Обычно лаборатории, занимающиеся изучением биологии клетки, имеют в своем арсенале несколько методов. Метод клеточных культур обязательно есть в их числе.
В начале XX в. французский ученый А. Каррель установил, что в асептических условиях клетки многоклеточного организма могут расти в искусственной питательной среде в течение длительного времени. В настоящее время известно, что большинство видов клеток растений и животных в благоприятных условиях способны не только жить и размножаться вне организма, но и дифференцироваться, приобретая важные черты специализации. Например, клетки сердечной мышцы в клеточной культуре могут сокращаться.
Для получения клеточной культуры небольшие кусочки ткани диссоциируют на отдельные клетки, используя ферментативную и механическую обработку, и получают суспензию клеток. Затем клетки помещают в специальные сосуды с плоским дном: стеклянные или пластиковые, и заливают искусственной питательной средой. Для каждого типа клеток среда индивидуальна. Для большинства животных клеток питательная среда имеет в своем составе глюкозу, незаменимые аминокислоты, витамины и небольшой процент сыворотки крови. Важно поддерживать нейтральную реакцию среды, оптимальную температуру, не допускать инфекционного заражения. В таких условиях клетки осаждаются на дно сосуда культивирования, прикрепляются к стеклу, распластываются на нем, приобретают характерную для них форму и начинают делиться. Через несколько суток вся поверхность дна сосуда становится заполненной клетками. Наступает момент контактного торможения, клетки прекращают делиться. Нормальные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии. Для дальнейшего культивирования их собирают из первого сосуда и переносят в несколько других сосудов в тех же условиях. Цикл повторяется заново. Так получают перевиваемые клеточные культуры.
Именно с помощью метода клеточных культур впервые были описаны особенности опухолевых клеток. Первая особенность – способность к бесконечному делению. В 50-е гг. XX в. была получена перевиваемая клеточная культура раковых клеток опухоли молочной железы. Культура получила название HeLa по первым буквам имени оперированной пациентки. Эти клетки живы до сих пор, и с ними работают во многих лабораториях мира. За прошедшие годы ученые вырастили тонны этих клеток, хотя самой пациентки давно уже нет в живых.
Другая особенность раковых клеток: они не прекращают делиться, заполняя всю поверхность сосуда. Клетки наползают друг на друга, могут образовывать второй и третий слой.
Нетрансформированные нормальные клетки могут делиться ограниченное количество раз. Такую культуру нельзя поддерживать бесконечно долго. После нескольких пересевов клетки перестают делиться и погибают.
Работа с клеточными культурами дает большие возможности для исследователей. На ранних этапах развития цитологии клеточные культуры использовали для визуального наблюдения за живыми клетками. Изучали процессы митоза, движения клеток, образования контактов между клетками. Сейчас на клеточных культурах изучают процессы дифференцировки, получают перевиваемые клеточные линии стволовых эмбриональных клеток. Клеточные культуры используют для моделирования различных патологических состояний: ишемии, химического или гормонального стресса, для переноса чужеродной генетической информации и т. д. Клеточные культуры находят широкое практическое применение для получения специфических антител, ферментов, факторов регуляции жизнедеятельности клеток, их используют при разработке вакцин.
Из клеточных культур растений можно вырастить целые организмы, поэтому их используют для создания новых сортов растений, обладающих важными для человека свойствами.
1. Как получают перевиваемые клеточные культуры?
2. Какие особенности раковых клеток были изучены в клеточной культуре?
3. Для чего используются клеточные культуры?
Данный текст является ознакомительным фрагментом.
Цитология и ее методология
Цитология (греч. cytos — клетка + logos — наука) — наука о строении и жизнедеятельности клетки. На данный момент нам кажется очевидным, что растения, грибы и животные состоят из клеток, однако раньше об этом и не догадывались.
Цитология начала свой путь развития относительно недавно, в этой статье мы обсудим клеточную теорию и методы, которые используются в цитологии для изучения клеток (методологию).
Клеточная теория
Создание и развитие клеточной теории стало возможным после изобретения микроскопа в 1590 году голландским мастером по изготовлению очков — Захарием Янсеном. Первый микроскоп мог увеличивать изучаемый объект до 3-9 раз.
В 1665 году Роберт Гук, используя микроскоп собственного изобретения, смог различить ячеистые структуры пробки ветки бузины. Эти ячеистые структуры напомнили Роберту Гуку монашеские кельи, он ввел термин клетка (от лат. сеllа — комната, келья).
На самом деле Роберт Гук увидел не живые клетки, как он предполагал, а оставшиеся от них плотные клеточные стенки, которые и представляли собой ячеистую структуру.
В 70-х годах XVII века нидерландский натуралист Антони ван Левенгук открыл целый мир, невидимый невооруженным глазом. Он увидел в микроскопе простейшие организмы: инфузорий, сперматозоидов, а также дрожжи, бактерии, эпидермис кожи.
В течение 50 лет он отсылал результаты своих наблюдений в Лондонское королевское общество. Поначалу они были встречены со скептицизмом, но когда комиссия ученых лично во всем убедилась и подтвердила подлинность его исследований, Антони ван Левенгук был избран действительным членом Лондонского королевского общества.
В последующее время было много описаний самых разных клеток, однако обобщить накопленный материал оказалось не легкой задачей. С ней в 1839-1840 годах справились немецкий ботаник Маттиас Шлейден и немецкий зоолог Теодор Шванн.
Изучая строение растений и животных, Шлейден и Шванн независимо друг от друга пришли к одному и тому же выводу: все организмы, как растительные, так и животные, состоят из клеток, сходных по строению. Они постулировали, что все живое состоит из клеток. В 1839-1840 годах возникла клеточная теория Шлейдена и Шванна, основные положения которой:
- Все организмы состоят из клеток
- Клетка — мельчайшая структурная единица жизни
- Образование новых клеток — основополагающий способ роста и развития растений и животных
- Организм представляет собой сумму образующих его клеток
Читайте также: Чудик из ткани выкройки
Допустили ли Шлейден и Шванн ошибки? Да, они были. Ошибочно предположение о том, что клетка может образоваться из неклеточного вещества.
Важное дополнение в 1855 в клеточную теорию внес Рудольф Вирхов, который утверждал, что любая клетка может образоваться только путем деления материнской клетки.
Какие же положения включает в себя современная клеточная теория? Приступим к их изучению:
- Клетка является структурной, функциональной и генетической единицей живого
- Клетки растений и животных сходны между собой по строению и химическому составу
- Клетка образуется только путем деления материнской клетки
- Клетки у всех организмов окружены мембраной (имеют мембранное строение)
- Ядро клетки — ее главный регуляторный органоид
- Клеточное строение растений, животных и грибов свидетельствует о едином происхождении всего живого
- В многоклеточном организме клетки подразделяются (дифференцируются) по строению и функции. Они объединяются в ткани, органы и системы органов.
- Клетка — элементарная, открытая и живая система, способная к самообновлению, воспроизведению и саморегуляции
XX век несомненно стал веком биологических наук: цитологии, генетики. Это произошло во многом благодаря клеточной теории.
Я хочу поделиться с вами моим искренним восхищением новой жизни. Вдумайтесь — мы ведь когда-то с вами были всего одной единственной клеткой, зиготой! Как в одной клетке природе удалось уместить столько всего: кожу, мышцы, нервную систему, пищеварительный тракт? Мы приоткроем завесу этой тайну в статьях по генетике и эмбриологии, и, тем не менее, мое восхищение этим безгранично.
Наши клетки рождаются и умирают: эпителий кишечника обновляется каждые 5 дней полностью, при удалении 70% печени оставшиеся клетки способны восстановить всю структуру этого органа, каждые 30 дней мы получаем новую кожу. При этом наше сознание и память остаются с нами. Мы — чудо, настоящее чудо природы, созданное из одной единственной клетки.
Микроскопия
Микроскопия — важнейший метод цитологии, в ходе которого объекты рассматриваются при помощи микроскопа. Его оптическая система состоит из двух основных элементов: объектива и окуляра, закрепленных в тубусе. Микропрепарат (срез тканей) располагается на предметном столике, расстояние от которого до объектива регулируется с помощью винта (винтов).
Чтобы посчитать увеличительную способность микроскопа следует умножить увеличение окуляра на увеличение объектива. К примеру, если окуляр увеличивает объект в 20 раз, а объектив — в 10, то суммарное увеличение будет в 200 раз.
Некоторое внимание уделим направлениям в биологии, которые необходимо знать на современном этапе технического прогресса.
Биоинженерия
Биоинженерия — направление науки и техники, развивающее применение инженерных принципов в биологии и медицине. В рамках биоинженерии происходят попытки (и довольно успешные) выращивания тканей и создание искусственных органов, протезов.
То есть биоинженерия занимается преимущественно технической частью. Медицинское направление в биоинженерии ищет замену органам и тканям человека, которые утратили свою функциональную активность и требуют «замены».
Биотехнология
Биотехнология — направление биологии, изучающее возможность применения живых организмов или продуктов их жизнедеятельности для решения технологических задач. В биотехнологии путем генной инженерии создают организмы с заданным набором свойств.
В рамках биотехнологии происходит получение антибиотиков — продуктов жизнедеятельности бактерий, очищение водоемов с помощью моллюсков, увеличение плодородия почвы с помощью дождевых червей, клонирование организмов.
Это разительно отличается от задач биоинженерии, хотя безусловно, эти дисциплины смежные. Все-таки в биотехнологии происходит большее вторжение в живой мир, по сути человек выступает эксплуататором, достигая с помощью животных, растений и грибов своих целей. Человек проводит искусственный отбор, отделяя особей, которые продолжат род, от других, «менее перспективных».
В рамках биотехнологии выделяются следующие направления:
Представляет собой совокупность методов и технологий, которые приводят к получению рекомбинантных РНК и ДНК, выделению генов из клеток и внедрения их в другие организмы.
Изменив молекулу ДНК или РНК, человек добивается своей цели: клетка начинает синтезировать с нее белок. Он то и нужен человеку, такие продукты жизнедеятельности активно используются в медицине, к примеру, при изготовлении антибиотиков.
В ходе генной инженерии был получены:
- Сорт кукурузы, устойчивый к действию насекомых-вредителей
- Бактерии, продуктом жизнедеятельности которых является человеческий инсулин, используемый в дальнейшем как лекарство
- Культура клеток, вырабатывающих гормон человека — эритропоэтин, также используемый в лечебных целях
Представляет собой совокупность методов и технологий, используемых для конструирования новых клеток. В основе лежит идея культивирования клеток тканей вне организма.
С помощью клеточной инженерии возможно бесполое размножение ценных форм растений. Часто получаются, так называемые, гибридные клетки, которые сочетают свойства, к примеру, раковых клеток и лимфоцитов, в результате становится возможно быстрое получение антител.
© Беллевич Юрий Сергеевич 2018-2022
Данная статья написана Беллевичем Юрием Сергеевичем и является его интеллектуальной собственностью. Копирование, распространение (в том числе путем копирования на другие сайты и ресурсы в Интернете) или любое иное использование информации и объектов без предварительного согласия правообладателя преследуется по закону. Для получения материалов статьи и разрешения их использования, обратитесь, пожалуйста, к Беллевичу Юрию.
Методы цитологии
Строение, ультраструктура и функционирование клеточных органоидов исследуется в настоящее время с помощью следующих основных методов: световой и электронной, темнопольной, фазово-контрастной, поляризационной, люминесцентной микроскопии, используемых для изучения строения, ультраструктуры фиксированных клеток, и дифференциального центрифугирования, позволяющего выделять отдельные органоиды и анализировать их цитохимическими, биохимическими, биофизическими, и другими методами.
Световая микроскопия.
Принцип метода состоит в том, что пучок света, пройдя через объект, попадает в систему линз объектива, и строит первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, — объектив.
Читайте также: Ушиб мягких тканей плеча симптомы
В современных микроскопах объективы сменные, что позволяют изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность, т.е. способность давать раздельное изображение двух близких друг к другу объектов.
Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например проекции на экран (до 10 5 раз). Разрешающая способность светового микроскопа ограничивается длиной волны света: чем меньше длина волны, тем выше разрешающая способность. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать фиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130 – 140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света.
Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, — это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.
Электронная микроскопия.
В принципе электронный микроскоп устроен так же, как и световой, только роль светового пучка выполняет в нем пучок электронов, а фокусируется этот пучок не линзами, а электромагнитами. Однако для пучка электронов длина волны значительно короче длин волн видимого света, что и обеспечивает более высокую разрешающую способность электронного микроскопа по сравнению со световым микроскопом. Разрешение у современных электронных микроскопов 0,2-1 нм.
В трансмиссионном электронном микроскопе электроны проходят сквозь объект подобно тому, как в световом микроскопе сквозь него проходит свет. В результате пучок электронов создает изображение объекта на фотографической пластинке.
Одно из главных неудобств электронного микроскопа заключается в том, что в камере должен поддерживаться высокий вакуум, потому что в воздушной среде электроны легко отклоняются и захватываются молекулами газа. Живая же материя не может существовать в высоком вакууме, так как в этих условиях испаряется вся содержащаяся в ней вода; поэтому при помощи трансмиссионного электронного микроскопа можно исследовать только фиксированный материал. Кроме того, срезы должны быть очень тонкими, чтобы сквозь них могли проходить электроны.
В сканирующем электронном микроскопе электроны отражаются от поверхности объекта и создают изображение при движении в обратном направлении. Предел разрешения у сканирующего микроскопа ниже, чем у трансмиссионного, и ему требуется не столь высокий вакуум. Благодаря этому с помощью сканирующего электронного микроскопа можно проводить прижизненные исследования некоторых организмов с достаточно твердыми покровами.
Он позволяет также получать превосходные фотографии, воспроизводящие в мельчайших деталях поверхности некоторых живых существ. Чтобы усилить контрастность конечного изображения, почти все объекты окрашивают. В световой микроскопии используют красители, а для трансмиссионного электронного микроскопа — фиксаторы, содержащие тяжелые металлы (например, четырехокись осмия, перманганат калия, свинец), способные поглощать электроны.
Для сканирующего электронного микроскопа материал часто замораживают, чтобы получить поверхность, покрытую льдом. При этом исключаются потери воды водорастворимых веществ, меньшими являются также химические изменения структур. При анализе данных, полученных с помощью электронного микроскопа, надо помнить, что этим методом исследуются статические состояния клетки в момент быстрой остановки движения цитоплазмы, вызванной воздействием фиксирующих химических веществ.
Темнопольная микроскопия.
Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.
Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что отдельные участки прозрачной, в общем, клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света.
В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.
С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной скоростью поляризации.
После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой плоскостью поляризации. Когда между скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладают способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Этот принцип позволяет рассматривать флуоресцирующие объекты в зоне коротких волн.
Читайте также: Профиль для ткани черная
В таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы. Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуоресцирующие вещества, которые избирательно связываются с определенными структурами, вызывая их вторичную люминесценцию.
Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой, помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинаются размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт.
Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. При культивировании вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру, и соблюдение стерильности. В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток. Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и генетических, вирусологических и биохимических исследований.
Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонадсадок к микроскопу. Живую клетку можно снимать и на кинопленку. Применяя такую ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная съемка), можно подробно видеть протекание важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д. Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале.
Задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке. В качестве фиксаторов применяют альдегиды и их смеси с другими веществами, спирты, сулема, четырехокись осмия и др. После фиксации объекты подвергают дополнительной обработке – окрашиванию. Для окраски применяют различные натуральные (гематоксилин и кармин и др.) и главным образом синтетические красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Срезы до 5 -10 мкм получают на микротоме.
Существует ряд специфических красочных приемов направленных на выявление специфических химических веществ получил название гистохимических или цитохимических. Это собственно цитохимические реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность, связывание красителя, неизменность, локализация вещества. Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью цитофотометрии.
Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны (например, при определении количества ДНК на клетку после реакции Фельгена). Количественную оценку получают не только поглощающие объекты и вещества, но и излучающие. Разработаны приемы количественной флуорометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.
Для выявления белков, отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК – гибридных молекул используют метод иммунофлуоресценции.
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток широко используют метод авторадиографии – регистрации веществ, меченых изотопами. Например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.
В цитологии применяют различные аналитические и препаративные методы биохимии. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные клеточные компоненты и изучать их химию, ультраструктуру и свойства. В настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры.
Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения состоит в том, что время для оседания частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Чтобы ускорить этот процесс оседания используют ускорения, создаваемые центрифугой.
При повторном дробном центрифугировании смешанных подфракции можно получить чистые фракции. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе. Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.
Контрольные вопросы:
1. Уровни организации живой материи
2. Клеточная теория организации организмов
3. Методы исследования в цитологии
4. Задачи и предмет цитологии
5. Устройство светового микроскопа
6. Устройство электронного микроскопа
7. Техника безопасности при цитологических работах
8. Требования к подготовке биологического материала для цитологического исследования
9. Фиксирующие вещества, механизм действия
10. Цитохимия, требования к материалу и возможности
11. Количественный анализ (морфометрия), требования и возможности
12. Артефакты в цитологии, пути объективизации результатов
Рекомендуемая литература:
1. Заварзин А.А., Харазова А.Д. Основы общей цитологии. – Л., 1982.
2. Ченцов Ю.С. Основы цитологии. – М., 1984.
3. Шубникова Е.А. Функциональная морфология тканей. – М., Изд-во МГУ, 1981.
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом
- Правообладателям
- Политика конфиденциальности
Мастерица © 2023
Информация, опубликованная на сайте, носит исключительно ознакомительный характер