Современные подходы к криоконсервации ткани яичника
Согласно данным мировой статистики, по меньшей мере одна из 250 женщин репродуктивного возраста перенесла онкологическое заболевание. К счастью, в настоящее время у более 90% пациенток с такой нозологией удается добиться долгосрочной выживаемости. Тем не менее, применяемые у данного контингента больных методики лечения сопряжены с риском резкого снижения фертильности и развития бесплодия. Большинство же женщин с анамнезом, отягощенным в плане онколопатологии, хотят сохранить репродуктивный потенциал и иметь генетически родственных детей.
В равной мере сохранение фертильности важно и для страдающих онкологическими заболеваниями девочек, поскольку для данной группы пациенток отсутствует возможность применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с целью получения ооцитов и/или эмбрионов. Показанием к сохранению фертильности также служит репродуктивное старение у женщин с наличием в семейном анамнезе преждевременного истощения яичников.
Идеальным решением проблем такого рода способны стать сохранение и восстановление эндокринной и репродуктивной функций яичника путем криоконсервации его ткани. Важное преимущество данной методики состоит в том, что нет необходимости откладывать лечение основного онкологического заболевания (с применением гонадотоксических препаратов и/или лучевой терапии), так как репродуктивный потенциал женщины сохраняется.
Кроме того, применение криоконсервации овариальной ткани устраняет потребность в стимуляции овуляции, также на момент забора биологического материала отсутствует необходимость в наличии партнера – донора спермы. Данный способ сохранения фертильности сохраняет шансы на восстановление репродуктивной и эндокринной функций организма без проведения гормонозаместительной терапии и позволяет при последующей аутотрансплантации избежать применения иммуносупрессивных препаратов.
Криоконсервация ткани яичников является достойной альтернативой криоконсервации ооцитов и/или эмбрионов (особенно у девочек). Известно, что примордиальные фолликулы характеризуются большей, по сравнению со зрелыми ооцитами, резистентностью к повреждениям, возможным при криоконсервации.
Ткань яичника может быть выделена и криоконсервирована как при лапаротомическом оперативном вмешательстве, так и при лапароскопическом. Также возможно взятие нескольких биопсий ткани яичника. При частичной или полной (одно- или двусторонней) оофорэктомии проводится последующая криоконсервация в виде: 1) целого яичника с сосудистой ножкой, 2) полос кортикального слоя, 3) фрагментов и 4) изолированных примордиальных фолликулов.
По завершении терапии основного онкологического заболевания и при наступлении ремиссии возможна орто- или гетеротопическая аутотрансплантация пациентке ткани яичника. Последняя также может выступать в качестве источника фолликулов для дозревания in vitro.
Преимуществом ортотопической трансплантации целого органа является устранение ишемического повреждения ткани яичника; кроме того, в данной ситуации сохраняется вероятность наступления спонтанной беременности. В свою очередь, гетеротопическая трансплантация сопровождается повышенным риском ишемического повреждения; наступление беременности при использовании указанного способа возможно лишь при применении ВРТ.
К настоящему времени разработан ряд методик криоконсервации ткани яичников. Для этого используются специальное оборудование, среды для витрификации и разморозки яичниковой ткани, криохранилища.
Маркеры жизнеспособности показывают, что менее 50% ооцитов человека переносят протокол медленного замораживания и размораживания, являющийся стандартным при криоконсервации яичниковой ткани (первые наблюдения проводились у овец).
Работы Kagawa и др. продемонстрировали, что по сравнению с медленным замораживанием использование витрификации дает лучшие результаты (хотя долгосрочные наблюдения в отношении состояния потомства, рожденного после пересадки человеческой овариальной ткани, пока отсутствуют). Пропорция выживших после витрификации ооцитов при исследовании была близка к таковой в контрольных образцах свежей яичниковой ткани. Этот факт позволяет предположить возможность получения лучших результатов при использовании витрификации по сравнению с медленным замораживанием, хотя для подтверждения данного обстоятельства все же требуются долгосрочные исследования.
Наряду с обычными рисками, сопряженными с хирургическими вмешательствами, при криоконсервации присутствует опасность попадания клеток злокачественной опухоли в организм после аутотрансплантации, вследствие чего применение данной методики при раке яичников недопустимо. Возможной альтернативой для указанной группы пациенток является выделение интактных Граафовых пузырьков или преантральных фолликулов из криоконсервированной ткани яичников с последующей аутотрансплантацией; тем не менее, выделение фолликулов с применением как механических, так и ферментных методов является весьма трудоемким процессом.
Вопрос безопасности использования криоконсервированной ткани яичников у женщин с эстрогензависимыми опухолями остается открытым. В любом случае, при практическом применении данной методики (особенно при наличии метастазов) следует соблюдать максимальную осторожность. Тем не менее, с момента внедрения аутотрансплантации ткани яичников в клиническую практику случаев ассоциированного с трансплантатом рецидива онкологических заболеваний не отмечено.
В ближайшие несколько лет методики сохранения фертильности посредством криоконсервации ткани яичников будут активно совершенствоваться. Способы получения зрелых фолликулов для экстракорпорального оплодотворения являются предметом активного изучения. Хотя исследования по использованию примордиальных фолликулов являются отдаленной целью ученых, в настоящее время все же достигнут определенный прогресс в отношении трехмерного культивирования вторичных фолликулов. При этом отмечено, что давление и плотность тканей могут входить в число факторов, влияющих на их созревание. Инновации в хирургии и достижения в области тканевой инженерии способны в скором будущем обеспечить лучшую приживаемость трансплантатов яичника и снизить потерю примордиальных фолликулов при ишемическом повреждении.
Таким образом, на сегодняшний день криоконсервация ткани яичников рассматривается в качестве готового к клиническому применению способа сохранения фертильности у большинства страдающих онкологическими заболеваниями женщин репродуктивного возраста.
Редакция благодарит Клинику Репродукции Человека АльтраВита ООО «ЭКО Центр» (Москва) за предоставленные материалы
Рис. 1. Схематическое изображение микроскопического строения яичника: 1 – примордиальные фолликулы; 2 – преантральные фолликулы; 3 – строма яичника; 4 – антральный фолликул; 5 – атретический фолликул; 6 – преовуляторный фолликул; 7 – овуляция; 8 – формирующееся желтое тело; 9 – зрелое желтое тело; 10 – покровный эпителий; 11 – беловатое тело; 12 – кровеносные сосуды в воротах яичника
Рис. 2. Различные стадии развития фолликула яичника: а – примордиальный фолликул; б – преантральный фолликул; в – антральный фолликул; г – преовуляторный фолликул (1 – ооцит, 2 – гранулезные клетки; 3 – базальная мембрана; 4 – текаклетки)
Эффективность криоконсервации тканей яичника
Заморозка тканей яичников с их последующей трансплантацией является одной из немногих возможностей для женщин, страдающих онкологическими заболеваниями, впоследствии иметь генетически близких им детей. Многие девушки и женщины, которые были диагностированы с раком, теперь имеют реальную надежду на восстановление своей фертильности – в то время как лечение заболевания может привести к бесплодию, повреждая функционирование яичников, удаление, замораживание, хранение и последующая трансплантация тканей яичников позволит таким женщинам иметь детей в будущем, однако, эффективность и безопасность данного метода должна быть детальнее изучена, говорят ученые.
На мой взгляд, даже если шанс один на 100, то все равно есть смысл попытаться, но не суть. Датские ученые провели исследование, которое показало, что почти трети женщин, которые наблюдались в течение 10 лет после процедуры, удалось родить, по крайней мере, одного ребенка. Изучив 53 трансплантации тканей яичников среди 41 датской женщины, ученые установили, что шансы на рождение детей сохраняются даже 10 лет спустя после удаления тканей. Средний возраст женщин на момент процедуры заморозки тканей яичников составил 29,8 лет, а средний возраст, когда была проведена первая трансплантация – 33 года. Из 41 женщины 32 впоследствии пожелали забеременеть, и в 10 случаях (у 31%) это получилось. В целом, на свет появились 14 детей, из которых 8 были зачаты естественным способом, а 6 – при помощи ЭКО.
Один к трем – это шансы, сравнимые с общим уровнем эффективности одной процедуры ЭКО. Десятки миллионов женщин во всем мире такие шансы родить ребенка вполне устраивают. Так что для тех, кто раздумывает, нужно ли замораживать ткани яичника, чтобы впоследствии иметь возможность стать матерью, ответ, на мой взгляд, однозначный – стоит.
Криоконсервация ткани яичника — Ovarian tissue cryopreservation
Криоконсервация ткани яичника является криоконсервация ткани яичник женщины.
Показания
Криоконсервация тканей яичников представляет интерес для женщин, желающих сохранение плодородия за пределами естественного предела или чей репродуктивный потенциал находится под угрозой из-за лечения рака, [1] например, при гематологических злокачественных новообразованиях или раке груди. [2] Его можно проводить у девочек препубертатного возраста, подверженных риску преждевременная недостаточность яичников, и эта процедура столь же осуществима и безопасна, как и сопоставимые оперативные процедуры у детей. [3]
Процедура
Процедура заключается в том, чтобы взять часть яичника и провести медленное замораживание перед тем, как поместить его в жидкий азот на время терапии. Затем ткань может быть разморожена и имплантирована рядом с маточным слоем, либо ортотопическим (в естественном месте), либо гетеротопическим (на брюшной стенке), [2] где он начинает производить новые яйца, обеспечивая нормальное зачатие. [4] Исследование 60 процедур показало, что забор ткани яичников безопасен. [2] Исследование также пришло к выводу, что культивирование размороженной ткани яичников плода в течение нескольких дней перед трансплантацией может быть полезным для развития фолликулов. [5]
Полоски кортикальной ткани яичников также можно заморозить, но их необходимо повторно имплантировать в организм, чтобы инкапсулированные незрелые фолликулы завершили свое созревание. Созревание in vitro было выполнено экспериментально, но этот метод еще не доступен клинически. [6] С помощью этого метода криоконсервированная ткань яичника может быть использована для создания ооцитов, которые могут непосредственно подвергаться экстракорпоральное оплодотворение. [6]
Возможна беременность
Женщины, страдающие злокачественными заболеваниями, которые проходят лечение с использованием облучения или гонадотоксических препаратов, имеют повышенную вероятность потери функции яичников, что приводит к бесплодию. Кортикальная ткань яичников содержит большую часть пула фолликулов яичников. После того, как пациент излечится от злокачественного заболевания, ткань можно разморозить, а затем пересадить для восстановления функции яичников. После аутотрансплантации у пациенток возобновилась активность яичников, включая первую менструацию на 14-25 неделе и развитие фолликулов на 8-21 неделе. [7]
Риск рецидива рака
При аутотрансплантации криоконсервированной ткани яичника выжившим после рака метастазы неоднократно обнаруживались в ткани яичника, полученной от пациентов с лейкемия, а также у одного пациента с Саркома Юинга. [8] Аутотрансплантация ткани яичника может представлять риск рецидива рака у пациентов с колоректальный, желудочный и рак эндометрия. [8] Однако метастазов в ткани яичников от лимфома и рак молочной железы Пациенты, перенесшие криоконсервацию тканей яичников. [8]
История
Первая пересадка яичников с криоконсервированной тканью яичников была проведена доктором Кутлуком Октаем в 1999 году. В сентябре 2004 года. Проф Доннез из Лувена в Бельгии сообщил о первых успешных родах яичников из-за медленного или контролируемого замораживания ткани яичника. В 1997 году образцы коры яичников были взяты у женщины с лимфомой Ходжкина и подвергнуты криоконсервации в морозильнике (Planer, Великобритания) и сохранены в жидком азоте. Химиотерапия была начата и после того, как у пациентки возникла преждевременная недостаточность яичников. В 2003 году после замораживания-оттаивания была проведена ортотопическая аутотрансплантация кортикальной ткани яичников с помощью лапароскопии, и через пять месяцев после реимплантации признаки восстановления свидетельствовали о восстановлении регулярных овуляторных циклов. Через одиннадцать месяцев после повторной имплантации была подтверждена жизнеспособная внутриутробная беременность, в результате которой родился живой ребенок — ТамараОднако вокруг претензии Лувена было много споров. Коллеги опровергают утверждения Доннеса, заявляя, что не уверены, действительно ли мать была бесплодной. [9]
Читайте также: Как сшить чехол для ключей своими руками из ткани
Первые роды после трансплантации ткани яичника, которая хранилась в центральном криобанке после ночной транспортировки, были достигнуты центрами Фертипротект network in Germany 2011. Это продемонстрировало, что ткань яичников может храниться централизованно в специализированных центрах. [10] [11]
Криоконсервация ткани яичника в мире 2021 год
ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ
В последние годы увеличилась выживаемость онкологических больных, однако успехи в лечении нередко приводят к бесплодию у молодых пациентов. В случаях, когда нет возможности избежать токсического действия на репродуктивные органы – криоконсервация ткани яичника до начала лечения может помочь сохранить фертильность таких пациентов. Хорошо известно, что яичник млекопитающих содержит огромный запас покоящихся яйцеклеток. Большое количество этих незрелых фолликулов создает потенциальный источник зрелых яйцеклеток для оплодотворения. Для того чтобы использовать женские половые клетки из ткани яичников, очень важно сохранить эту ткань до того как ооциты начнут подвергаться дегенерации вследствие токсического лечения. Криоконсервация и трансплантация ткани яичников – два новых метода сохранения фертильности, особенно у молодых онкологических больных. Если эти техники будут внедрены в клиническую практику, они должны быть безопасными, легко воспроизводимыми и результативными. Успехи современной криобиологии дали возможность сохранения ткани яичников с минимальной потерей жизнеспособности. Если токсические воздействия химиолучевой терапии не удается избежать, врачи должны знать о способах сохранения фертильности и предлагать их пациентам. Возможность иметь генетически родственного ребенка очень важна для пациентов, излеченных от рака.
Анализ структуры заболеваемости злокачественными новообразованиями за последние годы показал, что среди всех онкологических диагнозов около 8% приходится на пациентов моложе 40 лет, включая детей [1] . Только в США каждый год вновь выявляется почти 70 000 больных злокачественными новообразованиями в возрасте от 15 до 39 лет. [2] . В Российской Федерации ежегодно вновь выявляется более 400 тыс. случаев злокачественных опухолей, в том числе более половины – у пациентов женского пола и около 3 тыс. у детей [1] . Смертность от онкозаболеваний за последние 3 года снизилась, а ожидаемая продолжительность жизни увеличилась [1] . В основном это происходит благодаря развитию новых методов диагностики и лечения. Однако более 70% пациентов будут подвергаться комплексной химио- и лучевой терапии, которая может привести к бесплодию. Именно эти женщины и девочки должны быть потенциальными кандидатами для сохранения репродуктивной функции.
По данным зарубежной литературы, одна из 250 женщин репродуктивного возраста ранее получала противоопухолевое лечение и сегодня около 90% из них с большой долей вероятности доживают до старости [3] . Однако в результате лечения также высока вероятность частичной или полной потери фертильности, вследствие высокой чувствительности ткани яичников к цитотоксическому противоопухолевому лечению [4–6] , но большинство вылеченных женщин хотели бы иметь собственных детей в будущем [7, 8] .
Существует несколько основных возможностей для сохранения репродуктивной функции онкологических больных женского пола: заморозка (криоконсервация) яйцеклеток, эмбрионов или ткани яичников [3, 9–11] . В нашей стране уже накоплен некоторой опыт криоконсервации гамет, эмбрионов не ожидают побочных эффектов лечения, а сохранение репродуктивной функции также важно и для них. В силу своего возраста такие пациенты не могут воспользоваться услугами репродуктологов и вспомогательными репродуктивными технологиями (ВРТ) чтобы заморозить яйцеклетки или эмбрионы. Для них остается только одна возможность сохранения собственных гамет – криоконсервация ткани яичников (КТЯ) (фрагментов кортикального слоя, изолированных фолликулов или целого яичника) [6, 16, 17] . Основной целью этой стратегии является последующая аутотрансплантация ткани яичника (после разморозки) [18, 19] . Выбор метода сохранения наследственного материала у онкологических больных зависит от многих параметров: возраста пациента, типа опухоли, планируемого лечения и его продолжительности, а также от прогноза заболевания и наличия партнера. Основной целью криоконсервации ткани яичников, ее последующей трансплантации, а также выращивания фолликулов in vitro является сохранение фертильности у женщин, сталкивающихся с нарушением репродуктивной функции или преждевременным истощением яичников. Хотя метод КТЯ появился относительно недавно, он охарактеризовал себя как легкий, быстрый и недорогой.
Имеются неоспоримые преимущества КТЯ по сравнению с криоконсервацией яйцеклеток или эмбрионов. Во-первых, ткань яичника может быть получена без промедления, так как нет никакой необходимости в стимуляции яичников для получения зрелых яйцеклеток. Во-вторых, для данной процедуры не требуется наличие партнёра у женщины. В-третьих, можно сохранить большое количество гамет (примордиальных фолликулов). В-четвертых, нет необходимости откладывать начало лечения. Этот метод обладает преимуществами и в процессе восстановления репродуктивной и эндокринной функций, так как не требует гормональной терапии, а также применения иммунодепрессантов в процессе аутогенной трансплантации. Криоконсервация ткани яичников также является более надежной альтернативой заморозки яйцеклеток или эмбрионов, особенно для детей, страдающих онкологическими заболеваниями. Единственным недостатком замораживания ткани яичников является то, что процедура требует дополнительного хирургического вмешательства.
Эксплантация ткани яичников может производиться лапароскопически двумя разными способами. Первый способ – это удаление около 50% кортикального слоя одного яичника, второй способ – это множественные (5–10) биопсии кортикального слоя со средним размером биоптатов около 5 мм3. Следует избегать электрокоагуляции во время операции, которая приводит к деструкции фолликулов [20] . Альтернативным методом может служить овариэктомия. Однако ее можно рекомендовать только пациентам перед облучением малого таза, пересадкой костного мозга, высокодозной химиотерапией и в случае высокого риска повреждения яичников. Если шанс приобретения вторичной аменореи после лечения менее 50%, то рекомендована частичная овариэктомия.
Методы криоконсервации ткани яичников и оценка жизнеспособности фолликулов после криоконсервации
Ткань яичника человека может быть успешно заморожена и разморожена. Это подтверждают многочисленные эксперименты по оценке жизнеспособности и восстановлению функций ткани яичников после разморозки. Все подобные работы, начиная с 1996 г., были обобщены в обзоре, когда был опи- сан первый опыт КТЯ человека [21] .
Стандартным методом КТЯ для человека является медленная заморозка с использованием среды с добавлением сывороточного альбумина, пропандиола (ПД), диметилсульфоксида (ДМСО) и этиленгликоля (ЭГ) как классических криопротекторов в различных сочетаниях и концентрациях. ПД, ДМСО и ЭГ способны проникать через мембраны ооцитов и клеток стромы, они обеспечивают защиту как внутри, так и вокруг клеток. Эти проникающие криопротекторы часто используют в комбинации с непроникающими, такими как сахароза, глицерин или сывороточный альбумин человека [21–24] . Они защищают клетки посредством дегидратации, стабилизации липидного бислоя и белков, или за счет изменения свойств воды в непосредственной близости от мембран. Когда клетки фолликулов и ооциты испытывают воздействие моно- или дисахаридов, они реагируют осмотически потерей воды. Поскольку эти криопротекторы не проникают сквозь мембраны, клетки остаются сжатыми до тех пор, пока не произойдет уравновешивания. Хотя механизмы, отвечающие за защиту во время криоконсервации, полностью не ясны, все криопротекторы имеют ряд схожих свойств. Смешиваясь с водой, они снижают точку замерзания и повышают вязкость водных растворов, также уменьшают температуру льдообразо- вания в клетках или растворах.
Перед заморозкой кортикальный слой яичника толщиной 1–2 мм разрезают на фрагменты 5×5 мм и мельче и распределяют по индивидуальным пробиркам, которые медленно охлаждаются в программируемом замораживателе со скоростью от 1°С до 3°С/мин. до -7°С, далее со скоростью 0,3°С/мин. до -40°С и перекладываются в пары азота или жидкий азот (-196°С) для длительного хранения [24] . Медленная заморозка осуществляется в течение нескольких часов, поэтому существует риск повреж- дения клеток.
Несмотря на использование в клинической практике метода медленной КТЯ и наличия факта рождения первого ребенка после успешной ортотопической трансплантации медленно замороженной ткани яичника [22] , средняя выживаемость фолликулов с нормальной морфологией оставалась низкой. Также были обнаружены ультраструктурные изменения ооцитов под электронным микроскопом [25–27] .
Это связали с разрушающим действием кристаллов льда на ооциты и клетки стромы ткани яичника после медленной заморозки. Возможно, именно эти факторы приводили лишь к временному функционированию трансплантированных фрагментов и требовали дополнительных оперативных вмешательств по реплантации ткани яичников. Теоретически надо было значительно увеличить скорость заморозки, а значит увеличить концентрацию криопротектора и, следовательно, уменьшить время инкубации ткани яичника, чтобы избежать токсического эффекта. В результате многочисленных экспериментов был предложен новый метод заморозки – витрификация (vitrification), или прямое погружение биологического материала в жидкий азот. Этот метод является более простым в использовании, менее затратным и более эффективным.
Витрификация была впервые применена при криоконсервации ооцитов хомяка J. Critser с соавт. в 1986 г. [28] . Спустя 13 лет данный метод был использован для криоконсервации ткани яичника мышей [29] . В настоящее время он широко используется для заморозки ооцитов и ткани яичников человека и других млекопитающих. Многими авторами показано, что морфология фолликулов не изменяется после витрификации и размораживания, а также сохраняется жизнеспособность преантральных фол- ликулов [18, 30, 31] .
При витрификации заморозка осуществляется в несколько этапов с инкубацией кусочков ткани в высокой концентрации криопротекторов в течение нескольких минут и последующей быстрой заморозкой со скоростью 23000°С/мин. Такой метод позволяет избавиться от формирования разрушающих клетку кристаллов льда [30] . Однако необходимо добиться адекватного проникновения криопротекторов внутрь ткани через строму к яйцеклетке и при этом избежать их возможного токсического воздействия. На сегодняшний день существует множество протоколов витрификации. Значительные успехи в разработке метода витрификации тканей и оценке выживания преантральных фолликулов, выделенных ферментативно после витрификации и размораживания ткани яичников коров и человека, были получены группой японских ученых [32] . Основываясь на высокоэффективном методе витрификации яйцеклеток – Cryotop, учеными был разработан новый метод заморозки ткани яичника – Cryotissue. Для витрификации методом Cryotissue ткань яичника размером 10×10 мм инкубируют 25 мин. в питательной среде ТСМ-199 с добавлением ЭГ (7,5%), ДМСО (7,5%) и сыворотки (20%). Вторую инкубацию проводят в течение 15 мин. в той же среде без сыворотки с добавлением большего количества ЭГ (20%) и ДМСО (20%). Далее фрагменты ткани переносят на металлические пластины и погружают в жидкий азот для витрификации, то есть мгновенного замораживания, и хранения.
Читайте также: Фибриллярный белок роговой ткани
Данный протокол витрификации показал высокую выживаемость фолликулов у мышей, коров и человека. Не было найдено различий в жизнеспособности яйцеклеток, выделенных из свежей (88,2%) и замороженной/размороженной ткани яичников коров (89,3%) и человека (89,6%). Эти результаты доказывают высокую перспективность метода витри- фикации для клинического применения.
Используя вышеописанный метод Cryotissue с некоторой модификацией для витрификации ткани яичников черных японских коров с добавлением ДМСО и ЭГ в качестве криопротекторов, нами было показано, что первичные фолликулы коров остаются жизнеспособными сразу после размораживания (более 87%) (рис. 2). В нашей работе для длительного культивирования (28 дней) фрагментов замороженной/размороженной ткани яичников коров мы использовали среду ТСМ-199 с добавлением бычьего сывороточного альбумина, гипоксантина, инсулина, фолликулостимулирующего гормона и эпидермаль- ного фактора роста. Фрагменты ткани после разморозки измельчались скальпелем и погружались в 3D- матрикс, в роли которого использовали коллаген II типа. На протяжении длительного периода культи- вирования (28 дней) фрагментов ткани яичников бо- лее 85% фолликулов сохраняли жизнеспособность (рис. 3). Несколько ниже была жизнеспособность фолликулов онкологических больных после витри- фикации и размораживания (более 83%) [13] .
В сравнении с медленным замораживанием витрификация имеет несколько преимуществ. Вопервых, исключается риск образования внеклеточных или внутриклеточных кристаллов льда, которые могут повреждать клетку. Во-вторых, во время витрификации клетки теряют воду или обезвоживаются до того как будут охлаждены. При медленном замораживании обезвоживание клетки запускается при инициации внеклеточной кристаллизации в результате повышения концентрации соли во внеклеточном пространстве. Во время витрификации такого не происходит, следовательно, отсутствует риск возникновения «эффекта растворения». В-третьих, во время медленного замораживания клетки охлаждаются в течение длительного времени сначала до температуры -7°C, а потом до -40°С. Поскольку мейотическое и митотическое веретёна деления чувствительны к изменению температуры и особенно чувствительны к охлаждению, замораживание этих структур может причинить необратимый вред и привести к анеуплоидии. При витрификации охлаждение происходит очень быстро и, следовательно, возможный ущерб, причиняемый охлаждением, практически исключается.
После криоконсервации с использованием метода витрификации или медленной заморозки фрагменты ткани яичника могут храниться длительное время в жидком азоте. Перед их дальнейшем использованием ткань яичников подвергают быстрой разморозке в растворе, содержащем сахарозу.
Трансплантация ткани яичника
В настоящее время основным методом использования замороженной и размороженной ткани яичника является аутотрансплантация, или реплантация. Существуют две основные разновидности данной процедуры. Первая заключается в ортотопической (перитонеальное пространство, яичник) трансплантации ткани яичников, вторая – в гетеротопическом введении (под кожу предплечья или брюшной стенки, под капсулу почки) фрагментов ткани яичника. Несмотря на обнадеживающие результаты применения криоконсервации и трансплантации овариальной ткани с целью сохранения фертильности у женщин с онкологическими заболеваниями, применение этих методик сопряжено с некоторыми проблемами. Первая связана с риском переноса злокачественных клеток, а другая – с ишемией ткани яичника. Чтобы избежать обратного переноса опухолевых клеток пациенту, можно изолировать фолликулы из ткани яичника и выращивать их in vitro [13, 33, 34] . Решение второй проблемы предполагает заморозку целого яичника с последующей трансплантацией с сосудами, что позволит избежать потери фолликулов из-за ишемии и отсутствия реваскуляризации [18–20] .
Ортотопическая трансплантация
Впервые R. Gosden с соавт. продемонстрировали спонтанную беременность у овцы после аутотрансплантации замороженной и размороженной ткани яичника в 1994 г. [35] . У человека такая спонтанная беременность наступила в 2003 г. и закончилась рождением девочки Тамары в 2004 г. [22] . У пациентки в 25 лет (1997 г.) была обнаружена лимфома Ходжкина IV ст. До начала лечения ей было предложено заморозить ткань яичника. Лапароскопически была выполнена биопсия левого яичника размером около 1,2–1,5 см в длину и 5 мм в ширину и медленно заморожена с использованием ДМСО [35] . Пациентка прошла лечение (MOPP/ABV/38 Гр) и в 2003 г. 35 фрагментов ткани яичников были реплантированы под кортикальный слой атрофированного яичника, когда у пациентки наблюдалась полная аменорея. С 5-го по 9-й мес. после трансплантации ультразвуковые исследования ежемесячно показывали развитие доминантного фолликула, также наблюдались менструальные кровотечения. Через 11 мес. после операции была зафиксирована беременность, которая завершилась рождением девочки весом 3,720 кг на 39 нед. гестации. Это был первый в мире ребенок, рожденный после ортотопической трансплантации криоконсервированной ткани яичника. К маю 2008 г. почти 30 женщинам была успешно ортотопически трансплантирована ткань яичника. В результате этого в Европе и Израиле родились 6 детей [24] . К сентябрю 2010 г. после трансплантации ткани яичников у 10 женщин, ранее получавших лечение по поводу различных заболеваний, родились уже 13 здоровых детей (8 девочек и 5 мальчиков) [36] . В 2011 г. родилась еще одна девочка у больной с серповидно-клеточной анемией после пересадки кортикального слоя яичника от генетически не родственной сестры [37] (табл.).
Большинство беременных женщин (6/10, 60%) не получали какого-либо лечения до момента забора и криоконсервации ткани яичников. Две из 10 пациенток (20%) получали химиотерапию в полном режиме (ABVDMINE/VACOP, MINE-ESHAP) до того как их ткань яичника была заморожена. Среди этих двух пациенток одна получила только один курс химиотерапии (ABVD), а другая была пролечена циклофосфамидом в суммарной дозе 2,5 г. У обеих пациенток было гистологически подтверждено наличие большого числа примордиальных фолликулов в образцах ткани яичников. К 2013 г. было выполнено около 60 ортотопических трансплантаций криоконсервированной ткани яичника и описаны случаи рождения 24 детей [38] . В 2014 г. насчитывалось уже 30 случаев рождения детей [39] . Тот факт, что большинство женщин смогли забеременеть самостоятельно после трансплантации медленно замороженной/размороженной ткани яичника, является хорошим аргументом в пользу использования ортотопической реплантации в клинической практике. В последнее время появляются статьи, в которых оценивают гормональный статус и описывают длительные наблюдения за женщинами после аутотрансплантации яичников, хотя первая трансплантация ткани яичников была проведена только в 2003 г.
Для того чтобы оценить функциональную активность ткани яичника после трансплантации S. Silber с соавт. с 2005 по 2010 гг. проделали ряд операций по пересадке свежей ткани яичника девятерым монозиготным близнецам с преждевременным истощением яичников [40] . В результате 14 спонтанных беременностей были зарегистрированы и 8 детей были рождены, а одна женщина на момент написания статьи была беременна двойней [41] . Другую группу составили 16 онкологических больных, две из которых были бесплодны на момент забора ткани яичников. Показано, что во многих случаях менструация начиналась в течение 2–6 мес. (в среднем 4 мес.) после трансплантации ткани яичников и продолжалась от 1 до 6 лет у разных женщин без вспомогательного медикаментозного лечения [42, 43] . Интервал времени от аутотрансплантации до наступления беременности (в естественном или индуцированном IVF цикле) колебался от 6 до 25 мес. [37] . Суммарно было получено сравнимое количество беременностей после пересадки свежей и замороженной ткани яичников, однако функциональная активность криоконсервированных фрагментов была короче [41] , а эндокринная функция у большинства женщин после пересадки криоконсервированной ткани яичника сохранялась в течение одного или двух лет. Активность яичников после трансплантации не замороженной ткани составила более 4 лет.
Гетеротопическая трансплантация
Результаты экспериментальных и клинических исследований показывают, что гетеротопическая трансплантация сопровождается меньшим числом наступления беременностей по сравнению с ортотопической. Однако существует перспектива одновременной пересадки ткани яичника в несколько точек, то есть смешанной трансплантации. Было показано, что после гетеротопической трансплантации ткани яичника восстанавливается менструальный цикл и отмечается незначительный рост и созревание фолликулов. Однако на сегодняшний день не было описано ни одного случая клинической беременности после переноса в полость матки эмбрионов, полученных из ооцитов после пункции фолликулов из гетеротопически расположенного трансплантата [42–44] .
В зарубежной литературе представлен лишь один случай биохимической беременности у пациентки после гетеротопической трансплантации ткани яичников [45] . Во всех остальных работах, описывающих такую трансплантацию, говорится о развитии фолликулов, однако размер этих фолликулов всегда меньше 15 мм [43, 44] . Предполагают, что ограниченный рост фолликулов и нарушение процесса созревания и последующего оплодотворения ооцитов связаны с атипическим расположением трансплантата, а именно с негативным воздействием более низкой температуры поверхности кожи, повышенным давлением, а также с механическим воздействием [17] .
Недавно 28-летней пациентке с лимфомой Ходжкина через 2,5 года после пересадки костного мозга в нижнюю треть брюшной стенки была реплантирована ранее криокосервированная ткань яичника [46] . Через 2 мес. после трансплантации было обнаружено развитие фолликулов. Пациентка забеременела спонтанно 4 раза на протяжении 5 лет и родила троих детей. Хотя яичник оставался истощенным in situ, была показана активность единичных фолликулов одновременно с активностью фолликулов трансплантата. Механизм спонтанного восстановления репродуктивной функции с последующей нормальной беременностью после гетеротопической трансплантации ткани яичника пока не понятен и должен быть исследован детально. Дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы изучить истинное происхождение беременностей после гетеротопической трансплантации.
В России, в городском онкологическом диспансере г. Санкт-Петербурга проводилось исследование по аутотрансплантации размороженной ткани яичника. Совместно с клиникой «АВА-ПЕТЕР» разработана программа сохранения фертильности для онкологических пациенток репродуктивного возраста. В 2008 г. было выполнено 12 гетеротопических аутотрансплантаций. В 7 случаях пациентки наблюдались у репродуктолога по поводу мониторинга фолликулогенеза и планирования беременности. В одном случае была получена зрелая яйцеклетка [12] .
Сравнивая результаты ортотопической и гетеротопической трансплантаций, важно отметить, что после первой в фазу роста вступает большее количество фолликулов. Также большее количество зрелых ооцитов способно к оплодотворению [11, 42] . Все описанные случаи удачных беременностей произошли после трансплантации ткани яичников непосредственно в яичник или в малый таз около яичника [36] . Также ортотопическая трансплантация не нарушает концепции естественного оплодотворения и остается более предпочтительной, а гетеротопическая может быть оправдана для пациентов после овариэктомии или массивного облучения органов малого таза, а также, если у пациентки затруднен доступ к яичникам или передней брюшной стенке.
Читайте также: Аппликация из сыпучей ткани
Криоконсервация и реплантация целого яичника
Многие ученые оценивают работу яичника после пересадки свежей или криоконсервированный ткани яичника как временную, поскольку функция органа восстанавливается на короткий срок. Основной причиной угасания функциональной активности яичника является ишемия, которая возникает в первые часы после трансплантанции и способна привести к гибели более трети примордиальных фолликулов [22, 47, 48] . Именно поэтому для восстановления репродуктивного потенциала крайне важно сокращение временного интервала ишемии и ускорение реваскуляризации трансплантатов. В этой связи была предложена трансплантация ткани яичников на сосудистой ножке в качестве наиболее логичного подхода по сравнению с трансплантацией кортикального слоя яичников. Исследованием и развитием технологии криоконсервации целых органов, так же как и хирургическими методами аутотрансплантации всего яичника на сосудистой ножке активно занимаются разные группы учёных [49–53] . Как было показано на животных, трансплантация целого интактного яичника с микрохирургическим анастомозированием сосудов, несмотря на техническую сложность этой процедуры, является единственным решением проблемы, так как она обеспечивает непосредственное кровоснабжение ткани яичников после пересадки, минимизируя опасность возникновения ишемии. Однако эта процедура гораздо сложнее и более рискованная, по сравнению с реплантацией фрагментов ткани яичников [50–52] . Также требует отработки и дальнейших исследований заморозка целого яичника.
Процедура криоконсервации целого яичника была изучена на модели яичника овец [50] . Для этого первоначально через артерию яичника в течение 3 мин. проводили перфузию раствором, содержащим 10% ДМСО. После этого яичник помещали в пластиковый флакон с холодным криопротектором и замораживали в специальной аппаратуре с использованием технологии направленного замерзания, что позволило криоконсервировать орган очень медленно, со скоростью охлаждения 0,3°С/мин.
Аутотрансплантацию проводили к сосудистой ножке другого яичника той же овцы через несколько дней после резекции. Перед этим, из размороженного яичника через артерию вымывали криопротектор с помощью 10 мл среды с HEPES-TALP, содержащей 0,5 моль сахарозы и 10 МЕ/мл гепарина. Далее под микроскопом проводили сшивание конец в конец сосудистых анастомозов вены и артерии. Кровоток проверяли путем наблюдения пульсации в яичниковой артерии и венозного возврата, который приводит к нормальному вздутию яичниковой вены.
Несколько лет назад впервые был описан протокол криоконсервации интактного яичника человека и показана высокая выживаемость фолликулов (75,1%) [53] . После процедуры размораживания орган имел нормальную гистологическую структуру, также отмечалось наличие сохранных мелких сосудов и неизмененных жизнеспособных клеток стромы. Методом трансмиссионной электронной микроскопии было подтверждено, что большинство примордиальных фолликулов (96,7%) были интактными после криоконсервации [54] . Используя метод иммуногистохимии по оценке активации внутриклеточной каспазы-3, не наблюдалось никакой индукции апоптоза в фолликулярных клетках. Доля активных каспаза-3-позитивных эндотелиальных клеток составила менее 1%. Впоследствии были описаны и другие техники успешной трансплантации целого яичника [55, 56] .
Все случаи сопровождались пересадкой с микрохирургической техникой. Успешная аллогенная трансплантация целого яичника была проведена на паре монозиготных близнецов. Одна из сестер имела нормальную функцию яичников и родила двоих детей, у второй сестры было преждевременное истощение фолликулов. После пересадки ей целого яичника от сестры на 101 день возобновился менструальный цикл, а через 11 регулярных циклов была выявлена спонтанная беременность, в результате которой на 40-й неделе гестации родилась здоровая девочка [55] .
На сегодняшний день такие работы единичные, так как они требуют участия высококвалифицированных специалистов в области сосудистой хирургии и трансплантологии. Учитывая персонализированный подход к каждому больному и особенности течения заболевания, а также желание пациента иметь собственных детей, в исключительных случаях можно использовать данную процедуру в клинической практике.
Изоляция и культивирование фолликулов in vitro
В некоторых случаях существует опасность попадания клеток злокачественной опухоли в организм после аутотрансплантации замороженной и размороженной ткани яичника. Яичники чаще поражаются метастазами при гемобластозах, опухолях органов желудочно-кишечного тракта и раке молочной железы. Возможной альтернативой для указанной группы пациенток является выделение интактных Граафовых пузырьков или преантральных фолликулов из криоконсервированной ткани яичников с последующей их аутотрансплантацией. K. Окtay с соавт. в 1997 г. предложили выделять примордиальные фолликулы из ткани яичников механическим способом при помощи микродиссекции с последующей ферментативной обработкой ткани яичников, то есть путем инкубации мелких фрагментов ткани с коллагеназой или актиназой, и замораживать или выращивать их in vitro. Было показано, что в результате такого выделения можно получить жизнеспособные примордиальные фолликулы из свежей или замороженной ткани яичников [57] . Однако сама процедура выделения фолликулов остается достаточно сложной, а механическая и ферментативная обработка повреждают стромальные клетки и нарушают межклеточные взаимодействия между ооцитом и окружающими его фолликулярными клетками. Для изучения фолликулогенеза и культивирования ооцитов было предложено множество различных моделей на животных [31, 33, 58–61] . Для этого фолликулы или фрагменты ткани яичников погружались в 3D-матрикс, в роли которого использовали коллаген II типа, альгинатный гель, или выращивались на специальных мембранах. Однако на сегодняшний день еще не было получено зрелой яйцеклетки человека, выращенной in vitro из примордиального фолликула, хотя работы в этом направлении ведутся и имеют определенный успех [33, 58, 61] .
На основании ряда современных исследований была предложена поэтапная многостадийная система развития фолликулов [60] . На первом этапе культивируют маленькие фрагменты ткани яичника, на втором механически выделяют преантральные фолликулы и выращивают их отдельно, далее из развивающихся антральных фолликулов выделяют «кумулюс-ооцит» комплексы и культивируют их на специальной мембране или в 3D-системе, после чего собранные ооциты подвергают окончательному дозреванию in vitro (IVM). Данная система, в теории, позволяет получить зрелый ооцит, однако тонкий подбор ростовых факторов, гормонов и медиаторов необходим на каждом отдельном этапе. Также требуется детальная отработка методов выделения единичных фолликулов и подбор физических параметров культивирования ранних фолликулов. Роль многих факторов фолликулогенеза у человека еще предстоит оценить и изучить. Главная задача исследователей – это научиться активировать пул покоящихся примордиальных фолликулов in vitro, а также выявить эндокринные, паракринные и аутокринные факторы, необходимые для роста и созревания первичных фолликулов, что является ключевым доступом к неограниченному источнику зрелых ооцитов для их биомедицинского использования.
Будущие перспективы метода культивирования криоконсервированных фрагментов овариальной ткани in vitro связывают с внедрением в лабораторную практику новых трехмерных многостадийных систем, воссоздающих естественные условия, в которых из ткани яичника можно будет выращивать зрелые яйцеклетки человека.
Трансплантация единичных фолликулов
Процедура трансплантации единичных фолликулов еще не получила широкого использования в силу своей малоизученности. Однако недавно была проведена кратковременная ксенотрансплантация единичных фолликулов и суспензии CD34+-клеток стромы и эндотелия кортикального слоя яичника человека иммунодефицитным мышам. Было продемонстрировано, что для успешного роста сосудов и реваскуляризации, а также для формирования овариоподобной стромы после пересадки клеточных элементов, необходимо ко-трансплантировать CD34+-клетки, то есть клетки на ранних этапах дифференцировки [62] .
Развитие технологий клеточной трансплантации, вероятно, позволит в будущем перейти от хирургического вмешательства к миниинвазивным операциям, что должно привести к широкому внедрению метода реплантации фолликулов в клиническую практику.
Выбор кандидатов для сохранения фертильности методом криоконсервации ткани яичника должен основываться на возрасте пациента, типе злокачественного образования, методе лечения и исходить из ожидаемого прогноза заболевания. Большую группу пациентов могут составить молодые женщины и девочки, лечение которых требует трансплантации костного мозга, перед которой используют алкилирующие препараты в высоких концентрациях, что в большинстве случаев приводит к стерилизации. На сегодняшний день нет сообщений о рецидиве рака в результате трансплантации ткани яичника. Поэтому для криоконсервации ткани яичников могут подходить все женщины репродуктивного возраста, а также дети, которым планируется проводить заведомо гонадотоксическое лечение. Реплантацию размороженной ткани яичников надо проводить после гистологического заключения об отсутствии злокачественных клеток в образцах. Даже при наличии метастатического поражения яичников можно выделять единичные фолликулы и выращивать их in vitro. Анализ современной литературы показал, что наиболее удобным методом забора ткани яичников является лапароскопия, простым и более дешевым методом заморозки ткани яичников является витрификация, а наиболее естественным способом восстановления репродуктивной функции – ортотопическая аутотрансплантация.
Методика замораживания ткани яичника человека является относительно новой, однако успехи криоконсервации и клинического применения методов трансплантации замороженной и размороженной ткани, а также многочисленные факты рождения здоровых детей делают эту процедуру многообещающей. Развитие новых методов поэтапного культивирования незрелых фолликулов in vitro, полученных из ткани яичников млекопитающих после заморозки и разморозки, также является хорошим аргументом в пользу использования методики КТЯ в клинической практике и показывает высокую перспективность внедрения этого метода [31, 58–61] .
С другой стороны, учитывая низкий уровень информированности пациентов о потере репродуктивной функции вследствие проведенного комплексного лечения, а также территориальную удаленность регионов и онкологическую настороженность медицинского персонала, бесплодных женщин и девочек в нашей стране становится с каждым годом все больше и больше. Хорошо известно, что более чем у одной трети женщин после применения химио- или радиотерапии обнаруживается аменорея [63] . Надо полагать, что, зная возможные негативные последствия предполагаемой комплексной терапии, мы не вправе не информировать пациентов о современных возможностях сохранения репродуктивной функции. Наша задача объединить усилия врачей-онкологов и репродуктологов и информировать пациентов детородного возраста и родителей девочек препубертатного возраста обо всех возможных негативных последствиях лечения, рассказать о процедуре криоконсервации ткани яичников как альтернативном методе сохранения фертильности для большинства онкологических пациенток, а также предоставить больному возможность самостоятельного выбора. Все пациентки, согласившиеся на процедуру эксплантации ткани яичников, должны знать, что метод криоконсервации этой ткани в настоящее время не является широко распространенным, но эффективным для сохранения репродуктивной функции у большинства молодых онкологических больных. Каждая женщина должна быть проинформирована об этом и при необходимости подписать информированное согласие на данную процедуру. Следует отметить, что для широкого внедрения метода КТЯ в медицинскую практику требуется создание высокоспециализированных центров сохранения фертильности на базах онкологических клиник и централизованных криобанков, а также тесного мультидисциплинарного сотрудничества между различными специалистами в области онкологии, хирургии, репродукции и фундаментальных исследований.
Современная наука развивается стремительными темпами и что сегодня является мечтой, завтра – это объективная реальность.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом