Роль каллусной ткани в интактном растении

Каллусные культуры растений: общая характеристика каллусных клеток, их свойства, особенности, генетика

Каллусная культура: ее определение, особенности и анатомическая структура. Консистенция каллусной ткани. Основные свойства и строение каллусных клеток. Кривая роста каллусных клеток, генетика и клеточный цикл. Гормононезависимые растительные ткани.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Каллусные культуры растений: общая характеристика каллусных клеток, их свойства, особенности, генетика

Калусная культура — это неорганизованная профилирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся таким образом дифференцированными. Каллус, может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поражении. Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты.

Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции — рыхлой, средней плотности, плотной.

Основным условием превращения растений клетки в каллусную является присутствие в питательной среде фитогормонов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, приготавливающие её к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток.

Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деление клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делении. Каждая клетка имеет три фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) дифференцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того, чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки как в меристематическое состояние. Размножение дифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной ткани в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки.

Процесс перехода к каллусному росту в базальной части апекса начинается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается 24-48 часа, в течении которых клетки увеличиваются в размерах и ткань разрыхляется. После лаг-фазы клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань. Таким образом, если дедифференцировка специализированной клетки связана с индукцией деления под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристематической клетки связана с остановкой деления, деспециализицией клетки и только после этого — с индукцией деления, приводящей к каллусообразованию.

Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов. Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают белки, характерное для фотосинтезирующих клеток листа.

В клетках каллусной ткани происходит биохимические и цитологические изменения. Через 6-12 ч. после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, число элементов аппарата Гольджи, а также размеры и число ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу деления, которые начинаются через 48-72 ч. Следует учитывать, что в клетках экспланта в начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызванные как дедифференцировкой, так и травматическими синтезами. Для разделения этих процессов лучше проводить прединкубацию экспланта на безгормональной среде 3-6 сутки. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки.

Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникающий на эксплантах, через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.

Кривая роста каллусных клеток имеет S-образную форму. Такой характер роста легко обнаружить у суспензионных культур каллусных клеток. каллусный культура растительный клетка

Особенности каллусных клеток

Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого-биохимические свойства нормальных клеток. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных метаболитов. Морозостойкость и способность к закаливанию присущи каллусным клеткам, полученным из морозостойких растений.

Общим у каллусных и пористых клеток является устойчивость к действию высоких температур, осмотически активных веществ, засолению.

Каллусные клетки обладают отдельными свойствами, отличающими их от нормальных. В них появляются специфические белки и уменьшается количество белков, характерных для фотосинтезирующих клеток листьев, или они совсем исчезают. Каллусные клетки отличаются большой генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью.

В результате выхода из-под контроля организма рост каллусных клеток происходит неорганизованно, асинхронно, и является неограниченным. При пересадках на свежую питательную среду культура каллусной ткани моркови, полученная Р. Готре более 60 лет назад, до сих пор растет в коллекции.

Клеточный цикл у каллусных клеток более длителен, чем у растений, произрастающих в открытом грунте.

Особенностью каллусных клеток является гетерогенность по возрасту: одновременно присутствуют в каллусной ткани клетки молодые и старые.

Значительные отличия наблюдаются в энергетическом обмене каллусных клеток. Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными. Это свидетельствует о сдвиге соотношения между дыханием и брожением в сторону усиления брожения, т.е. о снижении эффекта Пастера. Под эффектом Пастера понимают подавление брожения дыханием в присутствии кислорода.

Генетика каллусных клеток

Клетки каллусной ткани обладают выраженной генетической гетерогенностью. Генетическая неоднородность каллусных клеток выражается прежде всего в различной плотности, т.е. каллусные клетки отличаются по числу хромосом. Генетически стабильными in vitro являются меристематические ткани.

В каллусных и суспензионных культурах встречаются клетки, имеющие диплоидный набор хромосом, свойственный исходному растению, полиплоидные клетки, содержащие 3,4,5 и более хромосомных наборов. Наряду с полиплоидией в культуре каллусных тканей можно нередко наблюдать анеуплоидию (возрастание или уменьшение хромосомного набора на несколько хромосом). Чем длительнее культивируют каллусные клетки, тем больше они различаются по плоидности. В калусных клетках табака через четыре года культивирования совсем не остается диплоидных клеток: все клетки становятся полиплоидными или анеуплоидными.

Кроме изменения плоидности, культивирование клеток и тканей растений in vitro вызывает появление в клетках хромосомных аббераций. Последние сказываются на биологических особенностях культивируемых тканей, изменяя их внешний вид, обмен веществ, скорость роста.

Генетическое разнообразие каллусных клеток позволяет использовать их для клеточных селекций на устойчивость к неблагоприятным факторам среды, фитопатогенам и на повышенную продуктивность.

Гормононезависимые растительные ткани

Каллусные клетки могут делиться только при наличии гормонов в питательной среде. Однако, при длительном культивировании они в ряде случаев могут приобрести способность расти на среде без гормонов, т.е. становятся автономными по отношению к ауксинам и цитокининам. Такие клетки называются «привыкшими». Нередко ткани, образованные «привыкшими» клетками, называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь тератомы.

У всех каллусных тканей, у некоторых культур уже начиная с 4 пассажа, заметно снижается, а затем и полностью утрачивается способность к регенерации. Из старых пересадочных культур получить растения — регенеранты не удается.

Кроме «привыкших» тканей представляющих собой химические опухоли, существуют опухоли растительного происхождения, вызывающие бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Это коростые галлы — опухоли, индуцированные у двудольных растений агробактериями Agrobacterium tumefaciens, бородатый корень, заболевание вызываемое A.rhizogenes и др.

В «привыкших» тканях, также, как и опухолях, идет интенсивный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательные среды.

У «привыкших» тканей гормононезависимость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, следовательно, отвечающих за синтез гормонов. В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.

Подобные документы

Характеристика каллусных клеток. Этапы микроклонального размножения. Классификация методов микроклонального размножения. Успехи микроклонального размножения хризантемы. Стерилизация посадочного материала. Каллусогенез на эксплантах различной локализации.

дипломная работа [606,8 K], добавлен 08.04.2015

Особенности роста и развития растений. Культура и морфогенетические особенности каллусных тканей. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Применение культур растительной ткани. Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений.

реферат [7,0 M], добавлен 22.09.2009

Флаваны в высших растениях: структура, основные представители, локализация, функциональная роль. Морфофизиологические и биохимические характеристики клеточных и каллусных культур чайных растений. Определение содержания флаванов и проантоцианидинов.

Читайте также: Целое основная ткань механическая ткань часть губчатая

дипломная работа [2,4 M], добавлен 02.02.2018

Основные разновидности живых клеток и особенности их строения. Общий план строения эукариотических и прокариотических клеток. Особенности строения растительной и грибной клеток. Сравнительная таблица строения клеток растений, животных, грибов и бактерий.

реферат [5,5 M], добавлен 01.12.2016

Составляющие растительной клетки. Плазматическая мембрана, ее функции. Компоненты клеточной стенки. Типы митоза эукариот. Образовательные ткани в теле растений и их расположение. Механические свойства растительных клеток. Наружные выделительные ткани.

учебное пособие [76,4 K], добавлен 12.12.2009

Каллусные клетки и ткани. Каллусогенез. Дифференцировка тканей

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАК ОСНОВА КАЛЛУСОГЕНЕЗА

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань об­разуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах — фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникно­вение каллуса связано с неорганизованным делением (пролифе­рацией) дедифференцированных клеток. Дедифференцировка — основа создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка — это возвращение клеток в меристематическое состояние, при кото­ром они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вслед­ствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механическом повреждении. Обязательное условие дедифференцировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, — присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют 2,4-D (2,4-дихлорфенок-сиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (а-нафтилуксусную кислоту), причем наибольшую активность проявляет 2,4-D. Из цитокининов в искусственные питательные среды обычно вносят кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Наиболее активны 6-БАП и зеатин. Функции этих двух групп гормонов в каллусогенезе разные, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Последние исследования свидетельствуют, что аук­сины индуцируют синтез главной протеинкиназы клеточного де­ления Рз4 сас2 , а цитокинины — циклинов. Таким образом, дей­ствие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду. Кроме того, оно будет зависеть от физиологического состояния клеток экспланта, от их компетентности к действию тех или иных внешних факторов. Ре­зультаты исследований показали, что полисахариды и какие-то неизвестные индукторы тоже могут вызывать деление клеток, при­водящее к образованию каллуса.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. В первую очередь они теряют запасные вещества — крахмал, бел­ки, липиды. В них разрушаются специализированные клеточные органеллы, в частности хлоропласта, но возрастает число амилопластов. Кроме того, разрушается аппарат Гольджи, перестраи­ваются эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in vitro начинается новый синтез белка. Он связан, вероятно, с механическим повреждением и действием гормонов, сохранив­шихся в экспланте с момента его изоляции из растения. Когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается. Если в это время клетки будут культивироваться на питательной среде, содержащей ауксины и цитокинины, то начнется каллусогенез, т.е. в результате дедифференцировки и деления клеток будет

образовываться первичный каллус. Таким образом, специализи­рованная клетка растительной ткани становится каллусной в ре­зультате дедифференцировки, т.е. восстановления у нее способ­ности к делению.

ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

В зависимости от способа, условий культивирования и проис­хождения можно выделить несколько типов культур клеток и тка­ней. Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определят, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плот­ной. Рыхлая каллусная ткань имеет сильно оводненные клетки, легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и по­этому может быть использована для получения суспензионной культуры. Ткань средней плотности характеризуется хорошо выра­женными меристематическими очагами. В ней легко инициируют­ся процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов:

Существует также суспензионная культура клеток, которую вы­ращивают в жидкой питательной среде, так называемое глубин­ное культивирование. Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для полу­чения суспензионных культур предпочтительнее брать каллусы рых­лого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са 2+ . С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2,4-D или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добав­лении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно полу­чить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном авто­матическом перемешивании. Дедифференцированные клетки от­рываются от экспланта, образуя суспензию в питательной среде. Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирова­ния клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в при­сутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следо­вательно, можно сказать, что суспензионные культуры представ­лены разными агрегатами каллусных клеток.

Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехноло­гии. Они могут быть использованы для получения изолированных протопластов, которые применяют для клеточной селекции, при введении чужеродных ДНК и других процессах. Клеточные суспен­зии культивируют в больших количествах для получения вторич­ных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разоб­щены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить макси­мальный выход продукта. Состояние клеточных суспензий характе­ризуется плотностью клеточной популяции. За 14 —16 дней (сред­няя длительность пассажа) плотность обычно повышается от 5-10 4 до 5-10 6 кл/мл. Качество суспензии определяется степенью агрегированности. Агрегаты должны содержать не более 10 — 12 клеток.

Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Например, вопрос о причинах генетической неод­нородности легче решать, используя клон-потомство одной клет­ки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта.

Однако культивирование одной или нескольких клеток связа­но с определенными трудностями, состоящими в том, что оди­ночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые раз­работаны для нормального роста и размножения клеток каллусной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток по­требовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего факто­ра» — метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или не­большое их количество, они не делятся, так как выделяемого кон­диционирующего фактора не хватает для индукции деления. Сле­довательно, необходимо повысить концентрацию фактора в пи­тательной среде. Этой цели служат следующие методы:

1. Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выде­ляется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки» (рис. 7.1).
2. Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор вы­деляют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. 7.2).
3. Кондиционирование среды — осуществляется путем добав­ления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.
4. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме («20 мкл) богатой пита­тельной среды (Ю.Ю.Глеба).

Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно. Согласно исследованиям А.И.Павло­вой и Р. Г. Бутенко (1969), этот фактор водорастворим, термоста­билен, не заменяется фитогормонами, включает низкомолекуляр­ные вещества. Химическая природа кондиционирующего фактора доказывается с помощью довольно простого эксперимента. Если разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной плас­тиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин по­местить целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление оди­ночных клеток (рис. 7.3).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК

Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание. Дифференцировку каллусных клеток принято называть вторичной. Однако ее не следует путать с вто­ричной дифференцировкой, на которой основан морфогенез. Рост каллусных тканей подчиняется общим закономерностям. Кривая роста каллусных тканей также имеет характер 5-образной кривой (ростовая кривая Сакса) и включает пять фаз, длительность кото­рых неодинакова у разных видов растений (рис. 7.4).

Первая фаза — латентная, или лаг-фаза, заключается в подготов­ке клеток к делениям. Вторая — фаза экспоненциального роста (лога­рифмическая). В это время митотическая активность наибольшая, рост идет с ускорением, масса каллуса увеличивается. Третья фаза — линейная, характеризу­ется постоянной скоростью ро­ста каллусной массы. Четвертая — фаза замедленного роста, во вре­мя которой интенсивность деле­ния клеток резко снижается. Во время пятой фазы — стационар­ной — масса каллуса не увели­чивается, так как начавшееся от­мирание клеток еще компенси­руется за счет их деления. Далее следует отмирание каллуса.

Читайте также: Мат гимнастический пвх ткань

Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют мно­гие физиологические особенно­сти, свойственные клеткам рас­тения, из которого они были по­лучены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозостойкость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоление, фотопериодическая реакция), а главное, хотя и в разной степени, способность к синтезу вторичных метаболитов. Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, характерные только для них особенности. Например, длительно куль­тивируемые in vitro клетки высших растений, как каллусные, так и суспензионные, образуют специфическую популяцию, относящую­ся к типу неполовых, — популяцию соматических клеток. Наиболее характерные свойства этой популяции — физиологическая асинхронность и генетическая гетерогенность.

Физиологическая асинхронностъ — наиболее важное свойство не­половой популяции. Оно заключается в том, что в каждый дан­ный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее фи­зиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток.

Причины возникающей асинхронности весьма разнообразны:

1. Особенности вида, сорта, генотипа индивидуального расте­ния, а также особенности экспланта.
2. Стрессы культивирования, например неоптимальная для дан­ного вида клеток среда.
3. Изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в течение выращивания.
4. Генетическая гетерогенность клеток и клонов.
5. Аномалия митотического цикла клеток in vitro.
6. Физические факторы (температура, свет, аэрация).

Асинхронность — устойчивое свойство популяции каллусных клеток. Если с помощью специфических воздействий синхрони­зировать пролиферацию клеток популяции, то уже через 3—4 де­ления она вновь становится асинхронной.

Генетическая гетерогенность — свойство клеток соматической популяции (нестабильность генома и их генетическая гетероген­ность). Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при куль­тивировании могут возникать полиплоидия, анеуплоидия, хро­мосомные аберрации, генные мутации. Однако генетическую ге­терогенность нельзя рассматривать как недостаток, так как она является необходимым условием существования популяции кле­ток и служит основой для их адаптации.

В качестве причин появления генетической гетерогенности можно назвать следующие:

1. Генетическая гетерогенность исходного материала. В растени­ях клетки характеризуются различной плоидностью, диплоидны только активно делящиеся меристематические клетки.
2. Нарушение коррелятивных связей при выделении первично­го экспланта из растения.
3. Действие компонентов среды. Экзогенные гормоны и стиму­ляторы могут оказывать мутагенное действие. Ауксины, особенно
   2,4-D, входящие в состав питательных сред, — мутагены; цитокинины способствуют полиплоидизации клеток.
4. Длительное субкультивирование, при котором накапливают­ся генетически измененные каллусные клетки.

После 5 — 6 пересадок новый кариотип клеточной популяции, как правило, стабилизируется, если условия культивирования остаются постоянными. В противном случае изменение физичес­ких или трофических факторов приведет к новым генетическим изменениям.

Генетическая нестабильность каллусных клеток имеет большое значение для селекционной работы, так как позволяет отбирать штаммы клеток с измененным генотипом. Эти клетки могут обла­дать уникальными свойствами: повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам, повышенной продуктивностью и т.д. Однако генетическая гетерогенность популяций каллусных кле­ток в культуре не влияет на сохранение в их геноме основных качеств вида и растения-донора.

Гормоннезависимостъ. Хотя гормоны и вызывают мутации, кал­лусные ткани от большинства растений образуются только в при­сутствии в питательной среде и ауксинов, и цитокининов. Ис­ключение составляют, например, незрелые зародыши пшеницы и семядоли подсолнечника. Первые образуют каллусную ткань на питательной среде с 2,4-D, но без цитокининов. Вторые, на­против, — на среде, содержащей цитокинины, но без ауксинов.

Вероятно, такая специфика связана с эндогенным содержанием фитогормонов и с компетентностью клеток. Однако при длитель­ном культивировании практически у всех тканей может возникать специфическое свойство гормоннезависимости, т.е. автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на опухолевые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Внешне же та­кие гормоннезависимые ткани ничем не отличаются от каллусных. Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свой­ство автономности от присутствия в среде гормонов, называются «привыкшими». Ткани, образованные такими «привыкшими» клет­ками, называют «химическими опухолями» в отличие от расти­тельных или генетических опухолей. Генетические опухоли возника­ют на межвидовых гибридах растений. Растительные опухоли име­ют бактериальное или вирусное происхождение. Чаще всего расти­тельные опухоли возникают при попадании в растения агробактерий. Так, Agrobacterium tumefaciens вызывает образование коронча­тых галлов, A. rhizodenes — бородатого корня, A. rubi — стеблевого галла. Превращение растительных клеток в опухолевые связано с проникновением в них ДНК бактериальной клетки, так называе­мой Ti-плазмиды, которая значительно изменяет свойства клет­ки, в том числе экспрессирует гены, контролирующие синтез аук­синов и цитокининов. Гормоннезависимость «привыкших» клеток связана с изменением активности собственных генов, ответствен­ных за синтез белков-ферментов, участвующих в синтезе гормо­нов. Таким образом, «привыкшим» тканям и растительным опу­холям в равной степени свойственна гормоннезависимость, но у растительных опухолей она носит генетический характер. У «при­выкших» клеток это свойство достигается главным образом за счет эпигеномных изменений. Существует еще одна особенность, по­зволяющая отличить «привыкшие» и опухолевые клетки от обыч­ных каллусных. Обычно ни опухолевые, ни «привыкшие» ткани не способны к нормальной регенерации. Они могут образовывать уродливые органоподобные структуры, так называемые тератомы. В отдельных случаях у длительно культивируемых тканей удается отодвинуть порог «привыкания» благодаря изменению состава питательных сред и добиться регенерации нормального растения.

МОРФОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНЫХ ТКАНЯХ КАК ПРОЯВЛЕНИЕ ТОТИПОТЕНТНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Дифференцировка каллусных тканей. Одна из наиболее инте­ресных, но сложных проблем в биологии — развитие многокле­точных организмов. Изучение данного вопроса возможно несколькими путями. Так, большое распространение получило моделиро­вание процессов онтогенеза на более простых системах. При этом используют изолированные ткани, клетки, протопласты, культи­вируемые в стерильных условиях. Преимущество этого процесса состоит в том, что нет необходимости постоянно учитывать ре­зультаты взаимодействия органов в целостной системе раститель­ного организма. Кроме того, экспериментатор сам имеет возмож­ность выбирать, изменять и повторять условия опыта в соответ­ствии с поставленной задачей. После завершения дедифференцировки дальнейшее развитие каллусной клетки может идти в не­скольких направлениях. Во-первых, это вторичная дифференци­ровка разной степени сложности. Во-вторых, в клетке может сфор­мироваться состояние стойкой дедифференцировки («привыка­ние»), а следовательно, способность расти на безгормональной среде. В-третьих, каллусная клетка проходит свой цикл развития, завершающийся ее старением и отмиранием.

Наибольший интерес вызывает первый путь, фактически пред­ставляющий морфогенные процессы. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных струк­тур из неорганизованной массы клеток.

Вторичная дифференцировка каллусной клетки может завер­шиться образованием в каллусной ткани отдельных дифференци­рованных клеток. Они имеют определенное строение и выполняют специфические функции. Примером служит образование эпибластов — клеток, в которых запасаются вторичные метаболиты. Это наиболее простой тип дифференцировки каллусной клетки. Более сложная гистологическая дифференцировка завершается образо­ванием в каллусе различных тканей: млечников, волокон, три­хом, элементов ксилемы (трахеи и трахеиды) и флоэмы (сито­видные трубки и клетки-спутницы). К самым сложным видам вто­ричной дифференцировки относятся органогенез — образование органов и соматический эмбриогенез — образование из сомати­ческих клеток эмбриоидов, биполярных зародышеподобных струк­тур. Все эти типы дифференцировки возможны только благодаря тотипотентности: любая растительная клетка содержит полный набор генов, характерный для того организма, из которого она была выделена. Потенциальные возможности всех клеток этого рас­тения одинаковы; каждая из них в определенных условиях может дать начало целому организму. Однако выяснено, что реально де­терминируется только одна из 400—1000 клеток, что, вероятно, связано с физиологическим состоянием клетки, с ее компетент­ностью. Так, у эксплантов стеблевого происхождения компетент­ны к действию экзогенных фитогормонов и, следовательно, спо­собны к морфогенезу только клетки эпидермальных и субэпидермальных тканей (Тран Тан Ван, 1981). Однако компетентность клеток может приобретаться ими в процессе культивирования каллусной ткани, в условиях, индуцирующих морфогенез. Время, в течение которого в каллусных клетках возникает это свойство, изменяется в широких пределах. Кроме того, существенную роль в дифференциации играют генотип растения-донора, условия и физические факторы культивирования.

Все каллусные клетки, готовые ко вторичной дифференцировке, т. е. детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки — «клетки-инициали»— образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от остальных каллусных клеток. Для них ха­рактерно более крупное ядро, большее количество запасных ве­ществ, меньшие размеры вакуолей. В «клетках-инициалях» начи­нается синтез определенных белков, интенсифицируется пентозофосфатный путь расщепления гексоз. Очень важно, что между этими клетками, формирующими меристематические очаги, восстанавливаются плазмодесмы, которые практически отсутству­ют в массе каллусных клеток.

Интересное предположение было высказано Л. Саксом и С. Тойвоненом (1963). Оно сводится к тому, что существует минималь­ная масса каллусных клеток, которая определяет способность уже детерминированных клеток к дальнейшему морфогенезу. Это под­твердилось в опытах с культурой семядолей ели: детерминация адвентивных побегов происходила в клеточных комплексах из 5 — 6 клеток (Б. С. Флинн и др., 1988). В исследованиях С.Номура и А. Комамине (1989) было показано, что развитие соматических зародышей детерминируется в 6— 10-клеточном агрегате.

Читайте также: Что такое нисходящий поток по каким проводящим тканям он осуществляется

Гистогенез. Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном ауксины. Опыты по влиянию апикальной меристемы побега (место синтеза ауксинов) на гистогенез в каллусной ткани показали, что ниже места прививки апекса в каллусной ткани начинали образовы­ваться сосудистые элементы. Тот же эффект наблюдался при на­несении на каллус ауксина с сахарозой. Интересно, что повыше­ние концентрации сахарозы способствовало образованию элемен­тов флоэмы, а понижение — образованию ксилемных элементов. Причем такое действие оказывала совместно с ауксином только сахароза, что позволяет говорить о ее регуляторной роли. Добав­ление к гормону других Сахаров гистогенеза не вызывало. В неко­торых случаях стимуляторами гистогенеза помимо ауксинов могут быть и остальные фитогормоны. Так, было отмечено, что в кал­лусных тканях сои этот процесс начинается под действием гиббе-релловой кислоты и этилена.

Органогенез. Первые работы Ф.Скуга и С.Миллера по влия­нию ауксинов и открытого ими кинетина на органогенез в каллу­сах растений показали прямую зависимость этого процесса от со­отношения фитогормонов. Преобладание концентрации ауксина над цитокинином вызывает дифференцировку клеток, приводящую к образованию корневой системы. В этом случае регенерации целого растения не происходит. При увеличении концентрации цитокинина и уменьшении ауксина начинаются стеблевой орга­ногенез и образование побега. Если его пересадить на свежую пи­тательную среду с преобладанием ауксина, то наблюдается обра­зование корней и регенерация целого растения. В настоящее время доказано, что для прохождения органогенеза очень большое зна­чение имеют принадлежность растения-донора к классу двудоль­ных или однодольных, его генотип, а также тип экспланта. Кроме того, морфогенез можно получить только при условии подбора оптимальной питательной среды, определенных физических фак­торов, балансе фитогормонов, присутствии сигнальных белков и белков-акцепторов в клетках.

Среди компонентов, входящих в состав питательных сред, важ­ную роль играют ионы NH₄ + и NO₃

. Присутствие аммонийного азота важно для начала морфогенеза, а добавление нитратного азота способствует росту и развитию образовавшихся структур. Фитогормоны, используемые для стимуляции органогенеза, не ограничиваются теперь только ауксинами и цитокининами. С этой целью в питательную среду вводят другие классы фитогормонов: абсцизины, гиббереллины, этилен.

Влияние типа экспланта на морфогенез было четко показано в работах Н. П. Аксеновой, Т. В. Бавриной, Т. Н. Константиновой. Они установили, что только экспланты, выделенные из верхних меж­доузлий, могут образовывать каллус, способный к флоральному морфогенезу. Каллусы, полученные на эксплантах из нижних меж­доузлий, давали начало только вегетативным органам.

Вопрос о механизме запуска вторичной дифференцировки у каллусных клеток остается открытым. В настоящее время самое раннее событие, связанное с морфогенезом, — это появление тканеспецифичных белков. Установлено, что все морфогенетические измене­ния активируются и (или) контролируются специальными генами.

Соматический эмбриогенез. При соматическом эмбриогенезе клетка-инициаль дает начало зиготе. Регенерант, образующийся из соматического зародыша, полностью сформирован, что устраня­ет лишние затраты по укоренению полученных при органогенезе побегов. Кроме того, соматические эмбриоиды точнее воспроизво­дят генотип исходного растения по сравнению с растениями-регенерантами, полученными в результате органогенеза. Соматические зародыши представляют и чисто практический интерес, так как могут быть использованы для получения искусственных семян.

Соматический эмбриогенез очень важен для фундаментальных наук. Он позволяет изучать механизмы эмбриогенеза, так как по­чти все его фазы, за исключением первой, в растении и в культу­ре тканей совпадают. Наиболее ранняя из изученных фаз детерми­нации клетки по эмбриональному пути развития состоит в приобретении ею свойств полярности. Так, при определении плотно­сти биоэлектрического потенциала для четырех морфогенных кле­ток оказалось, что максимальная плотность электрического тока была на полярных полюсах этой группы клеток. Переход клеток в следующую фазу эмбриогенеза сопровождался значительным по­вышением плотности тока. Предполагается, что морфогенные клет­ки могут поддерживать полярность за счет активного базипетального транспорта эндогенного ауксина, градиента биоэлектричес­ких потенциалов, градиента ионов кальция.

В связи с этим особый интерес представляют работы Ю. Б.Дол­гих (1994), в которых было установлено, что слабый постоянный электрический ток (2 мкА) может быть индуктором эмбриогенеза. Соматический эмбриогенез фактически не зависит от экзогенных фитогормонов, только развитие сформировавшихся соматических зародышей начинается в отсутствие ауксинов в среде. Однако со­держание эндогенных фитогормонов имеет решающее значение для индукции эмбриогенеза.

На регуляцию морфогенеза существенно влияет качество света. Показано (Л. Коппель, 1992), что морфогенный каллус образует­ся чаще на синем свету, чем на белом или красном. Изменения на уровне индивидуальных белков во время реализации морфогенетической программы в культуре тканей позволили говорить о су­ществовании белков развития. Однако отсутствие специфических тестов на эти белки не позволяет их выявить. Вместе с тем при использовании гибридов, продуцирующих моноклональные антитела на мембранные белки соматических зародышей, удалось выявить полипептид с молекулярной массой 45 кДа, который встречается в ядре нескольких видов растений и возможно уча­ствует в регуляции клеточного деления (Г.Смит и др., 1988). В настоящее время большое внимание уделяется генетическому ас­пекту морфогенеза, изучению соматического эмбриогенеза как генетически наследуемого признака. Роль основного двигателя процесса развития отводится дифференциальной активности ге­нов. Предполагается, что гены, контролирующие соматический эмбриогенез, начинают экспрессироваться в критические перио­ды развития эмбриоидов (Н.А.Моисеева, 1991).

ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПРОТОПЛАСТЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен Д. Ханстейном в 1880 г. Протопласт в целой клетке можно наблю­дать во время плазмолиза. Изолированный протопласт — это содер­жимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлю­лозная стенка у данного образования отсутствует. Изолированные протопласты — одни из наиболее ценных объектов в биотехноло­гии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преиму­щество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточ­но легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток жи­вотных. Е. Коккинг установил, что изолированный протопласт бла­годаря механизму пиноцитоза способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные моле­кулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы.

Большое значение в создании новых форм растений для изуче­ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гиб­ридные клетки. Таким способом можно добиться получения гиб­ридов от растений с разной степенью таксономической удален­ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза Источник

• Свежие записи
  • Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
  • Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
  • Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
  • Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
  • Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом