Перед заражением путем микроскопии отбирают пробирки культур клеток (КК) с хорошим сплошным монослоем. Дальнейшая работа с культурами клеток проводится в стерильном боксе. Заражение КК проводят 10% рабочей суспензией, приготовленной из исследуемого материала (патматериала) или вируссодержащим материалом, свободным от бактериальной и грибковой микрофлоры.
Применяют 2 способа заражения.
1. С выросшего монослоя в пробирках сливают ростовую питательную среду, клеточный слой ополаскивают раствором Хенкса для удаления белка питательной среды и продуктов клеточного обмена. Затем в КК наливают 0,8мл вируса или рабочей суспензии.
4-6 пробирок с КК оставляют для контроля, где только заменяют питательную среду.
Зараженные и контрольные пробирки с КК помещают в термостат при температуре +37С.
2. Сливают ростовую питательную среду. На клеточный слой наносят исследуемый материал или вирус. Плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают 1-2 часа на контакте. За это время вирус адсорбируется на поверхности клеток и частично проникает внутрь клеток. Затем монослой промывают раствором Хенкса, сливают жидкость вместе с продуктами клеточного обмена и не адсорбированным вирусом. В каждую пробирку наливают по 1мл поддерживающей питательной среды, плотно закрывают пробками, укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6 и ставят в термостат на инкубацию.
Ежедневно проводят микроскопию КК на выявление ЦПД. Микроскопию всегда начинают с контрольных КК.
Наиболее широко применяют стационарное инкубирование в термостате при 37 °С. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки — под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе — роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.
Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому (цитопатогенному) эффекту или цитопатическому (цитопатогенному) действию.
Американский ученый Хуанг в 1945 году объединил все дегенеративные изменения в пораженной вирусом клетке под общим названием ЦПД или ЦПЭ (цитоплазменное действие вируса или цитоплазменный эффект).
ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса.
ЦПД — это морфологические и функциональные изменения в культуре клеток под действием вируса, т.е. дегенерация, перерождение разрушение и гибель клетки.
Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8-10, окуляр х7-10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3 /4 — на три, если 12 — на два креста, 14— на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.
Читайте также: Ткань шинил что это за ткань
Нельзя допускать дегенерации всех клеток монослоя, т.к температура термостата (+37С) инактвирует значительную часть освободившегося вируса в культуральной жидкость. Выраженные поражения 50% клеток монослоя свидетельствуют об активной репродукции вируса во всех клетках. Зараженные пробирки или матрацы энергично встряхивают, клетки разрушаются, вирус заходит в питательную среду, которая называется культуральная жидкость.
Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 сут. после заражения (энтеровирусы), другие — через 1-2 нед. (аденовирусы).
Ряд авторов пытались сгруппировать сходные формы ЦПД. У одних получилось 23 формы, у других — 11, У третьих —5 и т.д. Но наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.
Фрагментация — разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).
Округление — потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).
Симпластообразование — растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цитоплазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот метод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы свиней некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.) Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.
Таким образом, ЦПД — это погибающие или погибшие клетки под действием вируса. Такие же дегенеративные процессы под действием вируса проходят и в клетках больных животных и людей.
Классификация ЦПД по Эндерсу включает 3 типа дегенерации в клетках.
1-й тип-набухание и округление инфицированных клеток с последующим появлением в них их цитоплазме выраженной зернистости, за счет фрагментации ядра и скопления продуктов нарушенного клеточного обмена. Затем эти клетки разрушаются.
Читайте также: Назовите особенности строения образовательной ткани
2-й- образование цитоплазматических и внутриядерных включений с последующим разрушением клеток.
3-й- характеризуется образованием гиганских многоядерных клеток симпластов, за счет слияния нескольких разрушенных клеток с цитоплазматическими и внутриядерными включениями.
Один вирус может вызвать дегенерацию клеток по 1 типу, другой по 2 типу и т.д. Эти изменения настолько характерны, что становится возможным не только определить наличие вируса в клетке, но и до некоторой степени судить о принадлежности вируса к тому или другому семейству.
Профессор Анджепаридзе внес существенные дополнения в оценку ЦПД, уточнил и детализировал этапы дегенеративных изменений в пораженных вирусом клетках.
1.Набухание и округление клеток.
2.Появление в цитоплазме мелкой зернистости.
3.Появление в цитоплазме крупной зернистости.
4.Выпадение пораженных клеток из монослоя.
6.Распад клеток образованием гиганских многоядерных клеток за счет слияния отдельных разрушенных клеток.
7.Отсутствие видимых дегенеративных изменений в клетках(латентная вирусная инфекция).
При неопластической трансформации пораженных клеток в монослое образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).
Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к «слепым» пассажам. Необходимо провести не менее трех «слепых» пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.
Заражение культур тканей вирусами методы определения результативности заражения культур тканей
Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3
4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом