Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необходимо фиксированный и промытый материал залить в плотную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В зависимости от способа растворения все заливочные среды разделяют на растворимые в органических растворителях и водорастворимые. К первым относятся парафин, пластические полимеры на основе парафина, целлоидин, ко вторым — желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты и т.д.
Заливка ткани в парафин
Парафин — смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бензоле, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлорэтилене, ксилоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в качестве промежуточной среды между спиртом и парафином. Температура плавления различных парафинов от 27 до 62 °С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56 °С. Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес».
Важнейшим условием успешной заливки материала является своевременная смена реактивов в процессе их загрязнения, а также соблюдение рекомендуемых временных и температурных параметров. Кроме того, нужно стремиться к тому, чтобы одновременно заливать одинаковые по толщине и плотности кусочки ткани.
| Схема Меркулова | Схема Волковой—Елецкого |
| Фиксация: | · формалин 10 % 24 ч · спирт-формол 24 ч · жидкость Карнуа 2 – 4 ч · спирт 96-100% 2 – 24 ч · промывание в проточной воде 12 — 24 ч |
| Обезвоживание: | · спирт 96 % I 24 ч · спирт 96 %II 2 ч · спирт 100 % I 24 ч · спирт 100 % II 2 ч | · спирт 50% 2 — 4 ч · спирт 60 % 2 — 4ч · спирт70% 12 — 24ч · спирт 96 %I 12 ч · спирт 96 % II 12 ч · спирт 100 % I 1-12 ч · спирт 100 % II 12 ч |
| Заливка в парафин: | · спирт+хлороформ(1:1) 6-12ч или спнрт+ксилол(1:1) 1-3ч или хлороформ 6-12ч или ксилол 1-6ч · хлороформ+парафин (1:1 — «каша») 37 «С 2-3ч или ксилол+парафин (1:1 — «каша») 37°С 1-2ч · napaфин I 56 °С 2ч · парафин II 56 °С 1ч | · спирт 100 % + хлороформ(1:1) 2-3ч · хлороформ I 1,5ч · хлороформ II 0,5ч · хлороформ III 0,5ч · хлороформ+парафин (1:1) 37°С 3-6ч · хлороформ+парафин (1:1) 56°С 0,5-1ч · парафин I 56°С 2ч · парафин II 56°С 2ч парафин III 56°С 1ч |
| Заливка по Ромейсу ручным способом 1 вариант | Заливка по Ромейсу ручным способом 2 вариант | Заливка в парапласт с помощью автомата | Заливка в парапласт с помощью вакуум-автомата. | Быстрая заливка в парапласт с помощью автомата |
| Фиксация 10% формалин 12ч | 10% формалин 12ч | Фиксация в 5 % формалине 2ч | Фиксация в 5 % формалине при 60°С 10мин | |
| Промывание в проточной воде 2ч | Промывание в проточной воде 2ч | Спирт 70 % I 2ч | Спирт 70 % I 5 мин | Ацетон I 30мин |
| 50% спирт 2ч | 50% изопропиловый спирт 2ч | Спирт 70 % II 1ч | Спирт 70 % II 12мин | Ацетон II 30мин |
| 75% спирт 3ч | 75% 3ч | Спирт 96 % I 1ч | Спирт 96 % I 12мин | Ацетон III 30мин |
| 96% 4ч | 90% 6ч | Спирт 96 % II 1ч | Спирт 96 % II 12мин | Ацетон IV 30мин |
| 100% I 4ч | 100% Изопропиловый спирт I 4ч | Спирт 100 % I 1ч | Спирт 100 % I 12 мин | |
| 100% II 4ч | 100% II 4ч | Спирт 100 % II 1ч | Спирт 100 «оII 12мин | |
| Метилбензоат I 2ч | Изопропиловый спирт+парафин (1:1) 60*С 12ч | Спирт 100 % III 1ч | Спирт 100 «оIII 12мин | |
| Метилбензоат II 2ч | Хлороформ I (бензол) 1ч | Бензол I 15мин | Ацетон-ксилол (1:1) 10мин | |
| Бензол 2ч | Хлороформ II (бензол) 1ч | Бензол II 15мин | Ксилол 10мин | |
| Бензол+парафин(1:!) 1ч | Парапласт I 60 °С 2ч | Парапласт плюс I 60°С 15мин | ||
| Парафин 60*С 8ч | Парафин 60*С 8ч | Парапласт П 60 ‘С 3ч | Парапласт плюс II 60°С 25мин | Парапласт плюс 60°С 30мин |
| Всего 47ч | Всего 54ч | 17ч | 12 ч 27 мин | 3 ч |
Наиболее быстрым, простым, не требующим применения специальной аппаратуры методом заливки материала является способ, разработанный И. И. Золотых в патологоанатомическом отделении Института хирургии им. А. В. Вишневского.
· Хлороформ-парафин при 56 °С15 мин
· Парафин при 56 °С, энергично встряхивая 1 мин
Продолжительность 2 ч 30 мин
У насзаливка проходит следующим образом:
· Промывка проточной водой 1 час
· спирт 70% (обезвоживание) больше 4 часов
· спирт+хлороформ 1:1 до 1 часа(пересушивается)
· хлороформ чистый до 1 часа
· хлороформ чистый до 1 часа
· хлороформ+парафин 1:1 37С до 1 часа
Для приготовления препаратов следует:
· ксилол 1 (депарафинизация) 56С 10 м
· промываем дистиллированной водой
· ксилол 56С больше 10 м (для просветления)
Фиксированная формалином ткань, залитая парафином
Формалин фиксированного парафина ткань (английский, фиксированный формалин парафина ткани или формальдегид фиксированного парафина ткани , FFPE ткань) является биохимическим термином для formalin- фиксированного , а затем paraffin- внедренные ткани .
характеристики
Фиксации тканей с формалином и последующим вложением в парафине является одним из наиболее распространенных методов сохранения и стабилизации биологических тканей перед шлифом и гистологическое исследованием под микроскопом . Многие клинические образцы хранятся как образцы, обработанные FFPE. В последующих генетических анализах образца изменения FFPE в образце должны быть отменены, например Б. для извлечения и последующего анализа ДНК или РНК путем секвенирования ДНК или с помощью микрочипа для целей персонализированной медицины или для целей протеомики . Поэтому были разработаны различные методы экстракции и ренатурации , чтобы можно было использовать препараты FFPE для других диагностических процедур даже спустя годы. В том числе используются методы демаскировки антигенов .
Читайте также: Коллекция хлопчатобумажных тканей по технологии
Белки
Для иммуноокрашивания , парафин в тканях FFPE будет экстрагируют с ксилолом . С помощью возрастающей спиртовой серии ткань гидрофилизируется несколькими растворами с возрастающей концентрацией этанола в ксилоле, а затем этанола в воде , так что иммуноокрашивание может происходить с помощью водных растворов. При экстракции белков ткани FFPE обычно перед экстракцией нагревают до 100 ° C.
Нуклеиновых кислот
При экстракции ДНК или РНК экстракция парафина ксилолом часто не требуется. Типичные повреждения нуклеиновых кислот после формальдегида фиксации является дезаминирование из цитозина в урацил , что приводит к C → T мутаций после амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования , а также однонитевые разрывы , которые сокращают длину амплифицированных продуктов. Следовательно, нуклеиновые кислоты, экстрагированные из тканей FFPE, иногда обрабатывают ферментами урацил-N-гликозилазой и ДНК-лигазой перед ПЦР для достижения частичной репарации ДНК .
сказка
Демаскирование антигена для использования тканей FFPE в иммуноокрашивании было впервые проведено в 1991 году с использованием растворов ионов металлов и нагревания микроволнами до 100 ° C.
Заливка гистологического материала
Здравствуйте, коллеги!
После того или иного способа гистологической проводки образцы ткани
должны быть залиты в парафин или другие заливочные среды.
В этом выпуске «Образователя» мы остановимся на ключевых
моментах процесса заливки в парафин, дадим практические советы по изготовлению парафиновых блоков и поговорим о том, как подготовить их к микротомии.
После проводки желательно максимально быстро залить образцы ткани
в парафин, поскольку избыточное пребывание в нем объектов
может их уплотнить. Ткани можно задерживать в заливочном
центре или последней станции парафина на срок около 1-2
часов, но не более. Мелкие биопсии особенно не
рекомендуется передерживать в парафине, так как это пересушивает их.
В некоторых случаях, например, при проводке в двух корзинах
карусельного процессора, материал из второй корзины должен
быть выдержан в последнем парафине дополнительное время,
ведь финиш процесса проводки считается по первой корзине. В этом случае первая корзина находится в последнем парафине, а вторая — в предпоследнем, следовательно, в ней образцы будут недопроведенными по времени этой станции. Здесь можно отправить на заливку первую корзину, а на её место поместить вторую.
Заливка материала
Заливку можно выполнять двумя способами: вручную, используя
разные формы и автоматически, с помощью заливочного
центра. В заливочном центре есть таймеры старта и отсрочки. Желательно заливочный центр держать горячим в течение всего рабочего дня, например, с 6 утра и до 17 часов, так как перезаливка может потребоваться в любое время.
При любом способе необходимо соблюдать следующие
принципы:
- Заливочный парафин должен быть нагрет на 5-6оС выше
точки плавления парафина и при заливке он не должен
застывать. При застывании и наливке остывшего парафина в
нем образуются пузырьки воздуха. - Ткань, подлежащая заливке, также не должна застывать и покрываться плёнкой.
- Заливать нужно с помощью горячего, но и не перегретого
пинцета, чтобы не оставить ожоги на ткани. - Пинцет необходимо протирать после каждого залитого объекта во избежании попадания микроскопических кусочков в другой блок. Бывает, невидимые глазу кусочки соскобов или плацент попадают в материал другого пациента, и патологам остаётся только гадать, откуда, например, в коже ворсины хориона.
5. Следует сперва наливать парафин в форму, а затем помещать в него кусочек ткани и ориентировать в форме так, как необходимо (об ориентации объектов расскажем в наших следующих выпусках).
6. При заливке формы не должны быть переполнены, но количество налитого парафина должно быть достаточным, чтобы блок удерживался на кассете во время микротомии.
7. Необходимо избегать механического травмирования
заливаемых объектов, они могут распадаться от сильного
нажатия.
8. При заливке вручную на верхнюю часть залитого блока
помещают номер. При заливке в аппарате, сверху заливочной
формы помещают маркированную кассету.
9. Дать остыть блоку. Чем блок больше и толще, тем дольше
он должен застывать.
10. По окончании работы с каждого рабочего место должны
быть убраны все остаки парафина и заливаемого материала, а ёмкости для расплавленного парафина должны быть наполнены.
Как понять, что блок застыл?
Парафин начинает застывать со всех краев одновременно, и происходит это
относительно быстро, за несколько минут. Но внутри он
застывает дольше, и длится этот процесс может от 20 минут до суток (в зависимости от состава парафина и размера блока).
Если после схватывания блока форму с залитым кусочком ткани из заливочного центра поместить в морозилку, то блок уже можно будет резать примерно через 1 час.
Читайте также: Ткань лайкра это какая ткань
Из формы блок можно вынуть через несколько минут, парафин
на холоде сжимается и отскакивает от формы (обычно
раздается характерный щелчок; если блоков много — можно
услышать треск). Но это не значит, что блок готов к резке, его
нужно еще подержать в морозилке или на охлаждающей панели, желательно не менее часа.
Практические советы
При работе с большим количеством кассет обязательно нужно
соблюдать правило: открывать только одну кассету, заливать
только одну форму и следующую кассету брать в руки только
после сбрасывания крышки (при использовании заливочной станции) или всей кассеты (при ручном
методе, если лабораторию не обеспечивают кассетами и приходится их вторично использовать).
Чтобы уголки или формы не прилипали к поверхностям и друг другу, и от них легко отходил парафин, их нужно смазывать раствором этанола/глицерина 1/1, либо 4/1.
Пинцет также не должен остывать при заливке. Лучше всего пользоваться специальными пинцетами с электроподогревом. При их отуствии нагревать пинцет можно над пламенем спиртовки (не самый безопасный метод), нагревательных столиках, либо подогревать инструменты в специальных лунках заливочного центра.
Парафин для заливки лучше использовать тугоплавкий, 58-60оС, поскольку, чем парафин труднее плавится, тем он меньше нагревается в процессе микротомии, и с такого блока проще получить тонкий срез.
Продуктивность этапа
Средний уровень продуктивности на заливке равен 60 блоков/час. Он посчитан исходя из коэффициента использования рабочего времени 75% и эквивалентен различным уровням выхода: 90 блоков/2 часа и 180 блоков/4 часа.
Поскольку при заливке высокий уровень напряжения, то эта задача должна быть ограничена сменой, но не более 4 последовательных часов.
Поэтому рабочее место для заливки должно быть хорошо освещено, не быть на сквозняке или в холоде и оснащено удобными инструментами (пинцетами, прессами для придавливания материала к дну блока) и мебелью, позволяющей работать несколько часов непрерывно.
Причины ошибок при заливке в парафин и резании материала
Можно рекомендовать ряд способов устранения ошибок, встречающиеся при заливке и резании гистологического материала:
1) Парафин крошится. Причина этого заключается в том, что при за-ливке парафин охлаждался слишком медленно, или он был чрезмерно твер-дым. Такой блок необходимо расплавить в термостате и снова перезолить материал. Другой причиной такой ситуации может быть низкая температура окружающей среды. В таком случае в новой заливке нет необходимости, достаточно изменить температурный режим помещения или рабочего стола, или просто подуть с близкого расстояния на блок для согрева.
2) Отделение залитого материала от парафина. При таких обстоятельствах возможно и выпадение материала из блока парафина. Причина этого явления заключается в том, что материал при заливке уже охладился или заливался в охлажденный парафин. В этом случае материал необходимо залить заново. Другой причиной может быть недостаточное удаление из материала спирта, применявшегося для обезвоживания. В таком случае парафиновый блок расплавляют, и материал переносят в «промежуточное вещество», после чего заливают заново согласно общепринятым правилам.
3) Плоскость среза блока неоднородна, белого цвета. Причина такого состояния в плохом обезвоживании. При такой ситуации блок расплавляют и материал пропускают в обратном порядке через обезвоживающий ряд спиртов до абсолютного спирта, затем снова заливают.
4) Материал плохо или вовсе не режется, нож подскакивает по поверхности блока, плоскость среза неровная.Данная картина объясняется переуплотнением материала при фиксации. Исправить данную ошибку уже невозможно, но можно попытаться подготовить срезы толщиной 15-20 микрон по методу Оршоша. Суть метода заключается в том, что срезы осторожно переносят на пергаментную бумагу и опускают в теплую воду, чтоб дать раскрутиться и расправится. При этом нужно помогать препоровальной иглой или кисточкой. При выпрямлении закрученных срезов надо пользоваться предварительно прокипяченной дистиллированной водой, что также предотвращает образование в срезах пузырьков воздуха. При резании вышеописанных блоков необходимо сильно подышать на блок для согревания, что дает хорошие срезы. Возможен другой способ получения хороших срезов, когда при каждой резке на поверхность блока кисточкой наносят горячий парафин, дают ему слегка остыть, потом делают срезы.
5) Срезы разрываются. Причиной таких срезов является наличие зазубрин на ноже или же плохая декальцинация материала. Данная ситуация может быть обусловлена загрязнением материала во время заливки, когда попадают песчинки пыли или иных частиц.
6) Срезы полосатые.Причина — наличие зазубрин на лезвие ножа.
7) Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа.Данная картина может быть при слишком мягком парафине или сравнительно высокой температуре в помещении. Материал необходимо залить в более твердый парафин или перед резанием материал держать в холодной воде, можно в холодильнике.
8) Не все срезы пригодны для исследования.Срезы слишком тонкие для данного материала, или материал плохо залит. В таком случае необходимо увеличить толщину среза на несколько микрон. Другая причина – слишком велик угол наклона ножа.
9) Плохое качество срезов.Необходимо изменить угол наклона ножа для резания.
10) В сухое время года или сухости воздуха помещения срезы электризуются и прилипают к лезвию ножа.Изменить возникшее состояние, возможно просто дыша на нож.
Читайте также: Разбор по составу ткань
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ ДЛЯ ОКРАСКИ МИКРОПРЕПАРАТОВ
Методики для обзорного гистологического исследования.
Гистологическое исследование тканей проводится после окраски материала с применением обзорных методик. Целью окраски является выявление структурных особенностей ткани, состояние ядерной субстанции. Во многих случаях достаточно применение окраски гематоксилином и эозином. Красители ядер являются основными, а для оценки состояния протоплазмы кислотными, поэтому при их применении, Конечно, окрашиваются все те клеточные и тканевые элементы, которые имеют сродство с этими красителями.
Окраска ядер. Для окраски ядер чаще применяют гематоксилин, а также кармин. Кроме этого избирательным окрашиванием ядер обладают сафранин, галлоцианин.
Гематоксилин – применяется в виде квасцового раствора или после обработки квасцами. Краситель может быть пригодным после созревания. Сущность созревания заключается в окислении гематоксилина в гематеин, для чего требуется от нескольких дней до недель. Процесс созревание раствора гематоксилина можно ускорить. В этом случае краситель можно применять сразу. Существует значительное число видов гематоксилина. Рекомендуются следующие виды гематоксилина:
1. Кислый гематоксилин Эрлиха.
Способ приготовления: В 100,0 мл 96% спирта растворить 2,0 г гематоксилина , прибавить 100,0 мл дистиллированной воды, затем 100,0 мл чистого глицерина, 3,0 г калийных квасцов (химически чистый), 10,0 мл ледяной уксусной кислоты, взболтать и оставить на свету «созревать» в течении 14 дней, периодически взбалтывая.
Для того чтобы обеспечить постоянный доступ воздуха, при котором происходит процесс окисления гематоксилина, следует брать широкогорлый сосуд и накрыть отверстие несколькими слоями марли.
Результат. В процессе «созревания» раствор из светло-красного становится темно-красным. Готовый раствор долго сохраняет свои свойства при хранении в плотно закрытом сосуде.
Способ приготовления: В 100,0 мл 100% спирта растворить 1,0 г кристаллического гематоксилина и добавить 200,0 мл 10% водного охлажденного и профильрованного раствора калийных квасцов.
Результат. Раствор «созревает» на свету в течение 4-5 дней, после чего он готов к применению. Перед применением раствор каждый раз фильтруют. Необходимо помнить, что со временем раствор портится и готовят свежий раствор.
3) Гематоксилин Делафильда ( Delafield).
Способ приготовления: 40,0г кристаллического гематоксилина растворяют в 25,0 мл абсолютного спирта и прибавляют 400.0 мл насы-щенного водного раствора аммиачных квасцов (на 400,0 мл дистиллиро-ванной воды берут приблизительно 40,0 г аммиачных квасцов). Приготовленный раствор помешают в банку с широким горлышком и держат на свету 3-4 дня, затем фильтруют. К фильтрату прибавляют 100,0 мл глицерина и 100,0 мл чистого метилового спирта. Оставляют на свету в широком стакане ещё на несколько дней и снова фильтруют.
Окраска. Для регрессивной окраски время окрашивания 4-6 минут. При этом необходимо разбавить гематоксилин дистиллированной водой в равном объёме. После окраски срезы прополаскивают сначала в дистиллированной воде, затем водопроводной. Дифференцировка осуществляется под контролем микроскопа с применением 1% солянокислым спиртом или насыщенным водным раствором пикриновой кислоты. После дифференцировки и промывания с частой сменой в водопроводной воде минуем до 30 минут.
Приготовление солянокислого спирта: к 100,0 мл 70% спирта прибавляют 1,0 мл концентрированной соляной кислоты.
Результат окрашивания: Ядерный хроматин ярко синего цвета.
4) Приготовление гематоксилина, тотчас же пригодного к употреблению.
Способ приготовления: Готовят два раствора: а) 1,0 г гематоксилина растворяют в 10,0 мл 96% спирта; б) 20,0 г гематоксилина растворяют в 200,0 мл теплой дистиллированной воды. Оба раствора после полного растворения сливают и быстро доводят до кипения. В кипящую смесь прибавляют 0,5 г hidrarg. oxid. flavum, смесь за 2-3 секунды становится синевато-лилового цвета. После чего прекращают нагревание, смесь быстро охлаждают (например, в ледяной бане) и фильтруют.
Результат. Раствор может сохраняться неограниченное время.
При избирательном окрашивании ядра после фильтрации к раствору прибавляют 5% ледяной уксусной кислоты. Раствор может применяться лишь в течение 2-3 недель. Процесс окраски и результат аналогичен как гематоксилином без ускоренного созревания.
5) Железный гематоксилин Гейденгейна
Дает хороший эффект лишь в случае тонких срезов не более 5 микрон. Применение его требует большого навыка. Применение дает возможность выявления очень нежных деталей ядерной структуры.
Способ приготовления: Срезы перед окрашиванием протравливают в течение 2-12 часов 2,5% раствором железных квасцов. (Для приготовления красителя пригодны кристаллы железных квасцов только фиолетового цвета). После протравки делают прмывку в дистиллированной воде, затем окрашивают раствором гематоксилина (1,0 грамм гематоксилина растворяют в 10,0 мл 96% спирта, прибавляют 90,0 мл дистиллированной воды и оставляют «созревать» не менее 4 недель) в течение 1-36 часов. Гематоксилин перед употреблением доводят до двойного объёма. Однако для окрашивания можно пользоваться более разведенными растворами. Далее окрашенный срез при контроле под микроскопом дифференцируют, в качестве протравы применяют железоаммиачные квасцы. Срез предварительно промывают водой. После дифференцировки снова промывают в водопроводной воде в течение 30 минут при частой смене воды.
Результат. Ядерная структура, ядрышки, клеточный центр, поперечная полосатость поперечнополосатой мускулатуры окрашиваются в черный или синевато-черный цвет.
Дата добавления: 2018-11-24 ; просмотров: 1489 ; Мы поможем в написании вашей работы!
- Свежие записи
- Балкон в многоквартирном доме: является ли он общедомовым имуществом?
- Штраф за остекление балкона в 2022: что это и как избежать наказания
- Штраф за мусор с балкона: сколько заплатить за выбрасывание окурков
- Оформление балконного окна: выбираем шторы из органзы
- Как выбрать идеальные шторы для маленькой кухни с балконом