Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.
Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.
Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.
Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).
После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).
По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.
Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.
Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.
Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.
Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).
Виды микроскопического исследования тканей
Микроскопия – это изучение объектов и элементов чрезвычайно малых размеров. Человеческий глаз имеет предел разрешения и детализации таких объектов, диктуемый его природными свойствами. Для преодоления этого биологического ограничения используются различные приборы-микроскопы. На сегодняшний день, одним из ведущих методов исследования микрообъектов в биологических науках является оптическая (она же световая) микроскопия. Световые микроскопы являются важнейшими инструментами как при проведение некоторых рутинных медицинских анализов, так и в биологических и медико-биологических научных исследованиях. Они незаменимы при изучении морфологических свойств микробиологических объектов, к которым относятся насекомые и их части, многие паразиты, клетки растений и животных, простейшие и бактерии. Возможность изучения топографии, морфологии, ультраструктуры позволило человеку значительно расширить свои знания о микроорганизмах. В медицине, микроскопы позволяют проводить подсчёт клеток крови, анализ биопсий на структуру, морфологию и наличие определённых включений. С применением молекулярно-биологических техник, появилась возможность выявить локализацию отдельных химических веществ.
Сущность оптических методов
Современная световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч раз, что является достаточным для изучения различных форм жизни на клеточном уровне и других биологических объектов [1, 2]. Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – минимальное расстояние, на котором находятся две точки, различаемые как раздельные объекты. Контраст –возможность различать объекты и отдельные детали от их фона. Если различие в яркости объекта и фона составляет менее 3 – 4 %, то его невозможно различить, даже если оптика микроскопа теоретически способна разрешить его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики прибора уловить возникающие различия в свойствах луча. Главным ограничением для возможностей светового микроскопа является волновая природа света, которое не позволяет увидеть объекты, размеры которых сопоставимы с волновой длиной электромагнитного излучения светового диапазона, т.е. меньше 1 микрометра.
Для различных нужд создаются оптические системы различной конструкции [3, 4]:
Прямой микроскоп является наиболее часто встречаемой конструкцией. Такая схема используется чаще всего при изучение прозрачных и полупрозрачных микрообъектов размеров, сопоставимых с клетками. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в различных областях биологии (ботанике, микробиологии, цитологии) и медицины (обычно это микробиологический и гистологический анализ материала).
Инвертированная схема микроскопа отличается от прямой тем, что в ней объективы находятся не над, а под исследуемым предметом. Это позволяет оптимизировать конструкцию инструмента для работы с достаточно большими по своему объему объектами, вроде флаконов для культивирования клеток. В зависимости от назначения и особенностей конструкции, инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и др. Подобные приборы широко используются при различных научных и лабораторных исследованиях в микробиологии и медицине.
Стереоскопические или стереомикроскопы имеют в своей конструкции два расположенных под углом объектива, и благодаря этому позволяют получать стереоскопическое изображение исследуемого объекта. Стереомикроскопы обладают существенно большей глубиной резкости, чем обычные, что позволяет использовать их для изучения относительно крупных и выпуклых микрообъектов – таких как части растений, грибов, колонии микроорганизмов. Выделяют два типа конструкции световых микроскопов: схема Грену и оптическая система с общим главным объективом.
Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле [2,5]. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. У светового микроскопа максимальная разрешающая способность составляет 0,2 мкм, что обеспечивает высокоточное увеличение микроскопа до 1500х.
Фазово-контрастная микроскопия (рис. 1) используется для получения высококонтрастных изображений прозрачных образцов, таких как живые клетки, микроорганизмы, тонкие кусочки ткани, литографические узоры, волокна, латексные дисперсии, осколки стекла и субклеточные частицы, включая ядра и другие органеллы. Метод контраста участка использует оптический механизм для того, чтобы перевести мельчайшие изменения в участке в соответствующие изменения в амплитуде, которые можно визуализировать как разницы в контрасте изображения. Одно из главных преимуществ микроскопии контраста участка в том, что живущие клетки можно рассмотреть в их естественном положении, без предварительного убийства. В результате динамика протекающих биологических процессов может наблюдаться и регистрироваться в высоком контрасте, с высокой четкостью мельчайших деталей образца.
Чтобы хорошо визуализировать эти биологические материалы, они должны иметь контраст, вызванный надлежащими показателями преломления, или окраску. Поскольку красители обычно токсичны, для достижения контраста может использоваться темная поляризационная микроскопия [2, 6]. В темнопольной микроскопии конденсатор предназначен для формирования «полого» конуса света (рис. 2). В темной микроскопии объектив находится в темной полости этого конуса, а свет распространяется вокруг объектива, но не входит в зону конуса. Все поле зрения кажется темным, но когда на предметный столик помещается образец, он кажется ярким на темном фоне. Он похож на заднее освещение объекта, который может быть того же цвета, что и фон, на котором он сидит, – чтобы он выделялся. Темнопольная микрокопия позволяет увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.
Рис. 1. Интернет: Stormoff, stormoff.ru, 2018
Рис. 2. Интернет: Studopedia, studopedia.ru, 2018
Лазерная конфокальная микроскопия
Конфокальная микроскопия (рис. 3) обладает такими особенностями, как контролируемая глубина резкости, устранение шумов вне фокуса и возможность сбора последовательных оптических секций из толстых образцов [5]. Конфокальная микроскопия основана на использовании пространственной фильтрации для устранения света вне фокуса и вспышки в образцах, которые толще плоскости фокусировки. Когда флуоресцентные образцы визуализируются с использованием обычного широкополосного оптического микроскопа, вторичная флуоресценция, испускаемая образцом вдали от интересующей области, часто мешает разрешению тех объектов, которые находятся в фокусе. Конфокальный метод визуализации обеспечивает незначительное улучшение как в осевом, так и в поперечном разрешении, но также обладает способностью исключить из изображения вспышку «вторичную флуоресценцию», которая возникает в густых флуоресцентно меченых образцах. Эта особенность вызвала большой рост популярности конфокальных микроскопов. Освещение достигается путем сканирования одного или нескольких фокусированных лучей света, обычно от лазера. Изображения, полученные путем сканирования образца таким образом, называются оптическими сечениями.
Читайте также: Образовательная ткань растений флоэма
Рис. 3. Интернет: 5fan, 5fan.ru, 2018
Мультифотонная микроскопия схожа с конфокальной и обеспечивает четкие преимущества для трехмерной визуализации [6]. Она хорошо подходит для визуализации живых клеток, особенно в интактных тканях, таких как срезы мозга, эмбрионы, а так же целые органы или небольшие организмы. Эффективная чувствительность флуоресцентной микроскопии, особенно при работе с толстыми образцами, как правило, ограничена вспышкой без фокуса. Это ограничение значительно сокращается в конфокальном микроскопе, с помощью конфокального отверстия для отклонения фоновой флуоресценции фокуса и получения несжатых оптических секций менее 1 микрометра. Мультифотонная микроскопия имеет преимущества: 1. Вследствие значительно меньшего поглощения тканей и клеток в ИК – области по сравнению с УФ, уменьшается повреждение живых клеток фотоиндуцированными процессами. 2. Достигается большая глубина проникновения излучения в биологические объекты. 3. Отсутствует возбуждение и выцветание флуорохромов вне фокального микрообъема, поэтому конфокальная диафрагма не требуется.
Эпоха, когда оптическая микроскопия была чисто описательным инструментом прошла. В настоящее время формирование оптического изображения является лишь первым шагом к анализу данных. Микроскоп выполняет этот первый шаг в сочетании с электронными детекторами, процессорами изображений и устройствами отображения, которые можно рассматривать как расширения системы формирования изображения. Компьютеризированное управление фокусом, сценическим положением, оптическими компонентами, ставнями, фильтрами и детекторами широко распространено и позволяет проводить экспериментальные манипуляции, которые невозможны для человека при использовании механических микроскопов. Возрастающее применение электрооптики в флуоресцентной микроскопии привело к созданию оптических пинцетов, способных манипулировать субклеточными структурами или частицами, изображениями отдельных молекул и широким спектром сложных спектроскопических приложений.
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гистологические методы исследования (греч. histos столб, ткань + logos учение) — методы, применяемые для изучения строения и функций клеток и тканей растительных и животных организмов в норме, патологии и в эксперименте. Более узким по сравнению с Гистологическими методами исследования является термин «гистологическая техника», к-рым обозначают комплекс методических приемов, используемых в гистологии (см.), а также в нормальной и патологической анатомии, гл. обр. при изготовлении препаратов клеток и тканей для их последующего микроскопирования.
История
История развития Гистологических методов исследования тесно связана с совершенствованием микроскопической техники. В 17 —18 вв. под микроскопом изучали высушенные, позднее — живые объекты. С увеличением разрешающей способности микроскопов появилась возможность изучения мелких деталей клеток и тканей. Это потребовало изготовления более тонких, пропускающих достаточное количество света препаратов, для чего использовали различные приемы раздавливания, мацерации, расщепления тканей. Затем стали изготовлять срезы тканей, сначала от руки бритвой и лишь с 70-х гг. 18 в. с помощью специальных приспособлений — микротомов. Только в 19 в. были разработаны основные приемы изготовления постоянных гистологических препаратов (пригодных для многократного использования в течение длительного времени): фиксация, пропитывание тканей в средах, позволяющих изготавливать тонкие срезы на микротоме, окраска и заключение срезов в различные среды.
В первой половине 19 в. чешский физиолог и гистолог Я. Пуркинье применил с помощью специальных методов заливки уплотнение исследуемых тканей, ввел в гистологическую технику бальзам, просветление тканей в скипидаре и оливковом масле, окраску препаратов индиго и др. В 1842 г. Ганновер (A. Hannover) предложил в качестве фиксатора хромовую к-ту, в 1844 г. Майер (С. Mayer) сделал попытки микрофотографирования. В 1851 г. был применен кармин для окраски, в 1860 г. — серебрение тканей (Ф. Реклингхаузен). С появлением первых теоретических работ о механизмах фиксации и окраски [Витт (О. Witt), 1890; П. Эрлих, 1891] гистологических объектов техника гистол, исследований стала быстро развиваться.
В развитии гистологической техники важная роль принадлежит отечественным исследователям. В 1782 г. А. М. Шумлянский применил очень тонкие методы инъекции красящих р-ров для изучения кровеносных сосудов и мочевых канальцев почек.
А. И. Бабухин внес ряд усовершенствований в конструкцию микроскопа и микротома. К. А. Арнштейн, А. С. Догель, О. Е. Смирнов усовершенствовали метод окраски нервных элементов метиленовым синим (см. Догеля метод).
Пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния
Существуют два основных пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния:
1) исследование живых (переживающих) клеток и тканей;
2) исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих в той или иной мере морфологические особенности и химическую структуру, присущую данному виду тканей. Во втором случае исследование начинается с выбора способа фиксации, затем следует заливка препаратов и приготовление срезов, окрашивание и заключение препаратов в среды.
Исследование живых или переживающих объектов (витальное и суправитальное) дает возможность наблюдать физиол, процессы в клетках и тканях, исследовать прижизненное их строение. Витальным наблюдением принято называть исследование клеток и тканей в живом организме, суправитальным — исследование живых клеток и тканей, выделенных из организма непосредственно перед исследованием и помещенных в соответствующие условия наблюдения. Прижизненные наблюдения можно проводить на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде или выделенных из фрагментов тканей (простейшие, клетки крови, эпителиальные клетки соскобов слизистых оболочек и т. п.). Большие возможности для прижизненного наблюдения клеток и тканей дает метод культуры клеток и тканей (см.). При этом извлеченные из организма кусочки тканей помещают в специальные питательные среды, где клетки растут, размножаются или нек-рое время находятся в состоянии «переживания». С помощью этого метода визуальным путем или способом микрокиносъемки (см.) анализируют свойства исследуемых тканей, их способность к пролиферации (см.), автономному росту (см.), чувствительность к различным факторам и пр. Клетки помещают в капле физиол. р-ра или среды, в к-рой они культивируются, на предметное стекло (обычный размер 76 X 26 мм, толщина 1—2 мм), накрывают покровным стеклом (обычный размер 18 X 22 мм, толщина 0,15—0,20 мм) и изучают под микроскопом. Для предотвращения охлаждения и высыхания препаратов используют специальные приспособления (камеры с подогревом и заданной влажностью, нагревательные столики и т. п.). Простейшим приемом, предотвращающим высыхание препаратов, может служить смазывание краев покровного стекла растопленным парафином, вазелином и т. п.
Для изучения процессов образования антител, продукции гормонов, кроветворения, злокачественного роста и др. нередко применяют культивирование ‘ клеток в диффузионных камерах, стенки которых сделаны из миллипорных фильтров, пропускающих макромолекулы, но не пропускающих клетки. Такие камеры имплантируют в различные ткани организма, наблюдая изменения находящихся внутри камеры клеток под влиянием гуморальных факторов организма или веществ, введенных в камеру одновременно с клетками.
Объектом прижизненного наблюдения могут служить и тонкие, пропускающие свет тканевые пленки (брыжейка, плавательные перепонки и т. п.). Выделенную брыжейку животных, напр., можно наблюдать под микроскопом, не нарушая ее нервных и сосудистых связей с организмом. Помещая органы во влажные прозрачные камеры, можно наблюдать многие микрофизиологические процессы в ряде органов лабораторных животных. Так, напр., у крысы удалось наблюдать [Блум и Фоситт (W. Bloom, D. Fawcett), 1968] процесс овуляции и перемещения яйца в яйцевод. Методы выведения органов и тканей во влажные прозрачные камеры без нарушения связей с организмом могут использоваться лишь в острых опытах. Для продолжительных, повторяющихся наблюдений используют различные модификации предложенного Сэндисоном (J. С. Sandison, 1924) так наз. метода окошечек. При этом сквозное отверстие, сделанное в ухе кролика (или в складке кожи), с обеих сторон плотно закрывают тонкими стеклянными (или иными прозрачными) пластинками. В пространство между пластинками прорастает окружающая соединительная ткань с сосудами, что можно наблюдать, помещая «окошечко» под микроскоп. С помощью этого метода были сделаны важные наблюдения над развитием и функцией мелких тканевых сосудов и капилляров, поведением трансплантатов различных органов и т. д. Естественной прозрачной средой для прижизненных микроскопических наблюдений за теми или иными тканями может служить передняя камера глаза животных, в к-рую имплантируют изучаемую ткань. Так, в передней камере глаза удалось наблюдать первые стадии развития оплодотворенного яйца мыши, циклические изменения в кусочке трансплантированного эндометрия обезьяны (Блум и Фоситт, 1968), реактивные изменения имплантатов скелетной мышечной ткани и т. д.
Читайте также: Ткань льдинка для чего
Важное место среди приемов исследования живых клеток и тканей занимают методы микрургии (см.), т. е. совокупность методических приемов, дающих возможность производить разнообразные операции над помещенными в питательную среду очень мелкими и микроскопическими объектами (простейшими, клетками или комплексами клеток многоклеточных животных, яйцами иглокожих, земноводных, зародышами, внутриклеточными структурами и т. п.). В зависимости От размеров объекта операции производят вручную или с помощью специальных микроманипуляторов (см. ниже, раздел «Аппараты для гистологических исследований»). С их помощью можно производить пересадки ядер и ядрышек, введение в изолированные клетки различных веществ, подведение к клеточным мембранам микроэлектродов и т. д. Для локального разрушения микроструктур клеток, напр, ядрышек, используют сфокусированный пучок ультрафиолетовых лучей («лучевой микроукол») — прием, впервые предложенный С. С. Чахотиным в 1912 г. Использование методов прижизненных наблюдений ограничивается большими техническими трудностями, связанными со свойствами тканей (непрозрачность, оптическая однородность и т. д.), с повреждающими воздействиями освещения (особенно ультрафиолетовыми лучами и др.), токсическим действием красителей и т. п. Вследствие этого при исследовании живых и переживающих объектов , следует особенно тщательно подбирать специальные методы микроскопического исследования в каждом отдельном случае. Для витального исследования могут быть применены следующие методы микроскопии.
1. Микроскопия в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) основана на явлении рассеивания света на границе двух объектов с разными показателями преломления (напр., ядро и цитоплазма). Темнопольный микроскоп отличается от обычного только специальным конденсором, приспособленным для бокового освещения объекта. Т. о., прямой свет в объектив не попадает, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым на темном фоне. Так, напр., в живой клетке ядрышко, ядерная мембрана, митохондрии, жировые капли и другие включения будут светиться на темном фоне неструктурированной цитоплазмы. Метод находит применение в экспериментальной микробиологии, лабораторной диагностике, в частности для обнаружения бледных трепонем, и др.
2. Фазово-контрастная микроскопия (см.) и интерференционная микроскопия основаны на свойстве биол, структур, прозрачных для видимого света, изменять фазу проходящих через них лучей. Поскольку в разных участках объекта, отличающихся показателем преломления и толщиной, эти изменения неодинаковы, биол, структуры становятся видимыми. Фазово-контрастную и интерференционную микроскопию живых клеток и тканей, особенно физиологических процессов клеток культуры тканей, часто сочетают с замедленной (цейтраферной) или с ускоренной микро-киносъемкой, с помощью к-рой можно не только зафиксировать эти процессы, но и представить их в динамике. Интерференционную микроскопию используют также для получения количественных данных о сухой массе, показателях преломления объектов и их толщине. Разновидностью фазово-контрастного микроскопирования является аноптральная микроскопия.
3. Поляризационная микроскопия основана на свойстве анизотропии (двойного лучепреломления) структур в клетках и тканях и применяется гл. обр. для выявления и идентификации некоторых кристаллических веществ и липидов, а также поперечно-полосатых мышц, коллагена, миелина и т. д.
4. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (см. Люминесцентная микроскопия), основанная на регистрации флюоресцирующих веществ, дает возможность наблюдать клетки и ткани при освещении (возбуждении) ультрафиолетовыми или сине-фиолетовыми лучами. Люминесцентный микроскоп со стеклянной оптикой позволяет наблюдать флюоресценцию в видимой части спектра, ультрафиолетовый флюоресцентный микроскоп с кварцевой оптикой используется для изучения невидимой ультрафиолетовой флюоресценции путем ее фотографической или фотоэлектрической регистрации. С помощью люминесцентных микроскопов можно наблюдать собственную флюоресценцию содержащихся в тканях веществ, напр, витаминов А, B2, некоторых пигментов. В ультрафиолетовой области флюоресцируют, напр., содержащие триптофан белки. Наибольшее распространение, однако, получило использование специальных флюоресцентных красителей (см. Флюорохромы). Флюорохромы применяют в небольших концентрациях (1 : 10 000, 1 : 100 000), что позволяет широко использовать их для прижизненных наблюдений клеток и тканей. Интенсивность и спектры флюоресценции могут быть измерены (микрофлюорометрия), т. е. может быть получена и количественная, и качественная характеристика флюоресцирующих в клетке веществ. Флюоресцентные микроскопические методы широко используются не только для прижизненных наблюдений; они нашли применение в гистохимии, в иммуноморфологии (метод флюоресцирующих антител Кунса (см. Иммунофлюоресценция). Большие возможности для прижизненных наблюдений дает метод контактной флюоресцентной микроскопии (E. М. Брумберг, 1964), позволяющий получать изображения с поверхности органов и тканей. При этом используются специальные объективы, выполняющие одновременно роль опак-иллюминатора и конденсора.
5. Ультрафиолетовая микроскопия основана на абсорбции ультрафиолетовых лучей хим. структурами клеток (белки, нуклеиновые к-ты). Этот метод применим для прижизненных наблюдений, однако наибольшее распространение он нашел в количественной цито- и гистохимии — метод абсорбционной цитоспектрофотометрии (см. Цитофотометрия).
Способом улучшения условий микроскопического наблюдения над живыми объектами является прижизненное окрашивание их специальными красителями (см. Витальная окраска), позволяющее изучить детали строения микроскопических объектов и исследовать некоторые их физиологические свойства.
Несмотря на наличие многочисленных методов витальной микроскопии и на их большое значение, наиболее полную картину строения клеток и тканей можно получить при параллельном изучении живых и фиксированных объектов. Исследование фиксированных объектов дает возможность изучать структуру клеток и тканей неживых объектов.
Фиксация — сохранение структуры клеток тканей и микроорганизмов путем быстрого воздействия на них хим. или физ. агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений; привнесение артефактов при этом минимальное. Некоторые методы фиксации (см.) позволяют в известной степени сохранить и хим. структуру клеток и тканей. Выбор способа фиксации зависит от задач исследования и особенностей объектов. Так, при исследовании клеточных ядер и хромосом обычно используют кислые фиксаторы. При исследовании ферментативной активности применяют ацетон (см.), формальдегид (см. Муравьиный альдегид) или глютаральдегид, вызывающие минимальную денатурацию белка и сохраняющие многие ферментные системы.
Большинство фиксаторов применяют в виде р-ров, действующих гл. обр. на белковые компоненты клеток и тканей. Входящие в состав фиксирующих смесей вещества (формальдегид, сулема и т. д.) образуют прочные связи между белковыми молекулами. Так, формальдегид реагирует с аминами, карбоксильными и индольными группами белка, в результате чего между белковыми молекулами образуются метиленовые мостики; сулема действует на сульфгидрильных, карбоксильные и аминогруппы белка, образуя ртутные мостики между белковыми молекулами. Соли хрома вызывают окисление и осаждают белки и фосфолипиды. Широкое распространение получили фиксаторы, содержащие пикриновую к-ту. Одним из лучших фиксаторов для исследования цитологических объектов является четырехокись осмия (OsO4), часто используемая для фиксации объектов, подвергающихся электронной микроскопии (см.).
При выборе фиксирующих смесей необходимо учитывать проницаемость ткани для разного вида фиксаторов. В случае медленного проникновения фиксатора в тканях могут развиться деструктивные изменения, связанные с аутолитическим действием ферментов, аноксией и т. п. Плохо проникает в фиксируемую ткань, напр., четырехокись осмия. Поэтому в р-рах осмия фиксируют кусочки тканей толщиной не более 0,5—1,0 мм. При проведении гистохим. исследований (см. Гистохимические методы исследования) необходимо знать, как влияет та или иная фиксирующая смесь на различные хим. компоненты клеток и тканей. Так, для исследования растворимых соединений используют методы замораживания-высушивания (см. Высушивание, Лиофилизация), а также замещения в замороженном состоянии. Лиофилизации состоит в быстром замораживании ткани (обычно используют жидкий азот) и ее обезвоживании (сушке) в вакууме при t° —30—40°. При методе замещения в замороженном состоянии замороженные при температуре жидкого азота ткани затем выдерживают при t° —20—60° в реактиве, растворяющем кристаллы льда (этиловый и метиловый спирт, ацетон). Оба названных метода позволяют сохранить хим. состав клеток и тканей практически неизмененным.
По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты, имеющиеся в ткани (кость, хитин, отложения извести и др.), размягчают воздействием к-т или с помощью постоянного электрического тока — так наз. электролитическая декальцинация (см.) и после удаления из ткани к-ты приступают к изготовлению постоянных препаратов. Для изучения фиксированных объектов применяют многочисленные методы светооптической и электронной микроскопии.
В гистологической технике использование тотальных препаратов (мазки, отпечатки, пленочные препараты и т. п.) ограничено, и обычно приходится прибегать к изготовлению срезов тканей с помощью микротомов (см. ниже). Наиболее удобным способом, обеспечивающим быстрое изготовление срезов, является замораживание кусочка ткани. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы. Метод замораживания нельзя применять при работе с очень мелкими объектами; срезы некоторых тканей и органов крошатся и при оттаивании распадаются и т. д., в связи с этим ряд объектов приходится заливать в среды.
Заливка препаратов и изготовление срезов
Чаще прибегают к заливке объекта исследования в соответствующую среду, к-рая его пропитывает и уплотняет до консистенции, пригодной для изготовления срезов. Из сред для заливки наибольшее распространение получили парафин и целлоидин. Фиксированную ткань обезвоживают и пропитывают одним из этих веществ, проводя ее через промежуточный растворитель (ксилол или толуол для парафина, спирт-эфир — для целлоидина). Примерная схема заливки в парафин следующая. Кусочек ткани обезвоживают, проводя через ряд р-ров спирта возрастающей крепости (от 40 до 100%), затем помещают в смесь 100% спирта и ксилола (1 : 1), в ксилол (две порции), в смесь ксилола с парафином (1:1, при t° 37°), в чистый парафин (две порции, при t° 55—56°). Парафин быстро охлаждают, кусочек ткани с окружающим его парафином вырезают в виде так наз. блока. При заливке в парафин и изготовлении блоков можно пользоваться специальными рамками, позволяющими регулировать размер и форму блоков. Вместо ксилола можно использовать толуол, бензол, хлороформ, а также касторовое масло. В качестве промежуточной пропитывающей среды часто «используют диоксан, а для обезвоживания — бутиловый, изобутиловый или пропиловый спирты, амилацетат и т. п. Заливка в парафин позволяет получить достаточно тонкие, пригодные для световой микроскопии срезы (от 5—8 мкм и до 1—2 мкм). При заливке в целлоидин обезвоженный в спиртах кусочек органа или ткани переносят в смесь 100% спирта и эфира (1 : 1), после чего пропитывают спиртоэфирными р-рами целлоидина возрастающей концентрации (от 2 до 8%). Затем кусочек в виде блока в деревянных или пластмассовых рамках выдерживают в парах хлороформа до затвердевания целлоидина и помещают в 70% спирт, где препарат приобретает плотность хряща и может храниться долгое время. Целлоидиновые срезы легко режутся на микротоме и хорошо окрашиваются большинством красителей, однако толщина их больше, чем у парафиновых срезов. Иногда используют прием дополнительной заливки пропитанных целлоидином кусочков в парафин (заливка в целлоидин-парафин), что позволяет соединить преимущества обоих методов. Время обезвоживания, пропитывания в промежуточных и заливочных средах подбирают для каждого конкретного исследования. Все более широкое применение находят для заливки тканей синтетические смолы (аралдит, эпон и т. д.), особенно при изготовлении срезов для электронной микроскопии. Изготовленные срезы для дальнейшей обработки обычно наклеивают на предметные стекла. Замороженные и целлоидиновые срезы можно не наклеивать на предметные стекла, а переносить из одного р-ра в другой с помощью препаровальной иглы и т. п. Перед наклейкой парафиновых срезов на обезжиренные, чисто вымытые предметные стекла наносят тонкий слой смеси глицерина с куриным белком (1:1) и нагревают для денатурации белка. Затем в капле дист, воды на предметном стекле расправляют парафиновые срезы, слегка их подогревая. Избыток воды удаляют и стекла со срезами высушивают при t° 37—40° в термостате. Перед окраской или исследованием препаратов в неокрашенном виде из срезов удаляют парафин путем последовательного помещения препаратов в р-ры ксилола и спиртов понижающейся концентрации (от 100 до 40%). При использовании целлоидиновых срезов, как правило, не требуется специальных процедур удаления целлоидина — срезы проводят, минуя ксилол, через ряд спиртов понижающейся концентрации (вплоть до воды) и окрашивают.
Читайте также: Портьерная ткань блэкаут софт
Окрашивание фиксированных гистологических (цитологических) объектов служит для выявления (контрастирования) различных структур клеток и тканей, по-разному воспринимающих те или иные красители (см.) в зависимости от физ.-хим. свойств. Результаты окраски в значительной степени зависят от предшествующей обработки объекта (фиксации, заливки и т. п.). Гистол, окраска — сложный процесс, в к-ром играют роль многие физ.-хим. факторы, связанные со свойствами как красителя, так и окрашиваемого объекта. Гистол, красители классифицируют по источникам получения (натуральные и синтетические), по хим. строению (азокрасители, хинонимидные и т. д.), по способу использования (протравные и т. п.), возможности избирательно окрашивать объект (ядерные, цитоплазматические и т. п.) и по другим свойствам. По наиболее распространенной классификации красители подразделяют на основные, кислые, нейтральные и индифферентные. Основные красители представляют собой красящие основания или чаще их соли (метиленовый синий, толуидиновый синий, азуры, тионин, а также гематоксилин, бисмарк коричневый и др.). Окрашиваемые ими структуры называют базофильными (см. Базофилия). Интенсивность базофильной окраски зависит от числа кислотных групп, способных реагировать с красителем. Кислые (кислотные) красители — это красящие к-ты или их соли (пикриновая к-та, эозин, эритрозин, конгорот, лихтгрюн, оранж и т. д.). Окрашиваемые ими структуры называют ацидофильными (см. Ацидофилия), а также оксифильными или эозинофильными. К нейтральным красителям относятся смеси, содержащие как основные, так и кислые красящие компоненты, напр, смесь Романовского— Гимзы (см. Романовского-Гимзы метод) и др. Наконец, красящие свойства индифферентных красителей связаны с их способностью растворяться в определенных веществах. Так, напр., судан III или шарлах-рот хорошо растворяются только в жирах и вследствие этого избирательно окрашивают их в красно-оранжевый цвет.
Способы (механизмы) окрашивания гистологических структур весьма многообразны. Существующие теории (химическая, электроколлоидальная, физико-химическая, обменной адсорбции) касаются какого-то одного из механизмов окрашивания, но не охватывают всего многообразия связывания красителей со структурами клеток и тканей.
От окраски в собственном смысле слова отличают импрегнацию (см.) — специальный метод выявления структур клеток и тканей, основанный на различной их способности удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов (напр., серебра, свинца, осмия, золота).
Заключение препаратов в среды
Изготовление гистологических препаратов обычно заканчивается заключением их в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этой цели применяют канадский бальзам (см.) — особый вид смолы, растворимый в ксилоле, толуоле и бензоле. Хорошо промытые после окраски или фиксации препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси кристаллической карболовой к-ты (1 часть) и ксилола (3 части) и помещают в две порции чистого ксилола. Затем на препарат наносят каплю р-ра канадского бальзама (на ксилоле, толуоле или бензоле и др.) и покрывают покровным стеклом. После высыхания растворителя бальзам затвердевает, и препарат можно многократно использовать для микроскопирования. Существует много заменителей канадского бальзама (пихтовый бальзам, даммаровая смола, цедакс, полистирол и т. д.). В случаях, когда препарат нельзя приводить в контакт с ксилолом, спиртом и другими реактивами, растворяющими краситель или окрашиваемое вещество (напр., жиры) , используют водорастворимые среды (глицерин, желатину или их смеси). При применении плохо затвердевающих заключающих сред (напр., глицерина) края покровного стекла обычно окантовывают расплавленным парафином, менделеевской замазкой и т. п.
Специальные методы исследования
Из методов, применимых обычно к фиксированным клеткам и тканям или их компонентам, следует упомянуть гисторентгенографию (см. Микрорентгенография), рентгеноструктурный анализ (см.), автогисторадиографию (см. Авторадиография). Гисторентгенография основана на исследовании поглощения рентгеновских лучей структурами микрообъектов; напр., можно получить количественные данные о содержании кальция в различных участках кости и т. п. Рентгеноструктурный анализ (метод дифракции рентгеновских лучей) нашел широкое применение в исследовании органических кристаллов. В частности, с помощью этого метода изучена молекулярная структура коллагена, гемоглобина, ДНК, миоглобина и пр. Автогисторадиография — это метод регистрации радиоактивного распада в тканевых, клеточных структурах фотографическим способом. Метод широко используют в исследованиях клеточного метаболизма, а также как прием изотопной маркировки клеток при изучении их дифференцировки, возможных трансформаций и т. д.
В ряде гистологических исследований применяют макро-, микроскопические методы, предназначенные для изучения структур, находящихся на грани макроскопических и микроскопических величин. В таких исследованиях обычно используют бинокулярный (стереоскопический) микроскоп (лупу). Примером макромикроскопических методов может служить микротрахископия, разработанная М. А. Бароном (1949). Кусочки органов и тканей (обычно размером 1,5 X 1,5 см и толщиной не менее 3—4 мм) после фиксации и окраски разрезают параллельно поверхности на две части, так что препараты толщиной 1,5—2,0 мм оказываются окрашенными лишь с одной стороны. Полученные пластинки наклеивают неокрашенной стороной на целлулоид и просветляют в растворах глицерина и уксуснокислого калия возрастающих концентраций. Препарат заключают в прозрачную среду (глицерин, канадский бальзам и др.), помещают на вогнутое сферическое зеркало и рассматривают в бинокулярный микроскоп (лупу) при падающем и боковом (проходящем) свете. Метод позволяет изучать трехмерную топографию структур органов и тканей. При использовании соответствующих увеличений (объективов) удается наблюдать и микроскопические структуры — такие, как ядра клеток и даже ядрышки.
Гистологические методы исследования постоянно совершенствуются, появляются новые методы, основанные на использовании достижений оптики, физики, химии, молекулярной биологии и др. Широко используются методы гистохимии; электронная микроскопия позволяет исследовать все более мелкие структуры клеток. Совершенствуются также методы непосредственного наблюдения живых клеток и тканей, их культивирования, микрургические приемы. Постоянно развиваются и методы объективной регистрации микроскопических наблюдений, такие, как микрофотография, цейтраферная микрокиносъёмка.
Методические вопросы гистологии и цитологии освещаются во многих отечественных («Архив анатомии, гистологии и эмбриологии», «Архив патологии», «Лабораторное дело», «Онтогенез», «Цитология» и др.) и зарубежных [American J. Anatomy; Anatomical Record, J. Anatomy (London), J. Cell Biology; J. Histochemistry and Cytochemistry и др.] журналах.
Аппараты для гистологических исследований
В целях подготовки материала для гистологических работ и исследования препаратов применяют микроскопы (см.), микротомы, автоматизированные аппараты для гистол, обработки тканей и окраски препаратов, аппараты для лиофильной сушки препаратов, микроманипуляторы, термостаты (см.), нагревательные столики и устройства для автоматизации анализа морфологических структур.