способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных
| Классы МПК: | A61K35/36 кожа; волосы; ногти; сальные железы; ушная сера A61K35/32 кости; сухожилия; зубы; хрящи A61K9/06 мази; основы для них A61K38/39 пептиды соединительной ткани, например коллаген, эластин, ламинин, фибронектин, витронектин, холодный нерастворимый глобулин (CIG) |
| Автор(ы): | Лунева Светлана Николаевна (RU) , Ковинька Михаил Александрович (RU) , Матвеева Елена Леонидовна (RU) , Талашова Ирина Александровна (RU) , Накоскин Александр Николаевич (RU) |
| Патентообладатель(и): | Федеральное государственное учреждение науки «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ФГУН «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова Росздрава») (RU) |
| Приоритеты: |
Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, и предназначено для использования в косметологии и медицине. Способ выделения коллагена включает предварительную обработку костной ткани сельскохозяйственных животных, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, при этом костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает разработку экономичного по расходу времени и реактивов способа выделения коллагена из различных видов минерализованной соединительной ткани и получение косметического средства из высокоочищенного целевого продукта — коллагена, выделенного из костной ткани сельскохозяйственных животных. 2 ил.
Формула изобретения
Способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающий предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, отличающийся тем, что костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н HCl в течение 20 ч, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 ч при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, а именно к производству препаратов, действке которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани и ее регенерацию, и предназначено для использования в косметологии, кроме того, возможно его использование в области медицины.
В настоящее время известно, что коллагеновые волокна матрикса соединительной ткани выполняют структурную, опорную и стабилизирующую роль в отношении протеогликанов и воды. Кроме того, коллагеновый каркас обладает большой упругостью при действии сил растяжения и сжатия, играя основную роль в ограничении степени гидратации матрикса соединительной ткани (Miller E.J. Biochemical characteristics and biological significance of the genetically distinct collagens // Molec. Cell. Biochem. — 1976. — Vol.13. — N.2. — P.165-192).
Известен способ получения коллагена из — неминерализованной соединительной ткани — дермы, которую подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации уксусной кислотой, с последующим замораживанием, лиофильной сушкой и измельчением, без последующей стерилизации (Патент РФ №2076718, опубл. 10.04.1997).
Однако известный способ подразумевает выделение коллагена из неминерализованной соединительной ткани, в случае использования минерализованного сырья выделение коллагена и по данной схеме затруднительно.
Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного по расходу времени и реактивов способа получения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных.
Поставленная задача решается тем, что в способе выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающем предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворившийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6000g, осадок диализуют против дистиллированной воды и очищают хроматографиен на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.
Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, примером лабораторного выполнения и иллюстрациями, на которых:
Фиг.1 — иллюстрирует схему выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани;
Фиг.2 — иллюстрирует хроматографический профиль коллагена костной ткани на катионообменнике.
Способ осуществляют следующим образом.
После предварительной обработки, заключающейся в удалении мягких тканей, минерализованную соединительную ткань измельчали до кусочков размерами около 5×5 мм. Затем ткань подвергали деминерализации 0,5 н. HCl в течение 20 ч, после этой процедуры деминерализованную ткань освобождали от раствора костного минерала, неколлагеновых белков и проводили пепсиновый протеолиз в присутствии фермента в 0.1 М HCl с рН 2. Пепсин брался из расчета 1 мг на 100 мг ткани. За 18 ч инкубации при температуре 37°С на магнитной мешалке ткань разрушалась полностью с образованием коллоидного раствора, из которого осаждали коллаген добавлением сульфата аммония до 25%-го насыщения. Осадок формировался в течение 1 ч, после чего его отделяли центрифугированием (10 мин, 40.000 gx). Для получения высокоочищенного коллагена используют хроматографическое разделение на СМ-сефадексе. После этого коллаген лиофильно высушивают.
Примеры лабораторного выполнения.
Кости крупного рогатого скота очищают от мягких тканей, обезжиривают спирт-эфирной смесью 1:1, измельчают до кусочков размерами 5×5 мм.
100 г измельченной обезжиренной костной ткани помещают в круглодонную колбу, в которую заливают 200 мл 0,5 н. HCl и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. Полученный после удаления надосадка нерастворившийся костный матрикс заливают 0,1 М HCl и вносят 1 мг пепсина. Реакционную массу помещают на магнитную мешалку и проводят ферментативный гидролиз костной ткани в течение 18 ч до полного растворения костей и образования коллоидного раствора. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием (40.000 g × 30 минут)
После этого к раствору протеолизата приливали насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 25%. Осадок коллагена, образовавшийся за 24 часа, отделяли центрифугированием (6.000 g × 60 минут), суспендировали и диализовали против дистилированной воды в течении 2-х суток, затем лиофильно высушивали. Полученный коллаген растворяли в 0,02 М растворе CH 3 COONa (pH 4,8) в 1,0 М мочевине, центрифугировали и наносили на колонку размерами 2,5×20 см с СМ-сефадексом (ионообменная емкость 4,5+0,5 meg/g, размер гранул 40-120 мкм). Для элюирования использовали линейный градиент NaCl (0,00-1,5 М) в ацетатном буфере (pH 4.8). Хроматографию проводили в денатурирующих условиях. Фракции денситометрировали при длине волны 226 нм, фракцию коллагена в пределах одного хроматографического пика собирали, диализовали против воды и лиофильно высушивали.
Предлагаемый способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов и он позволяет получать высокоочищенный продукт из дешевого доступного сырья.
Кроме этого, получение высокоочищеного коллагена может проводиться в комплексе с выделением других биологически-активных веществ (ГАГ — гликозаминогликаны, НКБ — не коллагеновые белки) костной ткани, снижая тем самым себестоимость целевого продукта.
Научная электронная библиотека
1.2. Коллаген
Коллагены составляют основу структуры кожи, костей, хрящей, сухожилий, кровеносных сосудов и играют важную роль в сохранении нормальной структуры и функции соединительной ткани всех животных (Слуцкий, 1969, 1985; Риггз, Мелтон, 2000; Руденская, 2003).
Коллаген (К) – нерастворимый фибриллярный белок, первичная структура которого складывается из повторяющихся последовательностей триплетов аминокислот глицин-X-Y, где X и Y позиции чаще заняты, соответственно, пролином и гидроксипролином. Эти повторяющиеся последовательности позволяют трем коллагеновым полипептидам (называемым α-цепями) формировать полужесткие, очень стабильные трехспиральные молекулы (рис. 3). Они могут быть гомополимерными (три идентичные α-цепи) и гетерополимерными (две или три разные α-цепи). Под влиянием регулярно располагающихся остатков пролина и оксипролина цепь принимает форму ломаной спирали; это обусловливается жесткостью боковых групп пролина, а также тем обстоятельством, что пептидные связи, в образовании которых участвуют пролин и оксипролин, не могут образовать водородных связей. Остатки глицина образуют межцепочечные водородные связи, способствующие сохранению прочности структуры коллагена.
Рис. 3. Структура коллагена: а – электронная микрофотография коллагена соединительной ткани. Расстояние между повторяющимися структурными единицами равно 700 Å; б – конформация полипептидных цепей в трёхцепочечной молекуле тропоколлагена; в – ступенчатое расположение молекул тропоколлагена обусловливает появление в гидратированных волокнах коллагена повторяющихся структурных единиц, расстояние между которыми равно 700 Å (по Мусил и др., 1984)
Аминокислотные цепи коллагена обернуты друг вокруг друга и образуют «трехволоконный канат», где отдельные волокна связаны между собой водородными связями. Такая пространственная структура возможна, только если аминокислотная последовательность строго соблюдается.
В результате образуется трехволоконная фибриллярная молекула – тропоколлаген, обладающая большой прочностью на растяжение. Это название происходит от слова тропос – обращенный внутрь – из-за того, что коллагеновые волокна всех соединительных тканей, выстланы тропоколлагеновыми молекулами, соединенными «конец в конец» и «бок о бок» – в шахматном порядке. Гидроксильные группы некоторых остатков лизина и оксилизина участвуют в образовании связи между соседними молекулами тропоколлагена. Таким образом, формируется жесткое нерастяжимое волокно. Фибробласты синтезируют молекулы тропоколлагена и выбрасывают их в матрикс, и только здесь происходит сборка коллагеновых волокон (рис. 4).
Коллагены кожи содержат в больших концентрациях пролин и оксипролин (около 20 % от всех остальных аминокислот), глицин и аланин (свыше 50 % от содержания других аминокислотных остатков), ароматические и серосодержащие аминокислоты практически отсутствуют или содержатся в весьма малых количествах. Кроме того, коллаген является одним из немногих белков, содержащих оксипролин и оксилизин. Оксипролин и оксилизин образуются в молекуле проколлагена не в результате биосинтеза, а при гидроксилировании пролина и лизина, которое начинается в период трансляции коллагеновой мРНК на рибосомах (Неклюдов, 2003).
Рис. 4. Строение фибробласта и основные этапы синтеза коллагена. Г – аппарат Гольджи; Я – ядро; ШЭР – шероховатый эндоплазматический ретикулум; СП –секреторный пузырек; ТК – тропоколлаген; КВ – коллагеновое волокно
В настоящее время идентифицировано более 25 различных α-цепей, из которых формируется до 14 разных типов коллагеновых молекул, некоторые из них являются тканеспецифичными (Ленинджер, 1974; Риггз, Мелтон, 2000).
Таким образом, коллагены – это белки, которые:
a) содержат несколько повторов аминокислотной последовательности -Gly-X-Y-, в X-положении которой чаще всего расположен пролин, а в Y-положении – 4-гидрокси-пролин;
б) могут состоять из трех цепей с повторяющимися последовательностями, обладающими способностью к сворачиванию в характерную тройную спираль. По меньшей мере, 19 белков определены в настоящее время как принадлежащие к коллагенам. 10 родственных им белков содержат коллагеноподобные домены.
Коллагеновые белки составляют около половины массы сухого вещества суставного хряща; вблизи суставной поверхности их концентрация приближается к 90 %. В других видах хрящевой ткани коллагены количественно преобладают над другими белками, обеспечивая прочность на растяжение и разрыв. (Слуцкий, 1985). Количественно преобладающим белком протеогликанового комплекса хрящевой ткани является коллаген второго типа (КII). Он в незначительных количествах обнаружен в других специализированных тканях, например, в стекловидном теле глаз некоторых видов животных. Хрящевой ткани присущ необычный полиморфизм коллагеновых компонентов, проявляющийся присутствием большого числа минорных коллагенов. Молекулярная формула КII хрящевой ткани имеет следующий вид: [α1(ΙΙ)]3, что означает наличие трех идентичных α1(II)-цепей, которые отличаются от α1(I)-цепей более высоким содержанием оксилизина. Столь высокая концентрация оксилизина способствует увеличению количества связанных с ним углеводов. По-видимому, такая структура обеспечивает большую сольватную оболочку коллагена типа II по сравнению с типами I или III. В процессе биосинтеза коллагена С-пропептиды соединяются между собой бисульфидными мостиками и после отщепления от молекулы образуют белок, который называется хондрокальцин, с м.м. около 100 000 Да (Слуцкий, 1985).
Коллаген одиннадцатого типа (КXI) составляет приблизительно 3 % хрящевого коллагена и образован двумя разными типами цепей (формула молекулы α1(XI)2 α2(XI)). Со старением организма его количество в хряще уменьшается в пользу коллагена пятого типа (КV) (Канунго, 1982; Риггз и Мелтон, 2000).
Для хрящевой ткани характерно наличие наибольшего количества минорных коллагеновых компонентов. Такой полиморфизм коллагенов позволяет считать минорные компоненты регуляторами адаптационной пластичности хряща, метаболизма хондроцитов и морфогенетических процессов (Слуцкий, 1985).
Содержание коллагена в различных тканях и органах сельскохозяйственных животных (КРС, свиньи) характеризуют следующие данные (% от массы сухого вещества): дерма – 80–90; ахиллово сухожилие – 86; костная ткань – 17,5–25; хрящи – 46–67; роговица и склера глаз – 70; мышцы – 10. При этом коллаген составляет от 25 до 33 % от общего количества белка (Титов, Апраксина, 1995). У костистых рыб коллагеновые белки преобладают в коже, сухожилиях, плавательном пузыре; у кольчатых червей и иглокожих в кожно-мускульном мешке; у моллюсков в кожных покровах и опорных хрящевых элементах.
Наиболее изучены свойства коллагенов в коже и мышечной ткани рыб. Коллаген кожи костистых рыб характеризуется частой встречаемостью молекул, состоящих из трех генетически различающихся α-цепочек, гетеротримера α1 α2 α3; среди изученных позвоночных животных цепочка α3 отмечена лишь у костистых рыб. В целом коллагены мышечной ткани костистых рыб, полученные методом электрофореза, идентичны соответствующим коллагенам типа I из кожи и имеют сходный аминокислотный состав. Однако коллагены мышечной ткани рыб более устойчивы к тепловой денатурации (более 100 °С), чем коллагены кожи, что объясняется более высокой степенью гидроксилирования пролина в мышечном коллагене. Термальная устойчивость мышечного коллагена определяется видом рыбы и по мере ее возрастания рыб можно расположить в следующем порядке: карп, угорь, скумбрия, сайра, кета.
В табл. 1 приведены данные о содержании коллагена и гексозаминов в соединительных тканях различных видов животных.
Составы субъячеек коллагена I типа из мышечной ткани и кожи являются идентичными у угря, скумбрии, сайры и карпа и отличаются у кеты. У последней коллаген кожи состоит из α1 α2 α3 гетеротримеров, а основная часть мышечного коллагена – из (α1)2α2 гетеротримеров (Богданов, Сафронова, 1993).
Содержание гексозаминов и коллагена в соединительной ткани животных