Выделение и накопление вирусов на биологических моделях
1. Выделение вирусов на лабораторных животных.
Чаще всего в вирусологии в качестве биомоделей используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов, цыплят. Иногда используют также золотистых хомячков, утят и других животных. Условия использования лабораторных животных в качестве биомодели: Животные должны быть здоровы, получены из благополучного в отношении заразных болезней питомника, чувствительны к конкретному вирусу, стандартны (то есть одинаковы по полу, физиологическому состоянию, весу). Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса.
Иногда при первом заражении у лабораторного животного не проявляются клинические признаки и патологоанатомические изменения, оно не погибает и остаётся здоровым. Тогда приходится проводить 3-5 «слепых», бессимптомных пассажей (перезаражений), прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям. Однако к некоторым вирусам лабораторные животные в принципе не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных, как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.
Цель заражения лабораторных животных:
Изучение патогенеза болезни;
Выделение вируса из пат.материала;
Наработка иммунных и гипериммунных сывороток;
Поддержание вирусов в условиях лаборатории;
Титрация, с целью определения количества вируса в единице объема;
Лаб. Животные — биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;
Различают много способов введения вируссодержащего материала в организм животных:
Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают интрацеребрально (в головной мозг); респираторных — интраназально, интратрахеально; дерматропных – подкожно и внутрикожно.Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.
После заражения животных метят, помещают в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается. 3 признака указывают на результативность заражения: наличие клинических признаковгибель животного; патологоанатомические изменения в их органах и тканях.
2. Выделение вирусов на куриных эмбрионах
Куриный эмбрион — это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий — бруцеллы, риккетсии, вибрионы.
Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.
Преимущества использования куриных эмбрионов:
1.Экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны;
2.У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;
3.Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;
4.Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование — обычный термостат или инкубатор.
Методы выделения и очистки вирусов.
Выделение вирусов в культурах клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Читайте также: Как создать возможности для очищения тканей от погибших клеток
Выделение вирусов на лабораторных животных. При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Т.о., для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные. Методы очистки вируссодержащего материала. Вируссодержащий материал необходимо освободить от взвешенных плотных частиц песка и стекла, от обрывков тканей и клеточных элементов, от бактериальной и грибковой микрофлоры. Существует несколько методов очистки. Они бывают механические, физические, химические и биологические. Механические: 1.Фильтрация. Рабочую суспензию освобождают от сравнительно крупных взвешенных твердых частиц через бактериальные. При этом вируссодержащий материал освобождается от клеточных элементов и бактериальной микрофлоры. 2. Центрифугирование. 10% рабочую суспензию наливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 6-8 тыс. об/мин- 10-15 минут. При этом осаждаются не только частицы песка, стекла, обрывки клеток, но и бактериальная микрофлора. В надосадочной жидкости останется чистое вещество. Физические: Метод термолизиса. Химический метод очистки используется при работе с известными вирусами, на которые эфир или хлороформ не оказывает губительного действия, т.е. является эфиро и хлороформо устойчивым. Биологический метод очистки. Известно, что многие антибиотики не оказывают губительного действия на вещества, надежно убивают бактериальную микрофлору. С этой целью к рабочей суспензии добавляют пенициллин — для подавления грамм «+» микрофлоры, стрептомицин для подавления грамм ‹- › микрофлоры и нистатин для подавления грибковой микрофлоры в дозе от 500 до 2000 ЕД./мл в зависимости от степени бактериального загрязнения материала, и выдерживать 1 час. Для проверки суспензии на стерильность в отношении бактериальной микрофлоры делают посевы на МПА, МПБ, МППБ среду Сабуро или Чапека. Если в течение 3 суток роста микрофлоры нет, то суспензия считается стерильной и она пригодна к дальнейшей вирусологической работе по культивированию вирусов. Этот метод используется наиболее часто в лабораториях для очистки вируссодержащего материала от бактериальной микрофлоры.
Культуры клеток и их преимущество перед лабораторными животными и куриными эмбрионами.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
Выделение вирусов и методы их индикации
I. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0-1,5 мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:
Читайте также: Шапочка для бассейна ткань силикон
1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), которое может быть трех основных
а) кругло — или мелкоклеточная дегенерация;
б) образование многоядерных гигантских клеток — симпластов;
в) развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев кле-
2) Обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток.
3) Положительная реакция гамагглютинации (ГА).
4) Положительная реакция гемадсорбции.
5) Феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного. При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.
6) При отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция к интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдаем ЦПД.
II. Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка, или место расположения эмбриона, или границы желточного мешка.
Заражение куриных эмбрионов производят в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом.
Могут быть использованы различные методы заражения куриных эмбрионов: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям, («бляшкам»), на хорион-аллантоисной оболочке.
III. Лабораторные животные могут быть использованы для выделения вирусов из инфекционного материала, когда невозможно использовать более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Используют преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражение животных производится по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.
Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических изменений в тканях и органах, а также на положительной реакции гемагглютинации с экстрактами из органов.
Выделение вируса из тканей
Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3
4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом