Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.
Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.
Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.
Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).
После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).
По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.
Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.
Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.
Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.
Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).
Срез ткани для анализа
Если на экспертизу поступает фиксированный материал, то приготовление препарата производят так же, как для обычного гистологического исследования. Вырезанные из разных участков кусочки толщиной не более 0,5 см после соответствующей обработки заливают в парафин и на микрогоме готовят срезы толщиной 2—3 мкм. Срезы до окраски необходимо депарафинировать и обработать раствором трипсина.
Читайте также: Для чего нужна ткань дублерин
Парафин удаляют, помещая предметные стекла с наклеенными на них срезами в ксилол. Затем проводят препараты через батарею спиртов понижающейся концентрации (96%, 70%, 50%) п дистиллированную воду.
Раствор трипсина удаляет некоторое количество белков и уменьшает окрашивание межклеточного вещества и цитоплазмы клеток флюорохромом. Используют 0,25% раствор трипсина, препараты выдерживают в нем 30 мин, а затем на 2—4 с помещают в 2% раствор уксусной кислоты.
Препараты, приготовленные тем или иным способом, фиксируют метиловым спиртом (кроме гистологических срезов), окрашивают азур-эозином и флюорохромом так же, как препараты с эпителиальными клетками волос и слизистой оболочки рта.
С целью диагностики половой принадлежности тканей их исследуют сначала на Y-хроматин, окрасив флюорохромом. Что же касается частиц неизвестных тканей, то сначала необходимо решить вопрос об их органно-тканевом происхождении. Поэтому препараты окрашивают азур-эозином и после разрешения этого вопроса анализируют ядра на наличие Х-хроматина.
Целесообразно один из препаратов не окрашивать азурэозином, оставляя его для анализа на Y-хроматин. Если из частицы удалось приготовить только один препарат и он окрашен азур-эозином, то для исследования Y-хроматнна необходимо тщательно отмыть красители. Для этого препарат помещают в 10—25% раствор уксусной кислоты до удаления азура и промывают проточной водой; эозин удаляют, помещая препарат в 5— 10% раствор аммиака.
После второй промывки в проточной воде препарат можно окрасить флюорохромом.
Определение тканевой принадлежности частиц. Ориентировочное определение типа ткани возможно уже в процессе приготовления препаратов, так как под стереомикроскопом видны некоторые морфологические признаки ткани или органа. Так, твердость частицы, сохраняющаяся при помещении ее в уксусную кислоту, может свидетельствовать о том, что это кость или хрящ. Чрезвычайная мягкость частицы, которую можно измельчать сколько угодно и в любом направлении, позволяет предположить, что это мозговая ткань.
Наличие волос всегда служит признаком того, что объект является частицей кожи.
После обработки уксусной кислотой выявляют собственный цвет частиц тканей: они становятся бесцветными, матовыми, желтоватыми, буроватыми. Эти окраски являются постоянными признаками, которые можно использовать для дифференцирования типов и некоторых основных видов тканей. С этой же целью необходимо использовать и другие признаки, выявляемые при стереомикроскопии частиц во время их препаровки.
Исследование неокрашенных препаратов может дать дополнительную информацию о типе (виде) ткани исследуемой частицы и о состоянии клеток. По ним можно решить вопрос о необходимости приготовления препаратов из оставшейся части объекта.
В окрашенных препаратах анализируют морфологические признаки ткани, клеток и иеклеточных структур. Эти признаки, характерные для основных типов и некоторых видов тканей, приведены в табл. 4. В ней указаны диагностические признаки, полученные при исследовании объектов, из которых готовили давленые препараты. Как видно из этой таблицы, указанные признаки позволяют достаточно четко дифференцировать ткани, причем большинство этих признаков может сохраняться в тканях, подвергшихся аутолитическим изменениям.
Приготовление гистологических срезов
Изучение патологических процессов на клеточном и тканевом уровне производится при помощи микроскопических исследований. Гистологический метод исследования необходим для изучения строения и функции клеток в состоянии нормы, патологии и экспериментальном периоде. Для гистологического исследования берутся элементы тканей и органов. Толщина исследуемого образца не может превышать 1 см 3 .
Образцы тканей могут браться у человека сразу после смерти (чем быстрее, тем лучше) – аутопсия. Также материал может браться во время операции или непосредственно в диагностических целях при помощи специальных инструментов – биопсия.
Приготовление образцов
Приготовление образцов происходит в несколько этапов:
- Фиксация материала.
- Приготовление среза.
- Процесс окрашивания среза.
Читайте также: Скелетная мышечная ткань языка кролика препарат
Суть фиксации материала заключается в остановке естественных процессов в тканях и клетках. Это необходимо для того, чтобы во время купировать процесс гниения и ферментативные изменения в структуре тканей.
В фиксируемых тканях за счет физико-химических процессов происходит свертывание (коагуляция) белков и липоидной составляющей. Это состояние позволяет тканям долго храниться в неизменном виде, без реакции на различные воздействия. Проще говоря, фиксация тканей проводится с целью сохранения прижизненной структуры биологического материала.
Для фиксации тканей применяются специальные жидкости (фиксаторы). Наиболее популярными фиксаторами можно назвать следующие варианты жидкостей:
- Формальдегид.
- Спирт (96, 100%).
- Осмиевая кислота.
Выше перечислены простые фиксаторы. Также для фиксации тканей применяются более сложные варианты фиксаторов (растворы):
- Спирт-формол.
- Жидкость Ценкера.
- Двухромовоокислый калий.
В списках указаны лишь некоторые виды применяемых фиксаторов. Продолжительность необходимого для фиксации образцов тканей периода может варьироваться от нескольких часов до суток. Длительность зависит от особенностей исследуемых образцов и типа выбранного фиксатора. После того как этап фиксации пройден необходимо произвести промывку материала (в течение нескольких часов) в проточной воде. Это делается для того чтобы освободить образцы от излишков фиксирующей жидкости и осадочной взвеси.
Мутные непрозрачные образцы не подходят для исследования. Такие кусочки материала не позволят получить необходимую информацию. Перед тем как приступить к одному из главных этапов – осуществлению среза, образцы промываются чистой водой в течение нескольких часов. Далее, материал подвергается процессу обезвоживания. Обезвоживание осуществляется при помощи проведения тканевого образца через спирты возрастающей крепости. Этот этап длительный. В каждом спирте кусочки материала находятся от 2-3 часов до суток.
После обезвоживания проводится заливка образцов. Этот этап необходим для уплотнения тканей и получения качественных блоков для исследования. Уплотнение проводится путем замораживания (срочная биопсия) или путем заливки парафином или целлоидином. Заливка парафином — достаточно длительная процедура (от 24 часов и дольше). Такой вариант уплотнения образцов используется для осуществления исследования в обычном режиме. Для лучшей визуализации отдельных структур тканей срезы окрашивают. Для окрашивания применяют специальные гистологические красители (кислые, основные, специальные).
Подготовленные к изучению образцы исследуют при помощи специального микроскопа.
Прежде чем приступить к изучению гистологического препарата необходимо убедиться, что последний полностью соответствует ряду обязательных требований:
- В материале должны быть сохранены прижизненные структуры.
- Срез должен быть тонким и прозрачным.
- Структуры, которые требуется подвергнуть изучению должны быть четко визуализированы за счет окрашивания.
- Препараты должны иметь длительный срок хранения.
При качественном приготовлении препарата достичь соответствия всем перечисленным требованиям достаточно просто. Однако нельзя исключить возможность возникновения небольших погрешностей. Если вовремя распознать некоторые виды неточностей, купировать брак, создать качественный материал вполне возможно.
Самыми распространенными погрешностями при приготовлении срезов можно назвать следующие варианты:
- Крошение среза.
- Выпадение материала из парафиновой массы.
- Невозможность нарезки материала.
- Разрыв материала.
Те или иные погрешности могут возникать по разным причинам. Иногда в основе нарушения качества образца лежат ошибки во время изготовления. Для устранения каждой погрешности предусмотрены определенные алгоритмы действий.
Методы гистологического исследования
Для осуществления микроскопического исследования необходимы тонкие кусочки материала. Ширина таких кусочков измеряется в микрометрах. Для удобства получения таких срезов используются специальные приборы – микротомы. Конструкция этого прибора предусматривает возможность получения срезов толщиной 5-10 микрометров.
Основным методом исследования в гистологии является микроскопия. При помощи микротома можно изготавливать тончайшие срезы, подходящие для проведения микроскопических исследований. Получение среза происходит за счет движения ножа в одном направлении. Толщина среза задается на этапе срабатывания механизма подъема.
Читайте также: Шиншилла ест ткань что делать
Для изготовления срезов из материала, залитого парафином или целлоидином, используют радиальный, ротационный или санный микротом.
Для получения среза с растительных или животных тканей могут применяться специальные замораживающие микротомы. Для микроскопического исследования используется несколько методов приготовления срезов. Для каждого из методов выбираются определенные виды микротомов и применяются определенные четкие алгоритмы действий.
Гистологические срезы бывают:
Могут производиться срезы фиксированного и нефиксированного материала. Все зависит от характера исследуемых тканей и основных целей проведения означенного исследования. Также в гистологии существуют другие методы приготовления срезов.
Микротомы и их применение
Как уже было сказано выше, срезы в гистологии создаются при помощи специального устройства – микротома. В самом названии заложена расшифровка предназначения прибора – micros (маленький), tome (рассечение). Одним из самых используемых можно назвать санный микротом.
Название прибора произошло от принципа работы механизма, который базируется на подаче ножа с зажимом при помощи специальных салазок. Санный микротом предназначен для осуществления парафиновых срезов. Как правило, такой прибор работает с одноразовыми лезвиями или кассетами. Такой высокоточный микротом состоит из станины, механизма микроподачи, подъемного механизма, зажимов для блоков, ножедержателя.
Такой аппарат позволяет изготавливать срезы толщиной от 0,5 до 60 микрометров. Санный микротом отличается высокоточной регулировкой толщины среза. Функция подачи материала может быть механической или ручной. Данный прибор предназначен для осуществления рутинных исследований в области медицины, ботаники и биологии.
Ротационный микротом — прибор с неподвижным ножом и подвижным столиком. В приборе предусмотрена моторизованная подача образца. Этот микротом предназначен для использования в гистологической лаборатории для проведения исследований, направленных на решение гистологических и гистопатологических задач.
Для получения срезов с нефиксированных тканей или в тех случаях, когда необходимо срочное проведение исследования используются замораживающие микротомы. Такие приборы снабжены замораживающим столиком, на котором и закрепляется исследуемый образец. Главным правилом успешного получения гистологического среза при помощи микротома является правильный выбор угла наклона ножа и угла сечения. Наилучшим углом наклона является тот, при котором плоскость лезвия находится параллельно верхней части блока.
Если выбрать угол наклона больший, чем требуется, образуется риск, что срез будет крошиться. При меньшем угле наклона лезвие будет скользить по поверхности материала. Получение требуемого результата при таком положении ножа невозможно. Величина угла сечения зависит от характера исследуемого материала. Чем образец мягче, тем меньше будет угол резания. При обработке мягких блоков неплохим вариантом считается косое расположение ножа.
Резание на микротоме
Для приготовления срезов с парафинированных объектов или образцов, обработанных целлоидином, опять же чаще всего используют ротационный микротом.
Сначала блок подвергают обрезке. Это необходимо для устранения свободного парафина или другого уплотнителя. Если эту процедуру не произвести, срез может получиться неравномерным, морщинистым и, как следствие, малоинформативным. Также сморщивания можно избежать при помощи охлаждения исследуемого материала.
Далее, парафиновый блок прочно закрепляется в зажиме. Предварительно необходимо выверить правильный угол расположения ножа и выбрать необходимый угол резания. После этого нужно используя регулировку механизма подачи, установить блок так, чтобы его поверхность находилась от лезвия ножа на расстоянии 0,5-1 мм.
После осуществления подгонки проводится установка микрометрической шкалы для получения первых толстых срезов. После этого производится моделирование блока (срезка излишков парафина, предание прямоугольной формы). Заключительным этапом является выставление микрометрической шкалы на задуманную толщину и осуществление окончательной резки материала.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом