Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.
Сущность
Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.
В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).
История развития
Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.
В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.
К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.
Типы исследуемого материала
Различают 2 основных вида культур тканей растений:
- Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
- Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.
По способу выращивания выделяют следующие методы:
- на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
- с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
- применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
- выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.
Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.
Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.
Необходимые условия
Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:
- Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
- Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
- Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.
Читайте также: Как классифицируются виды тканей анатомия
В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).
Достоинства и недостатки
Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:
- хорошая воспроизводимость полученных результатов;
- регулирование межклеточных взаимодействий;
- небольшой расход реагентов;
- генетическая однородность клеточных линий;
- возможность механизации процесса выращивания;
- контроль над условиями содержания клеток;
- низкотемпературное хранение живых культур.
К недостатком данной биотехнологии относят:
- необходимость соблюдения строгих условий асептики;
- нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
- дороговизна химических реагентов;
- неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.
Применение
Метод культуры тканей используется для проведения исследований:
- процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
- межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
- взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
- результатов генетических манипуляций с клетками.
Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:
- получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
- направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
- клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
- выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
- криоконсервация генофонда;
- реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).
Методы культивирования вирусов
Вирусы не способны культивироваться на питательных средах, т.к. являются внутриклеточными паразитами.
1. Метод культивирования в организме чувствительных экспериментальных лабораторных животных.
Ограничения:
1) не все вирусы человека размножаются в организме лабораторных животных;
2) в организме экспериментальных животных есть иммунная система, которая может оказывать влияние на размножение вирусов.
2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.
Куриные эмбрионы имеют двухслойную экто- и энтодермальную хорион-аллантоисную оболочку; желточный мешок построен из мезодермальных клеток. Т.о., куриный эмбрион содержит ткани любого происхождения.
Куриный эмбрион не обладает иммунологической активностью.
Дешевле по сравнению с лабораторными животными. После заражения куриных эмбрионов они погибают вследствие размножения вирусов. На оболочках эмбриона могут образовыватся бляшки – мелкие зернистые образования. Вирус накапливается в жидкости куриного эмбриона.
Но: в куриных эмбрионах размножаются не все вирусы человека.
3. Метод культивирования вирусов в культуре ткани:
– для культивирования вирусов вне организма; используют эмбриональные, опухолевые клетки, которые активно размножаются в питательных средах для культуры тканей.
Типы культур тканей:
1) перевиваемые тканевые культуры – культуры обычно опухолевых клеток. Они стандартные. Их нужно постоянно поддерживать, они одинаковы во всех лабораториях мира;
Читайте также: Что такое редкое место ткани
2) первично-трипсинизированные тканевые культуры — культуры эмбриональных тканей, которые готовятся каждый раз по мере надобности: эмбриональную ткань измельчают, затем подвергают обработке трипсином (чтобы разрушить межклеточные связи), центрифугируют отдельные клетки. Эти культуры ткани обладают хорошими ростовыми качествами, но они не стандартны.
Для поддерживания культур ткани служат специальные синтетические питательные среды.
Культивирование вирусов под агаровым покрытием (однослойные культуры тканей) дает возможность получить потомство отдельных вирионов.
Методы регистрации размножения вирусов
1. Организм животного:
— Изменения в организме животного (болезнь).
2. Куриный эмбрион:
3. Культура ткани:
При размножении вирусов проявляются изменения, которые не свойственны здоровым клеткам:
— ЦПЭ (цитопатический эффект);
— У культивируемых вирусов есть феномен гемадсорбции (в результате избыточного синтеза гемагглютинин экспрессируется на наружную поверхность клеток культуры ткани и они приобретают способность адсорбировать эритроциты);
— появление в клетках включений – морфологических структур, которые обнаруживаются только в зараженных вирусом клетках культуры ткани.
Виды включений:
2) По характеру окраски по Романовскому-Гимза:
Типы включений характерны для определенного вируса.
— Учет размножения вирусов в культуре ткани (метод цветной пробы – ориентировочный тест, который говорит о нарушении клеточного метаболизма):
— если культура ткани не заражена, в клетках протекают процессы метаболизма, продукты метаболизма обнаруживаются в питательной среде, рН изменяется в кислую сторону, изменяется цвет индикатора;
— если культура ткани заражена вирусом, нарушения клеточного метаболизма, продукты метаболизма не обнаруживаются в питательной среде, рН не меняется, индикатор не меняет цвет.
Культуры тканей по чувствительности к вирусам делятся на 3 группы:
1) пермессивные (поддерживает вирусную инфекцию);
2) непермессивные (не способны поддерживать вирусную инфекцию);
3) полупермессивные (вирус поддерживается, но не размножается; такие клетки передают вирусную инфекцию при контакте с другими клетками).
Особенности противовирусного иммунитета
На вирус развивается полноценный иммунный ответ.
Вирус существует в организме в двух формах. В отношении внеклеточного вируса действуют те же механизмы противомикробной резистентности, что и в отношении бактерий.
Неспецифические механизмы:
— клеточная ареактивность – отсутствие специфических рецепторов для вирусов на клетках организма;
— выделительные механизмы: чихание, кашель;
— барьерная функция кожи и слизистых оболочек;
Его особенности: при бактериальных инфекциях – лейкоцитоз, при вирусных – лейкопения. Т.к. нейтрофильные лейкоциты фагоцитируют вирус, он в них размножается и они гибнут. Защитное значение имеет фагоцитоз клеток, пораженных вирусом – на поверхности таких клеток экспрессируются вирусные белки, что делает их объектом макрофагального фагоцитоза, отсюда – моноцитоз, характерный для вирусных инфекций.
— гуморальный иммунитет: система комплемента, пропердина и вирусные ингибиторы – это химические группировки и радикалы, тождественные вирусным рецепторам, и они их блокируют.
Специфические механизмы иммунитета
Роль антител особая. Уровень сывороточных антител и устойчивость к вирусам не идут параллельно. При вирусной инфекции важно не количество антител, а их локализация в организме – на месте входных ворот или на территории пораженных тканей.
Большую роль при вирусной инфекции играет клеточный иммунитет. Это связано с тем, что инфицированные вирусом клетки становятся мишенью для цитолитического действия Т-киллеров.
Читайте также: Ткань схема для вышивания бисером
При заражении двумя разными вирусами одной ткани один подавляет другой. Это явление лежит в основе невосприимчивости к вирусным инфекциям. Это
Интерферон – индуцибельный белок клеток позвоночных, появляется под влиянием интерфероногенов. Один из них – вирусная инфекция. Основная функция интерферона: подавление размножения вирусов.
Виды (в зависимости от продуцирующей клетки):
Интерферон – важнейший фактор, обладающий многогранной биологической активностью: стимулирует фагоцитоз, киллерную функцию Т-лимфоцитов, подавляет синтез комплемента, снижает гемопоэз, снижает развитие реакций гиперчувствительности замедленного и немедленного типов.
Интерферон обладает активностью в отношении внутриклеточных вирусов. Он нарушает трансляцию иРНК на рибосомах, что ведет к прекращению синтеза вирусных белков.
Интерферон появляется в клетке уже через 2 часа после заражения вирусом. Защищает практически от всех видов вирусных агентов.
Особенности интерферона:
— подавляет репродукцию любых видов вирусов (т.е. не обладает специфичностью);
— Обладает видовой специфичностью (защищает только свой вид).
Универсальность интерферона делает его незаменимым в терапии вирусных инфекций.
Интерферон обеспечивает защиту на уровне нуклеиновой кислоты, т.е. поддерживает нуклеиновый гомеостаз, а антитела и Т-лимфоциты – белковый гомеостаз.
Индукторы синтеза эндогенного интерферона:
— естественные (бактерии, вирусы, ЛПС);
— синтетические (крупномолекулярные соединения: полифосфаты, поликарбонаты и т.п.)
Применение интерферона:
— средство антивирусной терапии.
Химиотерапия вирусных инфекций
С помощью химиотерапевтических препаратов воздействуют на различные этапы взаимодействия вируса с клеткой: тормозят адсорбцию вирусов на клетках.
Основные препараты:
– производные ремантадина строго специфичны (ремантадин – при вирусах гриппа А);
– производные марборана (онковирусы, вирус оспы и т.д.);
– структурные аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований (фтортимедин, фтордезоксиурацил, азидотимедин и т.п.);
Встраиваются в вирусную нуклеиновую кислоту → вирусы теряют инфекционность.
Специфическая профилактика вирусных инфекций
Вирусные вакцины: живые и убитые.
В настоящее время живые вакцины используется…, т.к. возможна реверсия аттенуированных штаммов.
Средство экстренной профилактики: иммунные сыворотки, интерферон.
Экстренная профилактика кори – коревой γ-глобулин. Чаще используются химические и генно-инженерные вакцины.
Принципы классификации вирусов
По типу нуклеиновой кислоты вирусы делятся на:
По размерам вириона на:
По типу симметрии нуклеокапсида на:
По наличию или отсутствию суперкапсидной оболочки.
По типу репликации нуклеиновой кислоты.
Главную роль в патологии человека играют РНКовые вирусы к ним относятся:
ДНКовые вирусы, патогенные для человека. Это:
— вирус папилломы, полиомы и бородавок;
— Аденовирусы (постоянные обитатели глоточного кольца), могут вызывать ОРВИ, ОРЗ;
— сем. Поксвирусов, включающее вирус натуральной оспы.
Происхождение вирусов
Происхождение вирусов – вопрос, который на протяжении многих лет составлял предмет дискуссий.
Было выдвинуто три гипотезы:
1. Вирусы – потомки бактерий и других одноклеточных организмов, претерпевших дегенеративную (регрессивную) эволюцию.
2. Вирусы – потомки древних доклеточных форм жизни, перешедших к паразитическому способу существования.
3. Вирусы – дериваты (производные) клеточных генетических структур, ставших относительно автономными, но сохранившими зависимость от клеток.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом
- Правообладателям
- Политика конфиденциальности
Мастерица © 2023
Информация, опубликованная на сайте, носит исключительно ознакомительный характер