Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара – 0,6-1%), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду.
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным — пигментированным полностью или зонально.
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают: 1) рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающимися на отдельные клетки, 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами, 3) плотными с зонами редуцированного камбия и сосудов.
Как правило, в длительной пересадочной культуре, на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.
В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растений онтогенез: они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и наконец деградируют.
Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Термин этот не является строго научным и очень точным, так как не объясняет основной особенности поведения клеток при таком выращивании.
Получено еще сравнительно мало культур клеток высших растений, по своим параметрам полностью удовлетворяющих требованиям суспензионного (глубинного) культивирования. В значительной мере это объясняется трудностями получения культуры клеток, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Представляется целесообразным поэтому сначала рассмотреть методы получения клеточной суспензии, а также обсудить само понятие суспензионной (глубинной) культуры применительно к растительным клеткам.
Безусловно, выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом. Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.
Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски запасающей паренхимы мясистых корней моркови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии.
Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Рыхлые обводненные культуры каллусных тканей более пригодны для перевода в суспензию, чем структурированные плотные каллусы. Оптимальными подходами для получения суспензии являются выращивание каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из среды ионов кальция, обработка пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролифелирующая) часть каллусной ткани, а ее количество должно быть в 15-20 раз больше в расчете на объем питательной среды, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования, но в некоторых случаях увеличивают количество ауксинов и (или) уменьшают количество цитокининов. Режим перемешивания и аэрации при инициации культуры клеток обычно такой же, как и при дальнейших серийных субкультивированиях культур клеток на роллерах и качалках (круговая качалка – 10-12 оборотов/минуту).
Образование первичной суспензии растительных клеток можно считать результатом трех процессов: 1) распадение каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду; 2) отделение клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований; 3) деления и роста клеток, образовавшихся по первым двум способам, и распадения разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки. Последний процесс является типичным для роста стабилизировавшейся перевиваемой культуры клеток высших растений.
Первичную суспензию перед субкультивированием либо в специальном цилиндре разделяют на фракции по скорости седиментации (используют вехнюю фракцию) либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.
Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобретения клеточной суспензией желательных характеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культивирования.
Для глубинного культивирования растительных клеток применяются способы, разработанные для микробиологических целей. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Хотя, при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.
Однако до настоящего времени наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круговые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.
Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Модельная ростовая кривая имеет типичную S-образную форму (рисунок 6).На ней различают:
Рис. 6. Фазы кривой роста популяции растительных клеток:
I – лаг-фаза, II – экспоненциальная фаза, III – фаза линейного роста, IV – фаза замедленного роста, V – стационарная фаза, VI – фаза отмирания.
1) латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулята не наблюдается ни по одному из критериев. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность периода адаптации зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования;
2) экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с максимальной скоростью, максимальными величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа;
Читайте также: Сумочки мешочки из ткани
3) линейную, в течение которой скорость роста постоянна;
4) фазу замедленного роста, связанного с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена, и характеризующуюся несбалансированным ростом популяции по основным критериям, снижением уровня дыхания, переходом части клеток в дифференцированное состояние, увеличением доли крупных вакуолизированных клеток. Увеличением синтеза вторичных метаболитов (сердечных гликозидов, антрахинона, диосгенина);
5) стационарную фазу, характеризующуюся еще малой скоростью деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток, высокими биосинтетическими и биотрансформирующими потенциями жизнеспособных дифференцированных клеток, низким уровнем дыхания и появлением чрезвычайно крупных вакуолизированных клеток;
6) фазу деградации клеток с удельной скоростью роста, принимающей отрицательное значение.
Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания). Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания. Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и появление других стойких признаков, передающихся в ряду клеточных поколений, приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или создать экспериментально линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.
Культивирование отдельных клеток
Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки. Причем, изолированные протопласты являются идеальными отдельными клетками.
Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании клонового материала. Отдельные клетки важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора.
Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке. Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют колонии каллусных клеток. Для получения отдельных мацерированных клеток используются специальные мацерирующие ферментативные препараты, содержащие мацеразу (полигалактуроназу), пектиназу, поливинилпирролидон, сульфат калия, сорбит (маннит), 2-N-морфолино-этансульфоновую кислоту. Данная процедура производится в ламинар-боксе в условиях строгой стерильности.
Отдельные клетки также могут быть получены из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра или путем последовательных разбавлений. В этом случае суспензии готовятся разными способами: 1) 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток, 2) суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся диаметром пор. Для последовательных разведений используют платы для микротитрований, что позволяет микроскопически контролировать клеточный состав при последовательных разведениях.
Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, причем объем среды должен быть минимальным. Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким. Более эффективны методы «кормящего слоя» или «ткани-няньки». Для создания «кормящего слоя» берут суспензию клеток того же вида растения. Клеточная суспензия должна находиться в ранней стадии ростового цикла. Каллусная культура, служащая «тканью-нянькой», также должна быть в стадии активного роста. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара. Использование «кормящего слоя», «ткани-няньки» или минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связаны с явлением, называемым «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки, и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не решен.
Изучение механизма взаимодействия клеток при размножении их в популяции — важная научная проблема, которая решается на уровне культивирования отдельных клеток.
Лекция 4. Получение каллусной культуры и ее культивирование Вопросы 1. Получение каллуса и его культивирование 2. Физические факторы культивирования 3. — презентация
Презентация была опубликована 6 лет назад пользователемИннокентий Ширинкин
Похожие презентации
Презентация на тему: » Лекция 4. Получение каллусной культуры и ее культивирование Вопросы 1. Получение каллуса и его культивирование 2. Физические факторы культивирования 3.» — Транскрипт:
1 Лекция 4. Получение каллусной культуры и ее культивирование Вопросы 1. Получение каллуса и его культивирование 2. Физические факторы культивирования 3. Типы дифференцировки в культуре клеток
2 1. Получение каллуса и его культивирование Каллусные ткани являются одним из основных объектов при длительном культивировании in vitro. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Эта ткань защищает место ранения, накапливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа. Для растения каллус представляет собой ткань, возникающую в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующую непродолжительное время. 2
3 In vitro каллус образуется на изолированных кусочках ткани (эксплантатттттт). Образование и рост каллусной культуры регулируется ауксинами и цитокининами. Эти гормоны индуцируют образование каллуса у тех растений, которые его не образуют в ответ на ранение. 3
4 Каллусную ткань in vitro можно получить практически из любой живой ткани растения. 4 Выбор эксплантаттттт определяется целями исследования. Необходимо убедиться, что выбранный эксплант находится в подходящем биологическом состоянии.
5 Молодые ткани более пригодны для получения каллусной культуры, чем зрелые. Лучшими эксплантатттттми также являются ткани, ответственные за пролиферацию (разрастание ткани путём размножения клеток делением). Для индукции каллюсогенеза нежелательно использовать одревесневшие ткани, старые ткани с низким уровнем метаболизма, плохо пролиферирующие ткани (мякоть плодов и др.), ткани, покрытые восками, и т.п. 5
6 Проращивание простерилизованных семян в асептических условиях часто дает наиболее пригодный материал для получения каллусов. Процесс получения первичного каллуса и дальнейшего его культивирования требуют стерильности. Обычно используют известные методики стерилизации либо разрабатывают их экспериментально для каждого конкретного объекта. 6
7 Достаточно важным фактором для индукции каллюсогенеза является механическое повреждение ткани эксплантаттттт. Еще со времен Габерландта быстрое деление каллусных клеток связывалось с выделением растением в связи с травмой некрогормонов. 7
8 Известны примеры каллюсогенеза, не связанного с травмой. Так, образование каллуса в культуре изолированных пыльников, зародышевых мешков и некоторых других объектов происходит без наружного травмирования. 8
9 Многие ткани обладают физиологической полярностью, поэтому важна определенная ориентация эксплантов в пространстве при переносе их на питательную среду. — Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на агар горизонтально. — Сегменты стебля лучше образуют каллус, если их поместить вертикально, одним из концов погрузив в агар. 9
Читайте также: Пакеты из ткани для обуви
10 При этом каллус образуется более интенсивно на стороне эксплантаттттт, которая на материнском растении обращена к корню. В случае изоляции эксплантов из корнеплодов полярность не имеет существенного значения. 10
11 Для образования каллусной ткани in vitro клетки эксплантаттттт должны дифференцироваться, т.е. утратить специфические характеристики исходной ткани. Перестройка клеток эксплантов разных специализаций, предшествующая каллюсогенезу, происходит сходным образом. Клетки эксплантов теряют вещества запаса – липиды, крахмал, белки. Фотосинтезирующие клетки теряют хлорофилл и липиды хлоропластов. Разрушается аппарат Гольджи Перестаивается эндоплазматический ретикулум и элементы цитоскелета, увеличивается число полисом Клетка синтезирует РНК и ДНК, и начинается экспрессия генов, присущих каллусным клеткам Исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток Таким образом, превращению любой клетки в каллусную предшествует процесс глубокой биохимической и структурной перестройки. 11
12 Добавление к среде экзогенных гормонов приводит к началу каллюсогенеза. Обязательным условием дедифференцировки клетки и ее превращения в каллусную клетку является присутствие в питательной среде представителей двух групп регуляторов роста: ауксинов и цитокининов. (Наиболее удобной моделью для изучения механизма дифференциации и каллусообразования служит культура сердцевинной паренхимы стебля табака, поскольку для нее существует строгая зависимость индукции деления и каллусообразования от присутствия ауксина и цитокинина.) 12
13 Отсутствие цитокининов в питательной среде блокирует клеточный цикл в пресинтетическом периоде (сразу после выхода клетки из митоза). Поэтому, если в питательной среде присутствует только ауксин, клетки не делятся и после четырехдневной латентной фазы переходят к росту растяжением. Одни цитокинины без ауксинов приводят к такому же старению тканей, как и на среде без гормонов. 13
14 В результате процесса дедифференцировки происходит образование in vitro первичного каллуса. Но получить каллус первый раз из нового растительного материала часто бывает трудно, потому что ткани разных видов растений и даже разных частей растения требуют для дифференциации и каллюсогенеза разного количества и соотношения гормонов. 14
15 Сроки образования каллуса маклер сердцевидной на питательных средах Экспланты Варианты МС+vit В5+2,4-Д МС+vitC+ гидр. казеина + 2,4-Д + кинетин МC+vitB5+ vitC +2,4-Д +кинетин МС+vitC+2,4-Д +гидр. казеина +актив. уголь МС + 2,4-Д+ +кинетин Количество дней Листовые Роста нет Черешковые Роста нет
16 Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Однако было бы ошибочно думать, что каллусные ткани однообразны. Исследователи делят их на типы по таким морфологическим признакам, как цвет, консистенция, характер поверхности, а также по интенсивности роста и способности к озеленению. 16
17 Цвет каллусной ткани может быть беловатым, желтоватым, бурым, коричневым, полностью или частично пигментированным хлорофиллом или антоцианами. Темно-коричневая окраска часто возникает при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты. 17
19 В зависимости от источника получения различают гомогенные (содержат один тип клеток) и гетерогенные (содержат несколько типов клеток) каллусы. 19
20 В зависимости от консистенции каллусные ткани бывают рыхлыми, среднеплотными и плотными. Рыхлые каллусы состоят из сильно обводненных клеток и легко распадаются на мелкие агрегаты. Среднеплотные каллусы имеют хорошо выраженные очаги меристематической активности, их клетки могут быть отделены друг от друга сильным взбалтыванием. 20
21 Для плотных каллусов характерны очень мелкие клетки, а также наличие выраженных зон с камбиальными и трахеи подобными элементами. 21
22 В случае получения первичного каллуса при оптимально подобранной среде часть эксплантов обычно за 3–8 недель образует каллусы в количестве достаточном для пересадки. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, полученный каллус переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. 22
23 Первичный каллус разделяют на части, которые в дальнейшем культивируются отдельно. Следует обратить внимание на размеры кусочков каллуса, переносимых на свежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейший рост каллуса может быть угнетен. 23
24 Каллусные ткани в условиях in vitro можно выращивать неопределенно долго, периодически пересаживая их на свежую питательную среду. Удачно полученные линии каллусных культур требуют регулярной пересадки примерно через каждые 4 недели. В зависимости от условий культивирования и происхождения исходного эксплантаттттт в каллусных культурах могут происходить различные преобразования. Одно из них заключается в образовании «привыкшей» ткани. Под действием факторов среды в процессе культивирования могут возникать мутантные клетки – продуценты больших количеств фитогормонов. 24
25 Если такие клетки получают преимущественное развитие, то в культуре обеспечивается уровень фитогормонов, необходимый для роста ткани на питательной среде без данного регулятора роста. В результате могут формироваться или ауксин- независимые или цитокинин-независимые культуры. Их принято называть «привыкшие» ткани или «химические» опухоли. 25
26 2. Физические факторы культивирования Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные физические условия выращивания. Температурный фактор оказывает значительное влияние на рост в условиях in vitro, активность ферментов, часть из которых является необходимой для метаболизма источников питания и др. Температура в камерах фитотрона в большинстве лабораторий поддерживается на уровне 26, 1 о С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29–30 о С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 о С. 26
27 Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как они не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофное. Исключение составляют некоторые зеленые каллусы. Большинство же каллусных тканей получают в темноте, или при рассеянном свете. Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000–4000 лк. Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света. Свет разной длины волны регулирует процессы первичного и вторичного метаболизма. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта. 27
28 Влажность в культуральной комнате должна составлять 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. 28
Читайте также: Мебельные ткани варшавское шоссе 125
29 Наилучший световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер. При поверхностном и суспензионном выращивании клеточных популяций важное значение имеют условия аэрации и состав газов. Хотя оптимальные условия газового режима в культуре клеток и тканей остаются малоизученными, известно, что в зависимости от газовой смеси (кислород, азот, углекислота) резко изменяется как интенсивность клеточного деления, так и процессы дифференцировки и формообразования. 29
31 5. Типы дифференцировки в культуре клеток Дифференцировка клеток растений in vitro может происходить различными путями и в разной степени – от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Выделяют следующие ее типы: 1. Наиболее простой вид дифференцировки – появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфическое морфологическое строение и выполняющих особые функции. Достаточно часто наблюдается возникновение эпибластов – клеток, депонирующих запасные вещества, а также вторичные метаболиты. 31
32 2. Гистологическая дифференцировка каллусных клеток (гистогенез) – образование в каллусе различных тканей. и клетки–спутницы флоэмы. В каллусной ткани может проходить образование млечников, волокон, трихом; сюда же можно отнести образование элементов сосудистой системы – трахеи и трахеиды ксилемы, ситовидные трубки 32
33 3. Органогенез – это дифференциация каллусных клеток в целые органы; превращение их в апексы стеблей или флоральные элементы. 4. Соматический эмбриогенез – образование в каллусной ткани или суспензионной культуре эмбриоидов, т.е. зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. Ризогенез Развитие эмбриоидов 33
34 Морфогенез в культуре in vitro принято делить на два типа: 1. образование монополярных органов: апексы; вегетативные побеги; побеги, развивающиеся как флоральные элементы; кончики корней; 2. образование биполярных органов, развивающихся как соматические эмбриоиды. Соматический эмбриогенез – восстановление целого организма из его части 34
35 Кроме того, различают прямой и непрямой органогенез. Прямой органогенез – это путь, при котором развитие корней, стеблевых и цветочных почек происходит непосредственно из клеток эксплантаттттт без образования каллуса. Непрямой органогенез – путь формирования морфологических структур, приводящий к образованию корней, стеблевых и цветочных почек в каллусной культуре. 35
36 Возможные пути преобразования при культивировании изолированных растительных тканей и индукции морфогенеза 36
37 Направление процесса органогенеза in vitro зависит от следующих факторов: таксономической принадлежности и генотипа исходного растения; онтогенетического возраста растения; локализации ткани, использованной в качестве эксплантаттттт; действия физических факторов при культивировании (температура, содержание кислорода, продолжительность и качество освещения); длительности культивирования; состава питательной среды. 37
38 Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений. У двудольных растений каллусную ткань способную к органогенезу можно индуцировать не только из меристематических клеток, но из вполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. 38
39 Перечень семейств высших растений, расположенных по степени снижения способности к органогенезу 39
40 Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного эксплантаттттт. Культивирование молодых листьев Образование корней Культивирование листьев растений средних по возрасту Образование стеблевых почек, корней Культивирование листьев зрелых растений Образование стеблевых почек Характер органогенеза 40
41 Уровень эндогенных фитогормонов определяет зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, используемой в качестве исходного эксплантаттттт. При культивировании на среде одного и того же состава сегментов стебля, выделенных из разных частей цветущего растения табака, можно наблюдать проявление разных типов органогенеза. 41
42 Сегменты стебля, изолированные от базальной части Образование вегетативных почек Сегменты стебля, изолированные от средней части Образование вегетативных и цветочных почек Сегменты стебля, изолированные из зон близких к соцветию Образование цветочных почек 42
43 Среди факторов питательной среды, влияющих на особенности регенерации в культуре ткани, наиболее важными для регуляции направления морфогенеза являются регуляторы роста. При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности 43
44 C точки зрения биотехнологии соматический эмбриогенез имеет много преимуществ перед органогенезом. Регенерант на основе соматического зародыша полностью сформирован, тогда как побеги, полученные в результате органогенеза надо укоренять, а лишний труд неэкономичен для биотехнологии. Соматический эмбриогенез незаменим и для фундаментальных исследований. Соматический эмбриогенез экспериментально вызванное развитие новых организмов из отдельных соматических клеток или из комплексов их. 44
45 Различают прямой и непрямой пути соматического эмбриогенеза. Прямой соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного зародыша из одной или нескольких клеток тканей эксплантаттттт без стадии образования промежуточного каллуса. Непрямой соматический эмбриогенез заключается в формировании зародышей из клеток каллусной ткани или суспензионной культуры. 45
46 Процесс соматического эмбриогенеза можно разделить на две стадии: 1. Начальная клеточная фаза, которая менее других изучена и наиболее важна – это первичные процессы в проэмбриогенных клетках, связанные с их переходом в детерминированное состояние. Данный этап не характерен для зиготы, развивающейся из зародышевого мешка. 2. Переход к эмбриогенезу или развитию зародыша in vitro. Этот этап включает стадии, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе: стадии глобулы, сердца, торпедо и сформированного проростка. 46
47 Морфологически такие стадии практически одинаковы in vivo и in vitro 47
48 Факторами, индуцирующими соматический эмбриогенез, являются фитогормоны. Наиболее эффективен ауксин 2,4-Д, однако он необходим только для детерминации клеток. Развивающиеся зародыши не нуждаются в гормонах, так как начинают вырабатывать их сами. Длительное пребывание проэмбрио ( предзародыш )в среде, содержащей ауксин, приводит к пролиферации клеток, составляющих эмбриональный комплекс, и к прекращению дифференциации эмбриоидов, то есть они снова превращаются в каллусные клетки. Эмбриогенный каллус, пересаженный на среду без ауксина или с пониженным его содержанием, образует эмбриоиды. Эмбриоиды, перенесенные на безгормональную среду, дают проростки. 48
49 Независимость соматического эмбриогенеза от гормонов является аргументом в пользу точки зрения о том, что сам процесс изолирования растительной клетки от организма стимулирует реализацию ее тотипотентности, т.е. переход к морфогенезу. ТОТИПОТЕ́НТНОСТЬ (от лат. totus весь, целый и potentia сила), способность отдельных клеток в процессе реализации заключенной в них генетической информации не только к дифференцировке, но и к развитию в целый организм. 49
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом