Соматический эмбриогенез — образование в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов, то есть зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. С точки зрения биотехнологии, он имеет много преимуществ перед органогенезом, так как регенерант на основе соматического зародыша полностью сформирован, а побеги надо еще укоренять.
Формирование эмбриоидов (зародышей) из соматических клеток в условиях in vitro впервые наблюдали в суспензионной культуре клеток моркови Ф. Стюард с сотрудниками (1958). Такие зародыши при переносе на соответствующую питательную среду развивались в целые растения. Этот процесс наглядно демонстрирует тотипотентность растительных клеток.
Соматический эмбриогенез включает стадии развития, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе:
- глобулы,
- сердца,
- торпеды,
- сформированного зародыша молодого проростка.
В некоторых случаях эмбриоиды образуются непосредственно из клеток ткани, введенной в культуру, так называемый прямой эмбриогенез. В других случаях происходит непрямой эмбриогенез: вначале формируется каллус, а уже из него развиваются зародыши. Эмбриоиды образуются из одиночных клеток, расположенных в основном на поверхности каллуса. Окружающие вакуолизированные клетки могут выполнять по отношению к эмбриогенным клеткам функцию ткани-«няньки».
В суспензионных культурах выделяют два основных этапа:
- сначала из одиночных клеток в результате многократных делений формируются компактные проэмбриогенные комплексы,
- затем из такого комплекса развивается один или несколько эмбриоидов.
Клетки, дающие начало эмбриоидам, отличаются более плотной цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным ядрышком, в них присутствуют крупные крахмальные гранулы и мелкие вакуоли. Эти клетки метаболически активны, богаты белками и РНК. Потребность в гормонах на каждом из этапов эмбриогенеза различна.
Проэмбриогенные комплексы образуются в присутствии ауксина, однако переход к формированию эмбриоидов данный гормон ингибирует. Поэтому на втором этапе соматического эмбриогенеза ауксин или исключают из среды, или используют его в очень низких концентрациях.
Предполагают, что прямой эмбриогенез в культуре происходит из клеток, которые уже детерминированы для эмбриогенного развития перед эксплантацией, то есть являются преэмбриогенно детерминированными. Поэтому чтобы произошла экспрессия эмбриогенеза, требуются только благоприятные условия.
Непрямой эмбриогенез идет путем редетерминации (повторной детерминации) дифференцированных клеток, пролиферации каллуса и развития эмбриогенно детерминированного состояния. Тогда необходимы гормоны как для индукции деления клеток, так и для детерминации эмбриогенного состояния.
Клетки молодых проростков, особенно из эпидермиса гипокотиля, представляют собой наиболее удобный материал для получения соматических эмбриоидов. Эта способность клеток уменьшается по мере удлинения срока от начала культивирования. Например, у моркови эмбриоиды начинают образовываться через 4-6 недель после получения каллуса, оптимальный возраст культуры для индукции соматического эмбриогенеза — 15-20 недель; 30-40 недельная культура часто теряет свой эмбриогенный потенциал.
Наиболее ранняя фаза детерминации клетки на эмбриогенный путь развития — приобретение его свойств полярности, или аксилярности. Она поддерживается несколькими механизмами, которые включают активный базипетальный транспорт эндогенного ауксина, градиент БЭП, градиенты ионов Са2+. Важное значение имеют:
- перестройка цитоскелета морфогенных клеток,
- активация протеинкиназы Р34,
- ингибирование фосфорилирования и окончания деления,
- переход клеток в состояние покоя.
В незрелых зародышах изменяется содержание эндогенных фитогормонов. В регуляции соматического эмбриогенеза очень большую роль играют свет (возможно, посредством активации фитохрома), особенно его спектральный состав, а также экспрессия сигнальных белков. Индуктором эмбриогенеза также может быть слабый постоянный электрический ток. Интересно, что в некоторых ситуациях можно наблюдать органо- и эмбриогенез одновременно. Например, первичный каллус на срезе черешка листа моркови в разных участках давал начало как моно-, так и биполярным органам. В зоне, близкой к перициклу, каллусы дифференцировались как зачатки корней; затем в зоне коровой паренхимы каллусы дифференцировались как зачатки побегов. Значительно позже в субэпидермальной зоне возникали биполярные эмбриоиды. Возможно, такой морфогенез обусловлен эпигенетическим влиянием экспланта на первичные каллусные клетки.
каллусная ткань. всё о каллусной ткани. Морфогенез в каллусных тканях
| Название | Морфогенез в каллусных тканях |
| Анкор | каллусная ткань |
| Дата | 17.11.2021 |
| Размер | 24.73 Kb. |
| Формат файла |  |
| Имя файла | всё о каллусной ткани.docx |
| Тип | Документы #274602 |
- Определение морфогенеза каллусной ткани.
Морфогенез в каллусныхтканях . Клетки каллуснойткани , готовые отвечать на факторы питательной среды называют компетентными или инициальными. Инициальная клетка под воздействием питательной среды вступает в морфогенез . Морфогенез может проходить 2-мя путями: 1) органогенез; 2) соматический эмбриогенез.
органогенез — корневой, стеблевой, флоральный, листовой; соматический эмбриогенез (образование зародышеподобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них — целые растения, исключение -корневой органогенез (рис. 4.11). В отличие от органогенеза при соматическом эмбриогенезе сразу образуется биполярная структура (соматический зародыш), имеющая зачаточный корешок и стеблевую почку, из которой развивается растение.
Тотипотентность — это способность любой клетки воспроизвести целое растение. Любая растительная клетка содержит весь набор генов и сохраняет свойственную зиготе программу развития любого органа: лист, лепесток, сердцевинная паренхима и т.п. Однако возможности разных типов клеток различны, свойство тотипотентности не всегда реализуется. В некоторых клетках гены в сильной степени репрессированы. В организме тотипотентность не проявляется, так как организм подавляет потенциал развития отдельной клетки, изоляция способствует проявлению этих потенций. Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Регенерация растений начинается с вторичной дедифференцировки. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции специализированных. Большая роль в этом процессе принадлежит фитогормонам. Они вызывают изменение метаболизма клеток. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивается морфогенезоим и регенерацией растений. Иногда это гистодифференцировка. Таким путем клетка каллуса может превращаться во флоэмные и ксилемные элементы, из активной клетки в старую. Для управления морфогенезом используются внешние и внутренние факторы: внутренние — вид растения, генотип, орган, из которого взят эксплант; внешние — состав питательной среды, температура, свет (интенсивность, спектр, длина фотопериода). Сигналом (импульсом) морфогенеза является изменение соотношения цитокининов и ауксинов, т.е. они не только регуляторы роста, но и дифференцировки.
Эмбриогенез фактически не зависит от гормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, на которой шло каллусообразование. Развитие соматических зародышей в каллус-ной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды . Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах. Дополнительные стимулы морфогенеза — азотнокислое серебро, нитрат аммония, некоторые аминокислоты (пролин, тирозин, иногда серин), полиамины (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют морфогенез маннит и сорбит. Ионы окиси азота влияют на развитие возникающих в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы аммония — NH4. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а абсцизовая — ускоряет дифференциацию органов соматических зародышей. Азотнокислое серебро продлевает регенерационную способность в старых пересадочных культурах. Лишь одна из 400-1 000 клеток регенерирует. Одного стимула недостаточно, необходима еще готовность к нему. Способность воспринимать стимулы морфогенеза определяется как компетентность клетки. Морфогенез начинается с того, что под влиянием условий среды детерминированная клетка обособляется от каллусных клеток, образуя утолщенную стенку. Клетка-инициаль при соматическом эмбриогенезе дает начало зиготе, а при органогенезе — меристематическому очагу. От недетерминированных каллусных клеток инициальная отличается более крупным ядром и меньшими размерами вакуоли. Ядро обычно занимает центральное положение. В инициальных клетках содержатся большие количества крахмала, иногда липидов. Некоторое время инициальная клетка находится в лаг-фазе, что необходимо для переустройства и подготовки к последующим быстрым делениям. Затем эти клетки делятся по типу дробления, образуя сферическую массу мелких изодиаметрических клеток. При органогенезе эту массу называют меристематическим очагом, а при соматическом органогенезе — глобулярным проэмбрио. В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и, соответственно, происходит стеблевой, корневой, листовой и флоральный органогенез. В глобулярном проэмбрио развивается биполярная структура. Можно выделить несколько последовательных стадий формирования эмбриоидов из каллусной ткани — глобулярную, сердечка, торпедовидную, соматического зародыша. Меристематические очаги или проэмбрио могут возникать на периферии каллусной ткани или быть погруженными в нее. Обычно не наблюдается определенной закономерности в их локализации, исключение составляет стеблевой органогенез в каллусной ткани, полученной из сердцевидной паренхимы табака. Меристематические очаги здесь локализуются только в нижней части каллусной ткани. Некомпетентные клетки делятся, но скорее (чаще) всего становятся гормононезависимыми. Многие в силу генетических особенностей используют гормоны, но не регенерируют, занимая промежуточное положение между «привыкшими» и свежими каллусами.
- Явление тотипотентности растительных клеток.
3. Основные типы морфогенеза: образование моно- и биполярных структур.
4. Стадии соматического эмбриогенеза.
Процесс соматического эмбриогенеза можно разделить на две стадии: 1. Начальная клеточная фаза, которая менее других изучена и наиболее важна – это первичные процессы в проэмбриогенных клетках, связанные с их 75 переходом в детерминированное состояние. Данный этап не характерен для зиготы, развивающейся из зародышевого мешка. 2. Переход к эмбриогенезу или развитию зародыша in vitro. Этот этап включает стадии, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе: стадии глобулы, сердца, торпедо и сформированного проростка. Морфологически такие стадии практически одинаковы in vivo и in vitro. Факторами, индуцирующими соматический эмбриогенез, являются фитогормоны. Наиболее эффективен ауксин 2,4-Д, однако он необходим только для детерминации клеток. Развивающиеся зародыши не нуждаются в гормонах, так как начинают вырабатывать их сами. Длительное пребывание проэмбрио в среде, содержащей ауксин, приводит к пролиферации клеток, составляющих эмбриональный комплекс, и к прекращению дифференциации эмбриоидов, то есть они снова превращаются в каллусные клетки. Эмбриогенный каллус, пересаженный на среду без ауксина или с пониженным его содержанием, образует эмбриоиды. Эмбриоиды, перенесенные на безгормональную среду, дают проростки.
6. Биохимические, структурные и морфологические маркеры морфогенеза.
7. Понятие о кондиционирующем факторе.
8. Факторы, влияющие на морфогенез каллуснойткани.
9. Биологическая роль ауксинов и гибберелинов.
Значение ауксинов и гибберелинов вморфодифференцировке каллусной ткани
Лаг-фаза – начальный период в ростовом цикле, в ходе которого клетки не делятся и не увеличиваются в размерах. Однако на протяжении этой фазы происходят важные изменения, направленные на подготовку и вступление их в фазу активного деления: увеличивается поглощение и экскреция веществ, возрастает объем цитоплазмы и число органелл, повышается содержание АТФ, ГТФ, НАДФН2, активизируется дыхание, начинается синтез ДНК. За лаг-фазой следует фаза экспоненциального роста (лог-фаза). Это ограниченный период в ростовом цикле, в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления и, как следствие, – увеличение сухого вещества. При этом наблюдаются следующие цитологические и метаболические изменения: исчезает вакуоль, увеличивается объем цитоплазмы, гиалоплазма становится плотной, увеличивается число митохондрий и полирибосом, отмечается максимум синтеза РНК и белка и др. В течение поздней экспоненциальной фазы отмечается замедление клеточного деления, а увеличение биомассы происходит за счет растяжения клеток. 9 В ходе фазы замедления роста число клеток, участвующих в митозах, постепенно уменьшается, нарастает число вакуолизированных клеток. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды. Отмечается увеличение морфологической гетерогенности клеток и органелл. Наблюдается синтез ферментов, ключевых для вторичного метаболизма, «белков старения». Стационарная фаза. К этому периоду ростового цикла суспензионная культура достигает максимума сырого или сухого веса. В культуральной среде накапливаются продукты жизнедеятельности клеток, угнетающие рост культуры. В клетках резко уменьшается объем цитоплазмы, вакуоль достигает максимальной величины, резко падает активность дыхания, повышается активность ферментов оксидаз и гидролаз. Фаза деградации, заключающаяся в постепенной гибели клеток, начинается в том случае, если не осуществляется субкультивирование клеточной суспензии на свежую питательную среду. Аналогичные кривые характерны и для целых растений. Например, у однолетних монокарпиков (растения, которые способны цвести и плодоносить один раз в жизни) лаг-фазу можно сравнивать с периодом покоя семени. Логфаза связана с делением и растяжением клеток. На начальных этапах рост идет медленно, все более усиливаясь по мере развития фотосинтетического аппарата (экспоненциальный рост). Происходит формированием тканей и органов, усиление межтканевых и межорганных взаимодействий. Со временем наступает замедление роста, которое объясняется действием внутренних и внешних факторов. Торможение роста в первую очередь связано с формированием цветков и плодов. Стационарная фаза (окончание ростовых процессов) – это генетически предопределенное состояние. В конце жизни растение больше не растет и после плодоношения погибает (деградация). Получение кривых роста для деревьев более трудоемко (трудно точно оценить биомассу, до фазы деградации иногда приходится ждать несколько десятков и даже сотен лет и т. д.), но общий характер кривой роста сохраняется. Для многолетних растений характерны сезонные колебания роста (наиболее известный пример – различная скорость отложения древесины). Каждая почка древесного растения растет в соответствии с S-образной кривой роста. И в этом случае внешние факторы обусловливают чередование интенсивного роста с фазой «стационара», которая стыкуется с лаг-фазой следующего ритма роста. Общая кривая роста оказывается составленной небольшими (разномасштабными) S-образными участками. Таким образом, кривая роста многолетних растений в природных условиях имеет более сложный характер по сравнению с кривой роста в периодической суспензионной культуре.
Ауксины (от греч. аuхо — выращиваю, увеличиваю), вырабатываемые в клетках растений вещества, стимулирующие ростовые процессы (рост корней у черенков, растяжение клеток у отрезков стеблей, деление клеток в культуре растительной ткани); группа фитогормонов. В малых концентрациях А. ускоряют рост растений, в больших — действуют угнетающе. По строению А. предположительно являются одноосновными оксикислотами. К А. близка (3 -индолилуксусная кислота, называется гетероауксином и наиболее распространённая в растениях, и некоторые её производные, образующиеся в растениях при окислительном дезаминировании триптофана. А. образуются в молодых, активно растущих частях высших растений: точках роста стеблей, в верхушках корней, в молодых листьях и почках, а также в грибах и др. Высокое содержание А. в растущих органах активирует приток к ним питательных веществ из других частей растения. А. способны передвигаться вниз по стеблю или вверх по корню. Неравномерным распределением А. в осевых органах объясняются ростовые движения у растений, а также различные тропизмы. В растительных тканях А. находятся в свободном или связанном состоянии; биологической активностью обладают только свободные А. В растении А. взаимодействуют как с другими фитогормонами (гиббереллинами и кининами), так и с продуктами обмена веществ. Механизм действия А. разнообразен и до конца не изучен. Предполагают, что А. активируют биосинтез некоторых белков-ферментов, участвующих в образовании структурных компонентов клеточных стенок, или вступают в нестойкие комплексы с рибонуклеиновой кислотой, регулируя т. о. процесс клеточного деления. Таким же действием, как А., обладают и многие синтетические органические вещества (например, Р-индолилмасляная кислота и др.). А. применяют в растениеводстве для ускорения окоренения черенков и т. д. См. также Регуляторы роста растений.
Цитокины — это продуцируемые клетками белково-пептидные факторы, осуществляющие короткодистантную регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий. Основные функции цитокинов заключаются в обеспечении роста клеток, их выживаемости, дифференцировку и апоптоз. Выполнение этих функций связано с тем, что взаимодействия цитокинов с комплементарными рецепторами на поверхности клеток, сигнал с помощью элементов внутриклеточной трансдукции поступает в ядро, в результате этого происходит активация генов. В свою очередь гены продуцируют белки, которые и регулируют процессы в клетках.
Цитокины – гормоноподобные молекулы, действие которых на клетку-мишень опосредуется высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами. Эти рецепторы являются трансмембранными гликопротеинами, они включают в себя несколько субъединиц, причем высокоаффинное связывание является следствием взаимодействия с разными субъединицами, каждая из которых сама способна связывать соответствующий цитокин, но с более низкой аффинностью. Во многих случаях клетки-мишени цитокинов имеют более чем один центр связывания, которые отличаются аффинностью по отношению к цитокину. За связывание цитокина отвечает внеклеточная часть трансмембранного гликопротеина. В клеточных мембранах имеются цепи, которые реагируют только с одним цитокином, однако есть и такие, которые могут связываться с различными цитокинами. Также имеются так называемые групповые рецепторы, которые способствуют выделению избытка цитокинов из очага поражения. Синтез рецепторов является более длительным и интенсивным процессом, что приводит к более быстрой элиминации из сосудистого русла и более полной реализации эффекта в очаге поражения.
Основная биологическая функция цитокинов — регуляция иммунного ответа на всех этапах его развития, в котором они играют центральную роль. В целом вся эта большая группа эндогенных регуляторов обеспечивает самые разнообразные процессы, такие как:
- пролиферация и дифференцировка предшественников функционально активных иммунокомпетентных клеток,
- хемотаксис (направленное движение клеток вдоль градиента концентраций под действием химических реагентов),
- изменение экспрессии антигенов и различных маркеров,
- переключение синтеза иммуноглобулинов,
- индукция цитотоксичности у макрофагов,
- формирование очага воспаления.
Большинство цитокинов являются гормоноподобными молекулами локального действия. Клетки, которые из производят и утилизируют, находятся очень близко. Кроме того, возможны случаи, когда цитокин действует на клетку, которая его продуцировала. Цитокины обладают достаточно коротким периодом полувыведения из кровотока, около 50% цитокинов выводится за 30 минут. Выведение катаболизированных цитокинов происходит при помощи печени и почек.
В настоящее время известно около 200 цитокинов. Среди них наиболее изученными являются факторы роста и цитокины иммунной системы (ИС).
Цитокины обладают следующими общими свойствами:
— синтезируются в процессе реализации механизмов естественного или специфического иммунитета;
— обладают активностью при очень низких концентрациях (порядка 10-11 моль/л);
— являются медиаторами иммунной и воспалительной реакций и обладают аутокринной, паракринной и эндокринной активностью;
— действуют как факторы роста и факторы дифференцировки клеток (при этом вызывают преимущественно медленные клеточные реакции, требующие синтеза новых белков);
— образуют регуляторную сеть, в которой отдельные элементы обладают синергическим или антагонистическим дейст-вием;
— обладают плейотропной (полифункциональной) активностью.
Цитокины классифицируют по биохимическим, биологическим свойствам и по типу рецепторов.