Получение культуры каллуса, суспензионных культур и одиночных клеток.
Основным типом поверхностно культивируемых растительных клеток является каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений.
Классическая каллусная культура, выращиваемая поверхностным способом, (первичный каллус) представляет собой аморфную, рыхлую массу сильно оводненных дедифференцированных клеток, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. Такая рыхлая каллусная ткань легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и поэтому может быть использована для получения суспензионной культуры. Под влиянием фитогормонов клетки первичного каллуса могут претерпевать процессы вторичной (обратно) дифференцировки и органогенеза, что существенно сказывается на внешнем виде и консистенции (плотности) каллуса. Так каллусная культура средней плотности уже характеризуется хорошо выраженными меристематическими очагами. В ней легко инициируются процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов, которые могут дать начало целым растениям.
Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им неограниченный рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе органогенеза, т.е. не являются тотипотентными. Каллусные клетки в культуре иногда могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов. Потеря гормонозависимости приводит к тому, что такие клетки не могут претерпевать вторичную дифференцировку, что не позволяет использовать такие клеточные культуры для получения вторичных метаболитов
В естественных условиях каллусная ткань может возникнуть у растений в результате механических повреждений. Она функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса.
Методика искусственного получения каллусной культуры у растений хорошо отработана и не вызывает затруднений. Для того чтобы получить культуру ткани, из любой части растения (стебель, лист, элемента цветка, корень и т.д.), вычленяют эксплантат (кусочек ткани размером 0,5 — 1,0 см), стерилизуют его и помещают на питательную среду определенного состава.
Важнейшую роль в индуцировании каллусообразования на эксплантатах является наличие в питательных средах специфических фитогормонов – ауксинов и цитокининов. Функции этих двух групп фитогормонов в каллусогенезе различны, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки и последующей вторичной дифференцировки клеток и подготавливают их к делению, а цитокинины инициируют деление. Во время процесса дедифференцировки, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные, индивидуальные черты исходной ткани (потерять некоторые органеллы, в частности хлоропласты и некоторые запасные вещества, такие как крахмал, некоторые белки и липиды).
Различные типы фитогормонов, и, прежде всего их соотношение в среде культивирования, играют определяющую роль и во вторичной дифференцировке каллусных клеток.
Через несколько дней на изолированном кусочке ткани растения образуется первичный каллус. Периодически в асептических условиях его отделяют и переносят на свежую питательную среду для дальнейшего роста. Такую ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически расчленяя ее и пересаживая на свежую питательную среду. Рост пересаженных тканей происходит в контролируемых условиях при температуре 24-28°С.
Формирование каллуса длится обычно 1-2 месяца. Периодичность субкультивирования тканей зависит от скорости роста биомассы. Внешне такая ткань совершенно не похожа на растение, от которого она была получена, но ее клетки несут генетическую информацию, свойственную данному виду. Процессы, происходящие в культивируемых тканях, в принципе не отличаются от идущих в тканях целого растения. Сохранение способности к синтезу специфических вторичных метаболитов — алкалоидов, эфирных масел, карденолидов, стероидов и др. — определяет практическую ценность культур растительных тканей для создания технологий промышленного выращивания биомассы клеток в качестве принципиально нового вида лекарственного сырья. Кроме того каллусные клетки сохраняют свойство тотипотентности, что используется в технологии моноклонального размножения растений.
Другим вариантом культивирования растительных клеток является суспензионная культура, которую выращивают в жидкой питательной среде, по аналогии с процессом глубинного культивирования в промышленной микробиологии.
Культивирование клеток растений в жидкой среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием поверхностным способом каллусных культур. В условиях глубинного культивирования значительно легче контролировать метаболизм и рост клеточных популяций с помощью различного рода экзогенных факторов. Суспензионные культуры намного удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов, процессов экспрессии генов, изолирования и характеристик получаемых мутантов и т. п.
Читайте также: Рассчитать количество ткани для пэчворка
Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для получения суспензионных культур пред-почтительнее брать каллусы рыхлого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са 2+ . С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2-4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-D) или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добавлении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно получить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном автоматическом перемешивании. Дедифференцированные клетки отрываются от экспланта, образуя в питательной среде суспензию, состоящую из клеточных агрегатов различного состава. Качество суспензии определяется степенью агрегированности. Агрегаты должны содержать не более 10-12 клеток. Состояние клеточных суспензий характеризуется плотностью клеточной популяции. За 14 — 16 дней (средняя длительность культивирования) плотность обычно повышается от 5•10 4 до 5х10 6 кл/мл.
Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирования клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в присутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следовательно, можно сказать, что суспензионные культуры представлены разными агрегатами каллусных клеток.
Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехнологии. Их культивируют в больших количествах для получения вторичных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить максимальный выход продукта.
Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Однако культивирование одной или нескольких клеток связана с определенными трудностями, состоящими в том, что одиночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые разработаны для нормального роста и размножения клеток каллусной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток потребовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего фактора» — совокупности метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или небольшое их количество, они не делятся, так как выделяемого кондиционирующего фактора не хватает для индукции деления. Следовательно, необходимо повысить концентрацию фактора в питательной среде. Этой цели служат следующие методы:
1. Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки» (рис. ).
2. Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. ).
3. Кондиционирование среды — осуществляется путем добавления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.
4. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (-20 мкл) богатой питательной среды.
Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно. Согласно исследованиям), этот фактор водорастворим, термостабилен, не заменяется фитогормонами, включает низкомолекулярные вещества. Химическая природа кондиционирующего фактора доказывается с помощью довольно простого эксперимента. Если разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной пластиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин поместить микропористый целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление одиночных клеток (рис. ).
Клетки животных так же способны расти либо в виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату (твердой поверхности). Такие клетки как, HeLa (клетки, происходящие из опухоли человека) могут расти в любом из этих состояний неограниченно долго; лимфобластомные клетки растут в суспендированных культурах; а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности и в виде монослоя (монослойное культивирование). Как только вся поверхность будет покрыта клетками, развитие культуры резко тормозится (контактное торможение), снижается синтез целевых метаболитов и происходит перерождение или отмирание клеток. Для предотвращения этих нежелательных процессов приходится периодически проводить пересев (перевивку) культуры на свежую питательную среду и новую поверхность. При этом нормальные (неопухолевые) клетки могут выдерживать от 20 до 50 делений и далее подвергаются дегенерации и погибают.
Читайте также: Юбка из ткани сделать выкройка
Монослойное культивирование животных клеток во многом определяется доступностью поверхности для их прикрепления, вследствие чего многие конструкторские разработки направлены на создание методов увеличении возможной площади прикрепления. Ранние технологии основывались преимущественно на использовании вращающихся пробирок или флаконов с целью лучшего обеспечения растущих клеток питательными веществами и воздухом.
Создаваемые в последнее время системы предназначаются для поддержания роста клеток на свернутых в виде «бухт» проницаемых для газов тефлоновых трубочках, каждая из которых имеет поверхность около 10 000 см 2 (а общее их число в реакторе более 20). В таких условиях многие типы клеток культивируются довольно хорошо. Еще одним перспективным способом культивирования клеток животных является способ, основанный на использовании небольших бусин (шариков, микроносителей), к которым прикрепляются клетки. Шарики могут изготавливаться из сефадекса (химически модифицированный крахмал) и обладать поверхностью в 7 см 2 на 1 мг. Шарики способны плавать в суспендированном состоянии и на них могут расти клетки различных типов. Таким путем уже получают человеческий интерферон. Данный способ, полагают, способен заменить метод монослойных культур.
В отличии растений культивирование фрагментов или целых органов животных представляет значительно более сложную задачу. Это связано с тем, что очень сложно создать для них необходимые условия из — за повышенной потребности в питательных веществах и кислороде. Так кусочки печени растут в питательной среде при содержании в газовой фазе 95% О2 и 5%СО2. Длительное культивирование целых взрослых органов пока представляет собой неразрешимую задачу. Гораздо легче удается культивировать различные эмбриональные органы и их фрагменты. Особенно перспективным представляется в настоящее время культивирование так называемых стволовых клеток (аналоги меристемных клеток растений).
Культуры каллусных клеток
Основным типом культивируемых растительных клеток является
каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей
растений. Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном
выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от
культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток
является их гормональная независимость, что обеспечивает им рост на
питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме
того, опухолевые клетки лишены способности давать начало
организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе
органогенеза. Каллусные клетки в культуре могут спонтанно приобретать
гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации
или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки
Каллусная клетка, при делении которой возникает каллусная ткань
или каллус, представляет один из типов клеточной дифференциации,
свойственной высшему растению. В исключительных ситуациях у
нормального растения может возникать каллусная ткань (обычно это
случается при травмах), которая функционирует непродолжительное
время, защищая растение в участке повреждения и накапливая
питательные вещества для регенерационного процесса.
Для получения культивируемых каллусных клеток кусочки
(фрагменты) тканей различных органов высших растений (экспланты)
помещают на искусственную питательную среду в пробирках, колбах или
чашках Петри, строго соблюдая правила стерильности.
Особенности дедифференцирования (т. е. раздифференцировки)
клеток экспланта и процесса каллусогенеза (т. е. образования каллуса)
зависят от особенностей взятых для этого тканей. Клетки
специализированных тканей растения (запасающей паренхимы, корня и
стебля, мезофила листа и т. п.) на питательной среде, содержащей
источники углерода, минеральные соли, витамины и вещества
гормонального типа, должны дедифференцироваться, т. е. потерять
структуры, характерные для их специфических функций, которые они
выполняют в растении, и вернуться к состоянию активно делящихся
Во всех случаях образование каллуса связано с травматическим
воздействием, хотя каллусовые клетки могут возникать и в результате
пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью
среза. В настоящее время техника культивирования растительных тканей
настолько совершенна, что позволяет получить длительно перевиваемую
каллусную культуру из любых живых тканей интактного растения.
Основными компонентами питательных сред для культуры тканей и
клеток растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы),
источник углерода (обычно сахароза или глюкоза), витамины и
регуляторы роста. Иногда возникает необходимость добавления в среду
различных комплексных соединений (таких, как гидролизат казеина,
Читайте также: Классификация тканей таблица анатомия
смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, различного рода растительные
экстракты и т. п.). Как правило, при работе с новым объектом приходится
эмпирическим путем подбирать оптимальные составы используемых
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом,
представляет собой аморфную массу, не имеющую определенной
анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым,
зеленым, красным. По консистенции каллусные ткани также могут
Химический состав каллусной ткани и ткани органа, из которого она
получена, как правило, различается. Каллусные ткани, выращиваемые
поверхностным способом, часто применяются для поддержания в
растущем состоянии коллекций различных штаммов, линий, мутантов; из
них получают суспензии клеток для культивирования в жидкой
питательной среде, а также для регенерации растений.
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной
среде, обычно называют суспензионными культурами, хотя этот термин,
строго научно говоря, не отражает поведение клеток при таком способе
Отдельные клетки, а также небольшие их группы или достаточно
крупные агрегаты (несколько десятков клеток) выращиваются во
взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании различных
аппаратов и методов поддержания их в таком состоянии. Начальный
момент при получении суспензионных культур клеток в известной
степени является событием случайным, поскольку только те клетки,
которые в силу каких-то причин оказались способными к перестройке
метаболизма и эффективному размножению в данных конкретных
условиях, дают начало «хорошим» линиям. Важной особенностью клеток
таких линий является их высокая степень дезагрегации (не более 5–10
клеток в скоплении агрегате), морфологическая однородность (небольшие
размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма), а также
отсутствие трахеиподобных элементов.
Культивирование клеток растений в жидкой среде имеет ряд
преимуществ перед выращиванием поверхностным способом каллусных
культур. В условиях жидкого культивирования значительно легче влиять
на метаболизм и рост клеточных популяций различного рода экзогенными
биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения
индукции ферментов, процессов экспрессии генов, изолирования и
характеристик получаемых мутантов и т. п.
Клетки для суспензионных культур получают из каллусных тканей,
помещая последние в жидкие питательные среды и подвергая их
перемешиванию с помощью разнообразных качалок или встряхивателей.
Суспензионную культуру можно получить и из растительных тканей,
однако это более трудоемкий путь, требующий большего времени. Клетки
экспланта при этом способе должны сначала образовать первичный
каллус, и лишь после попадания возникших на поверхности каллусных
клеток в жидкую среду и их размножения там они дадут начало линии
клеток, способных расти в виде суспензии.
Для глубинного культивирования (суспензионные культуры)
микробиологии. Это и выращивание в замкнутых или открытых системах,
при периодическом или непрерывном режимах, однако наиболее
изученным и наиболее распространенным способом глубинного
культивирования суспензии растительных клеток пока еще остается
закрытая периодическая система с использованием ферменторов с
механическими мешалками или с аэрацией восходящими воздушными
потоками. При указанном способе выращивания рост клеточной
напоминающими таковые при аналогичном культивировании микробных
клеток, т. е. выделяют фазу задержанного роста (лаг-фазу),
экспоненциальную фазу, фазу замедленного роста, стационарную и фазу
отмирания или деградации клеток. Продолжительность фаз зависит от
ряда факторов, связанных как с особенностями выращиваемых объектов,
так и составом среды и некоторыми внешними воздействиями.
Генетические изменения (мутации), возникающие в культивируемых
клетках, процессы адаптивной селекции, идущие в популяции, приводят к
появлению из первичной каллусной ткани линий клеток, различающихся
генетически и фенотипически. Это позволяет создавать линии клеток,
сохраняющих биосинтетические процессы, присущие исходному
растению, а также линии клеток, синтезирующих принципиально новые
В культурах клеток обнаруживаются традиционные для растений
вещества, а также необычные соединения: алкалоиды, гликозиды,
полисахариды, эфирные масла, пигменты и пр. Использование
растительных клеток для производства ферментных препаратов позволяет
получать разнообразные ценные продукты из натуральных или
синтетических предшественников. Однако медленный рост, длительное
поддержание стерильных условий, чувствительность к механическим
повреждениям и ряд других менее существенных недостатков
ограничивают применение суспензионных культур растительных клеток в
промышленных масштабах. Кроме того, во многих случаях содержание
требуемого продукта в суспензионных культурах клеток растений
довольно низкое, что также предстоит преодолеть биотехнологам,
занимающимся культивированием данных объектов.
трансформированных клеток используются методы выращивания
изолированных (отдельных) клеток, которые получаются путем
выделения их из суспензий с помощью микроманипуляторов либо
посредством разведении, а также из регенерированных протопластов.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом
- Правообладателям
- Политика конфиденциальности
Мастерица © 2023
Информация, опубликованная на сайте, носит исключительно ознакомительный характер