Роль кальция, витамина D3 и остеотропных минералов в профилактике и комплексном лечении перелома берцовой кости: результаты рандомизированного плацебо
Проведенное исследование на модели перелома берцовой кости у капюшонных крыс показало высокую эффективность применения комбинированного средства, содержащего кальций, витамин D3 и остеотропные минералы, для улучшения регенерации костной ткани.
The conducted research on the cannon-bone fracture model in hooded rats has shown high efficiency of application of combined medication which contains calcium, D3 vitamin and osteotropic minerals, which improves osseous tissue regeneration.
На сегодняшний день отмечается возрастание частоты повреждений органов опорно-двигательного аппарата и тканей. Этому способствуют природные и антропогенные катастрофы, бурное развитие всех видов транспорта, что обусловливает высокий травматизм в мирное время. Во время вооруженных конфликтов, террористических актов процент травматизма возрастает в разы. Данные обстоятельства требуют от врачей надежных средств, методов и результатов лечения.
На протяжении многих лет механические свойства костной ткани, а также механизмы, лежащие в основе их изменений при различных заболеваниях, представляют значительный научный и медицинский интерес. Знание этих механизмов позволяет детальнее углубиться в процессы патогенеза заболеваний опорно-двигательной системы человека, что открывает новые перспективы не только в вопросах профилактики и лечения таких патологий, как остеоартроз крупных и мелких суставов, асептический некроз костей, но и в реабилитации после переломов [1].
Центральным механизмом репарации костной ткани является формирование костного матрикса, структурной основой которого являются коллагеновые волокна. Костный матрикс, который является основой для усвоения кальция скелетом, на 90% состоит из коллагена 1-го типа. В активную фазу репарации кости отмечается повышение синтеза коллагена 3-го типа. Поскольку синтез коллагена любого типа зависит от обеспеченности организма рядом остеогенных микронутриентов, то и время репаративного остеогистогенеза после перелома, и качество срастания кости существенно зависят не только от кальция и витамина D, но также от остеогенных микронутриентов: цинка, марганца, бора, меди, магния. Однако, несмотря на многочисленные публикации с патофизиологическим обоснованием роли указанных микронутриентов в метаболизме костной ткани, до настоящего времени отсутствовали как экспериментальные, так и клинические данные, подтверждающие их влияние в составе лекарственных средств на коллаген и другие компоненты органического матрикса кости, особенно в ходе регенерации после переломов. Настоящее исследование является попыткой в какой-то мере восполнить этот пробел. В качестве изучаемого препарата было избрано доступное на отечественном рынке лекарственное средство Кальцемин Адванс, предназначенное для повышения обеспеченности организма остеогенными микронутриентами.
Материалы и методы исследования
Целью нашего исследования являлось изучение влияние препарата Кальцемин Адванс на регенерацию, биомеханические свойства и содержание коллагена в костной ткани после перелома берцовой кости. До начала эксперимента было получено разрешение этического комитета ГБОУ ВПО ИвГМА на проведение данного исследования от 6.09.2014 г.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1) формирование контрольных и опытных групп объектов исследования (капюшонные крысы) по принципу однородности; 2) проведение операции; 3) зондирование крыс Кальцемином Адванс (опытная группа) и водой (контрольная группа); 4) отслеживание динамики регенерации, включая оценку биомеханических свойств кости; 5) оценка уровней коллагенов 1-го и 3-го типа в кости; 6) оценка гистологической картины костной ткани в месте перелома (костной мозоли).
Отбор крыс осуществлялся по следующим критериям: в исследование были включены здоровые животные (блестящие глаза; кожные покровы чистые, без видимых повреждений, густой, блестящий мех), активные, с хорошим аппетитом, возраст около 1 года, весом от 280 до 350 грамм. При вхождении в эксперимент проводилось взвешивание животных на электронных весах. Данные о каждом животном заносились в таблицу с указанием номера, веса, особенностей окраски и других показателей. Каждая крыса маркировалась пикриновой кислотой по мере вхождения в эксперимент, после чего было произведено отсаживание экспериментальных крыс в отдельные клетки.
Читайте также: Цветовая гамма ткани рогожка
Непосредственно перед операцией проводили контрольное взвешивание и оценку физического состояния животных. В качестве обезболивающего средства использовали хлоралгидрат (350 мг/кг внутрибрюшинно). После ввода в наркоз животное фиксировалось в станке, в области бедра правой задней конечности удалялся волосяной покров, на бедре рассекались ткани, обнажалась малоберцовая кость, после чего производился контролируемый перелом кости. Затем края раны стягивались и зашивались непрерывным швом, на лапу животного накладывалась шина. Затем каждая крыса помещалась в отдельную клетку; всем животным обеспечивались одинаковые условия (доступ к воде, стандартный рацион вивария, одинаковая освещенность и режим проветривания).
Зондирование препаратом и контроль регенерации проводились 5 раз в неделю в течение 30 дней. С первого дня после операции проводились измерения площади перелома в контрольной и опытной группах, затем проводилось зондирование препаратом или водой. Контрольная группа (n = 30) получала воду (3 мл), опытная группа (n = 30) — препарат Кальцемин Адванс из расчета 0,1 мл взвеси на килограмм массы тела. Для сравнений также использовались данные о состоянии костной ткани животных в интактном контроле (без перелома, n = 10).
Навески препарата приготавливались на электронных весах. На 31-й день животных всех групп выводили из эксперимента. Спустя сутки после последнего приема Кальцемина Адванс крыс декапитировали (под наркозом с использованием хлоралгидрата в дозе 700 мг/кг внутрибрюшинно). Затем иссекали область перелома и проводили окрашивание костной ткани в месте перелома специальными методиками с последующим приготовлением микросрезов кости в месте перелома для гистологической оценки и изучали уровни коллагена в костной ткани в месте перелома в группе 1 и 2.
Определение коллагена в образцах костной ткани
Определение коллагена (общего, 1-го или 3-го типов) в тканях обычно проводится путем растворения коллагена посредством пептидаз (QuickZyme, Chondrex и др. методики). Однако данный метод неприменим для определения коллагена в кости, т. к. пептидазы растворяют не более 10–12% коллагена в кости. Поэтому для оценки коллагенового метаболизма при оценке заживления кости после перелома целесообразно использовать иммуногистохимический анализ.
Для иммуногистохимической оценки экспрессии коллагенов 1-го и 3-го типа депарафинизированные срезы кости промывали натрий-фосфатным буфером, инкубировали с 0,3% перекисью водорода в течение 20 мин, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы с последующей инкубацией с 5% бычьего сывороточного альбумина. Затем срезы инкубировали с оптимальными концентрациями первичных антител для COL-I (1:100; Sigma Aldrich, Сент-Луис, США) в течение ночи при 4 °С. После три раза промывали натрий-фосфатным буфером, срезы инкубировали с биотинилированными вторичными антителами в течение 20 мин перед инкубацией с конъюгированным с пероксидазой хрена авидинбиотиновым комплексом в течение еще 20 мин. Иммуноокрашивание визуализировали после добавления 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорида. Затем срезы прокрашивали гематоксилином Харриса в течение 40 сек, в пределах от 3 мин полосканий с проточной водой. Срезы обезвоживали растворами этанола повышающихся концентраций и очищали в ксилоле. Образцы были исследованы под световым микроскопом Olympus (Япония). Для подтверждения результатов каждый эксперимент был повторен по крайней мере три раза. Регенерация кости на этих гистологических срезах оценивалась по полуколичественной балльной шкале с помощью модифицированного метода подсчета баллов [2]. Число остеокластов подсчитывали под световым микроскопом.
Читайте также: Как сделать снуд из ткани
Результаты и обсуждение
Исследование показало, что включение препарата в стандартную терапию перелома берцовой кости приводит к улучшению биомеханических свойств кости, увеличению скорости и качества формирования костной мозоли. Кроме того, методами иммуногистохимии было установлено повышение синтеза коллагенов 1-го и 3-го типа в зоне срастания перелома. В соответствии с рандомизированным дизайном исследования, все эти эффекты следует относить именно к приему препарата Кальцемин Адванс.
Для оценки влияния Кальцемина Адванс на биомеханические свойства кости измерялись такие параметры, как удельная стрела прогиба, предел прочности, модуль упругости, и вычислялась т. н. «работа разрушения» кости. На 30-й день значения удельной стрелы прогиба составили 3,20 ± 0,12 НмкМ (Кальцемин Адванс) и 2,86 ± 0,10 НмкМ в контрольной группе (р
В. И. Демидов*, кандидат медицинских наук
Н. Ю. Жидоморов*, кандидат медицинских наук
О. А. Громова* , 1 , доктор медицинских наук, профессор
И. Ю. Торшин**, кандидат химических наук
А. Ю. Волков**
В. Н. Носиков***, кандидат химических наук
* ГБОУ ВПО ИвГМА МЗ РФ, Иваново
** РСЦ Института микроэлементов ЮНЕСКО при РНИМУ им. Н. И. Пирогова, Москва
*** ВНИИ агрохимии им. Д. Н. Прянишникова РАСН, Москва
Регенерация костной ткани крысы
Несмотря на развитие травматологии и ортопедии, полное восстановление костной и хрящевой ткани является проблемным, поскольку большие дефекты не могут спонтанно заживать. Использование стволовых клеток — это регенеративная биология и регенеративная медицина, являющиеся все более расширяющимися областями исследования с надеждой на успех терапевтических методов лечения ран и травм, на которые невозможно эффективно воздействовать современными хирургическими методами [2, 4, 5].
Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мезенхимальные стволовые клетки), способные к дифференцировке в кость, хрящ, сухожилия и другие виды соединительной ткани, что позволяет широко применять такие клетки для ускорения регенерации костной ткани [2, 6, 7, 9].
Использование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) приводит к ускорению регенерации поврежденных костей, увеличению их плотности, по сравнению с результатами при естественном течении репаративных процессов [3, 10, 11, 15].
В связи с вышеизложенным, в эксперименте на крысах изучали процессы регенерации участка повреждения кости нижней челюсти крыс в различное время после введения суспензии аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения (АМСККМП) в культуральной среде.
Материал и методы исследования
В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag весом 180-200 г возрастом 6 месяцев. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На каждую точку исследования было использовано не менее 10 животных.
Модель дефекта костной ткани [1, 12] и применения АМСККМП в эксперименте:
Под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом скальпелем производили разрез кожи длиной 1,5-2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором делали круглое отверстие диаметром 2 мм в кости угла нижней челюсти, с полостью рта дефект кости не сообщался. Затем послойно ушивали рану викрилом.
Читайте также: Ткань асбестовая аст 1 гост 6102 94
Животные были разделены на 2 группы в зависимости от хода регенерации участка поврежденной кости нижней челюсти:
1-я группа — естественное течение репаративного процесса — 70 крыс;
2-я группа — репарация на фоне введения в искусственный дефект нижней челюсти 100 мкл суспензии АМСККМП в культуральной среде (1´106 клеток в 1 мл) — 70 животных.
АМСККМП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей у крыс-самцов линии Wag. Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 ч после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде α-МЕМ с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37 °С в СО2 — инкубаторе с 5 % СО2 в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 1000-5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), используя стандартные растворы Версена и трипсина.
Методами световой и флуоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания было показано, что культивируемые клетки костного мозга крысы:
— были CD90+, CD105+, CD34-, CD45-,
— in vitro прикреплялись к поверхности пластика культивирования,
— имели фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли все время культивирования,
— поддерживались в культуре в течение нескольких пересевов,
— формировали колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности,
— в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцировались в клетки костной ткани.
Для исследования использовали клетки 2-3 пассажей.
Однако физические, морфологические и фенотипические признаки также не являются специфическими критериями, которые могут быть использованы для специфической идентификации АМСККМП. Способность АМСККМП к индуцированной дифференцировке in vitro в кости, жир и хрящ является единственным критическим требованием для определения предполагаемых популяций стволовых клеток.
Индукция остеогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток in vitro: Поскольку АМСККМП свойственна дифференцировка в клетки костной ткани и условия ее проведения наиболее воспроизводимы, этот вид дифференцирования обычно используется для характеристики культур стволовых клеток in vitro и он является типичным заданным по умолчанию путем развития для большинства АМСККМП в культуре. Для индукции остеогенной дифференцировки использовали 0,1 µM дезоксиметазон, 50 µM аскорбиновую кислоту и 10 mM β-глицерофосфат («Sigma», США), вызывающие остеогенную дифференцировку.
Остеогенную дифференцировку определяли по 2 маркерам: по активности щелочной фосфатазы и минерализации межклеточного матрикса ионами кальция. Цитохимическое выявление щелочной фосфатазы проводили с использованием нитротетразолиевого синего в присутствии субстрата щелочной фосфатазы 5-бромо-4-хлоро-3-индолила. Накопление кальция в межклеточном матриксе регистрировали по окрашиванию Ализарином красным.
Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3, 4 и 5 недель после операции. Участок нижней челюсти с искусственно созданным дефектом фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов.
При оценке результатов методом рентгеновской денситометрии использовали фиксированные и препарированные фрагменты нижней челюсти крыс с удаленной кожей и подкожной клетчаткой. В компьютере радиовизиографа (Россия, 2004) установлена программа по исследованию плотности костной ткани, которая представлена в условных единицах: (отношение полученных данных плотности кости в участке повреждения к результатам исследования аналогичных неповрежденных участков на контрлатеральной стороне). Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel (Microsoft, USA), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия между средними считали достоверными при p
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом