмерных клеточных конструкций [3].
В Новосибирском НИИТО апробирован в эксперименте трехмерный остеотрансплантат, который был создан путем прямой трансдифференцировки из трехмерного хондротрансплантата (патент RU 2574942). Остеотрансплантат состоит из клеток остеогенного ряда и матрикса, содержащего тканеспецифические белки предкостной ткани, минеральные компоненты в виде матричных пузырьков и кальцификатов, щелочной фосфатазы и сосудистой эндотелиальной выстилки [8]. Подобная структурная композиция остеотрансплантата, по существу, является аналогом эмбриональной костной ткани, что позволяет предполагать возможность использования последней для более широкого спектра регенерации тканей. Тем более что предварительные исследования применения остеотрансплантата для регенерации дефекта нижней челюсти показало подобную возможность.
Читайте также: Стул дионис эмаль тон 11 золот патина ткань palermo
Цель исследования: изучение регенерации костной ткани разного генеза при замещении её дефектов трехмерным остеотрансплантатом в эксперименте.
Материалы и методы
Исследование выполнено на мини-свиньях с соблюдением положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации и Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (утв. приказом Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 19.03.2003 г. №226), одобрено локальным этическим комитетом Новосибирского НИИТО.
Основой для создания остеотрансплантатов послужили хондротрансплантаты, изготовленные из культивированных хондробластов, извлеченных в стерильных условиях из позвоночника новорожденного мини-поросенка. Выделение клеток из ткани, культивирование хондробластов, формирование хондротрансплантата осуществляли согласно запатентованным методикам (патенты RU № 2285039 и № 2392973). Направленную остеогенную дифференцировку производили на основе хондротрансплантата при помощи остеоиндуктивной среды на основе RPMI-1640 с 15 % FBS, стрептомицин-пенициллином, амфотерицином В и индукторами остеогенной дифференцировки клеток: 10 мМ/л ß-глицерофосфа, 100 нМ/л дексометазона и 0,2 мМ/л аскорбиновой кислоты, методом, описанном в патенте (патент RU № 2574942).
Эксперимент по регенерации дефекта костной ткани тела позвонка остеотрансплантатом осуществляли на мини-свиньях (возраст 6 месяцев). Под общим наркозом выполняли передний забрюшинный доступ к телам поясничных позвонков. При помощи бора формировали костный дефект в вентральном отделе тела позвонка размерами в глубину и ширину соответствующий размерам трансплантата (около 5 мм). В сформированный дефект укладывали с плотным прилеганием к материнскому ложу трехмерный остеотрансплантат. В качестве контроля использовали незаполненный, сформированный при помощи бора стандартный костный дефект в теле позвонка [8]. Животных выводили из эксперимента через 1 и 3 месяца. Фиксацию, проводку материалов и изготовление морфологических препаратов проводили по традиционной методике. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином по Ван-Гизону.
Эксперимент по регенерации дефекта нижней челюсти выполняли на 10 самцах крыс линии Wistar, возрастом 1 месяц. Под общим наркозом скальпелем производили разрез 5 мм в проекции угла нижней челюсти. Распатором отслаивали жевательную мышцу, обнажая кость. При помощи твердосплавного шаровидного бора с вестибулярной поверхности ветви нижней челюсти на расстоянии 3 мм выше угла нижней челюсти формировали трепанационное отверстие диаметром 1 мм. Животным I группы дефект заполняли трехмерным остеотрансплантатом диаметром 1,2 мм. За счет трехмерной структуры и упруго эластических свойств остеотрансплантат плотно прилегал к стенкам артифициального дефекта. Замещенный трехмерный остеотрансплантатом дефект закрывали фасцией и жевательной мышцей. 10 животным контрольной группы формировали трепанационное отверстие диаметром 1 мм, и закрывали фасцией и жевательной мышцей, не заполняя дефект. Рану ушивали материалом «Vicryl».
Животных выводили из эксперимента через 1, 3 и 6 месяцев. Визуально оценивали наличие остаточного дефекта и выраженность гипертрофии мягких и костных тканей в области трансплантации. Выделенные препараты фиксировали, декальцинировали, изготавливали парафиновые блоки, окрашивали методом гематоксилин-эозином по Ван Гизону.
Эксперимент по регенерации дефекта костной ткани тела позвонка мини-поросенка
Через месяц после пересадки остеотрансплантата зона дефекта полностью замещена сформированной грубоволокнистой костной тканью (Рис. 1А).
А 
Б
В 
Г
Рис.1. Зона дефекта костной ткани тела позвонка мини-поросенка, заполненная остеотрансплантатом: А – через 1 месяц после трансплантации; Б – через 3 месяца после трансплантации; В – через 6 месяцев после трансплантации; Г – контрольная серия через 6 месяцев (пояснения в тексте); гематоксилин-эозин, ув. 200
Костные балки широкие, нерегулярного строения, с большим количеством хаотично расположенных остеобластов, линии склеивания отсутствуют. По краям балок большое скопление активно синтезирующих клеток, которые располагаются несколькими рядами. Среди остеобластов встречаются преостеобласты – клетки треугольной формы с округлым базофильным, эксцентрично расположенным ядром и интенсивно базофильной, альциан-позитивной цитоплазмой. Между костными балками выявляется преостеогенная ткань с большим количеством клеток, комитированных к остеогенезу, и кровеносных сосудов; встречаются участки гемопоэтической ткани с небольшими включениями жировых клеток.
В контрольной серии через 1 месяц в зоне дефекта сформирована соединительная ткань.
Через 3 месяца в области пластического замещения остеотрансплантатом сформирована костная ткань пластинчатого строения, заполнившая все пространство бывшего дефекта (Рис. 1Б). Регенерат представлен костными балками, находящимися в состоянии перестройки. Между костными структурами располагается гемопоэтическая ткань и сосуды.
Читайте также: Основной процесс прядения ткани
В контрольной серии через 3 месяца в зоне дефекта сформирована грубоволокнистая фиброзная ткань с редкими сосудами и нерегулярными фрагментами костных структур.
Через 6 месяцев область бывшего дефекта тела позвонка полностью замещена органоспецифической костной тканью (Рис. 1В). Границы имплантации нивелированы.
В контрольной серии через 6 месяцев зона дефекта замещена грубоволокнистой фиброзной тканью с редкими сосудами и фрагментами костных структур (Рис. 1Г).
Эксперимент по регенерации дефекта нижней челюсти крысы
Через 1 месяц эксперимента в зоне трансплантации сформирована примитивная костная ткань балочного строения (Рис.2А). Между балками располагается костный мозг и сосуды, заполненные эритроцитами. Костные балки имеют мозаичное строение. Участки более зрелой костной ткани с регулярным расположением остеобластов и линиями склеивания чередуются с зонами примитивной костной ткани. Остеобласты располагаются нерегулярно, матрикс гомогенный, линии склеивания отсутствуют. Костные структуры окружены цепочками остеобластов. Активный процесс остеогенеза продолжается.
Через 3 месяца эксперимента зона трансплантации заполнена костной тканью балочного строения (Рис. 2Б). В некоторых участках процесс трансформации в органоспецифическую костную ткань все еще не завершен. Участки примитивной костной ткани располагаются среди зрелых структур. Процесс остеогенеза еще не закончен. Вокруг костных балок располагаются активные остеобласты. Между костными структурами сформированы очаги костного мозга.
А 
Б
В 
Г
Рис.2. Зона дефекта нижней челюсти крысы, заполненная остеотрансплантатом:
А – через 1 месяц после трансплантации;Б – через 3 месяца после трансплантации;
В – через 6 месяцев после трансплантации; Г – контрольная серия через 6 месяцев
(пояснения в тексте); гематоксилин-эозин, ув. 200
Через 6 месяцев эксперимента в области пластического замещения дефекта остеотрансплантатом образовался единый костный массив (Рис. 2В). Зона трансплантации слилась с материнским ложем, границы бывшего дефекта установить невозможно. В центре сформированной костной ткани происходит процесс ремоделирования в пластинчатую костную ткань, органоспецифичную для нижней челюсти.
В контрольной серии через 6 месяцев артифициальная полость заполнена соединительнотканным регенератом плотноклеточной структуры (Рис. 2Г). Процесс костеобразования отсутствует.
Процесс регенерации дефекта костной ткани различного генеза происходит в два этапа: 1) формирование первичной костной ткани на основе остеотрансплантата; 2) формирование органоспецифической костной ткани в соответствии с биомеханическими потребностями органа.
Первичный костный регенерат образуется за счет инвазии сосудов из материнского ложа дефекта, в соответствии с общебиологическими закономерностями эмбрионального остеогенеза. Сформированная вокруг сосудов костная ткань обеспечивает устойчивость к нагрузке.
Вторым этапом происходит перестройка первичной костной ткани в органоспецифическую костную ткань. Особенностью регенерации костной ткани на основе остеотрансплантата является ангиогенный тип остеогенеза, который обеспечивается структурными компонентами пластического материала: клетки остеобластического ряда, синтезируют углеводные, белковые и минеральные компоненты матрикса, сосудистые полости с эндотелиальной выстилкой, нарабатывающие факторы роста, инициируют васкуляризацию регенерата и остеогенез. Сформированный in vitro трансплантат, представляет собой остеогенную ткань, которая позволяет восстановить дефект костной ткани в короткие сроки.
Одной из уникальных особенностей трансплантата является его иммунотолерантность. Как видно из фактических данных, процесс интеграции остеотрансплантата в дефекты: нижней челюсти (производное нервного гребня) и тело позвонка (производное мезенхимы) происходит однотипно. Вместе с тем пластическое замещение дефекта нижней челюсти хондротрансплантатом вызвало формирование гранулемы (Зайдман А.М., неопубликованные данные). Процесс несовместимости хондротрансплантата и объекта пластического замещения вполне объясним – энхондральный остеогенез не свойственен нижней челюсти. Остеотрансплантат, полученный путем прямой трансдифференцировки на основе хондротрансплантата, оказался иммунотолерантным. Об этом свидетельствует отсутствие реакции регионарных лимфатических узлов при пересадке остеотрансплантата в костную ткань нижней челюсти крысы [5]. Данный феномен нуждается в дальнейших исследованиях. В настоящее время можно предположить несколько объяснений: 1) эмбриональные остеогенные клетки трансплантата лишены рецепторов к антигенам; 2) отсутствие гемопоэтической ткани в остеотрансплантате обеспечивает иммунотолераность; 3) при пересадке остеотрансплантата проходит быстрая реакция формирования собственных клеток, взамен клеток трансплантата (что является наиболее вероятным).
Остеотрансплантат, полученный путем прямой трансдифференцировки из хондротрансплантата в остеогенной среде, обладает высокими регенераторными потенциями и иммунотолерантностью.
Регенерация костной ткани на основе остеотрансплантата независимо от его гистогенеза происходит путем первичного остеогенеза.
Причины иммунотолерантности остеотрансплантата подлежат дальнейшему более глубокому исследованию.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом