Перед заливкой тканей в парафин осуществляют

Здравствуйте, коллеги!

После того или иного способа гистологической проводки образцы ткани
должны быть залиты в парафин или другие заливочные среды.

В этом выпуске «Образователя» мы остановимся на ключевых
моментах процесса заливки в парафин, дадим практические советы по изготовлению парафиновых блоков и поговорим о том, как подготовить их к микротомии.

После проводки желательно максимально быстро залить образцы ткани
в парафин, поскольку избыточное пребывание в нем объектов
может их уплотнить. Ткани можно задерживать в заливочном
центре или последней станции парафина на срок около 1-2
часов, но не более. Мелкие биопсии особенно не
рекомендуется передерживать в парафине, так как это пересушивает их.
В некоторых случаях, например, при проводке в двух корзинах
карусельного процессора, материал из второй корзины должен
быть выдержан в последнем парафине дополнительное время,
ведь финиш процесса проводки считается по первой корзине. В этом случае первая корзина находится в последнем парафине, а вторая — в предпоследнем, следовательно, в ней образцы будут недопроведенными по времени этой станции. Здесь можно отправить на заливку первую корзину, а на её место поместить вторую.

Заливка материала

Заливку можно выполнять двумя способами: вручную, используя
разные формы и автоматически, с помощью заливочного
центра. В заливочном центре есть таймеры старта и отсрочки. Желательно заливочный центр держать горячим в течение всего рабочего дня, например, с 6 утра и до 17 часов, так как перезаливка может потребоваться в любое время.

При любом способе необходимо соблюдать следующие
принципы:

Заливочный парафин должен быть нагрет на 5-6оС выше
точки плавления парафина и при заливке он не должен
застывать. При застывании и наливке остывшего парафина в
нем образуются пузырьки воздуха.
Ткань, подлежащая заливке, также не должна застывать и покрываться плёнкой.
Заливать нужно с помощью горячего, но и не перегретого
пинцета, чтобы не оставить ожоги на ткани.
Пинцет необходимо протирать после каждого залитого объекта во избежании попадания микроскопических кусочков в другой блок. Бывает, невидимые глазу кусочки соскобов или плацент попадают в материал другого пациента, и патологам остаётся только гадать, откуда, например, в коже ворсины хориона.

5. Следует сперва наливать парафин в форму, а затем помещать в него кусочек ткани и ориентировать в форме так, как необходимо (об ориентации объектов расскажем в наших следующих выпусках).

6. При заливке формы не должны быть переполнены, но количество налитого парафина должно быть достаточным, чтобы блок удерживался на кассете во время микротомии.

7. Необходимо избегать механического травмирования
заливаемых объектов, они могут распадаться от сильного
нажатия.

8. При заливке вручную на верхнюю часть залитого блока
помещают номер. При заливке в аппарате, сверху заливочной
формы помещают маркированную кассету.

9. Дать остыть блоку. Чем блок больше и толще, тем дольше
он должен застывать.

10. По окончании работы с каждого рабочего место должны
быть убраны все остаки парафина и заливаемого материала, а ёмкости для расплавленного парафина должны быть наполнены.

Как понять, что блок застыл?

Парафин начинает застывать со всех краев одновременно, и происходит это
относительно быстро, за несколько минут. Но внутри он
застывает дольше, и длится этот процесс может от 20 минут до суток (в зависимости от состава парафина и размера блока).

Если после схватывания блока форму с залитым кусочком ткани из заливочного центра поместить в морозилку, то блок уже можно будет резать примерно через 1 час.

Из формы блок можно вынуть через несколько минут, парафин
на холоде сжимается и отскакивает от формы (обычно
раздается характерный щелчок; если блоков много — можно
услышать треск). Но это не значит, что блок готов к резке, его
нужно еще подержать в морозилке или на охлаждающей панели, желательно не менее часа.

Читайте также: Может ли сесть ткань из полиэстера

Практические советы

При работе с большим количеством кассет обязательно нужно
соблюдать правило: открывать только одну кассету, заливать
только одну форму и следующую кассету брать в руки только
после сбрасывания крышки (при использовании заливочной станции) или всей кассеты (при ручном
методе, если лабораторию не обеспечивают кассетами и приходится их вторично использовать).

Чтобы уголки или формы не прилипали к поверхностям и друг другу, и от них легко отходил парафин, их нужно смазывать раствором этанола/глицерина 1/1, либо 4/1.

Пинцет также не должен остывать при заливке. Лучше всего пользоваться специальными пинцетами с электроподогревом. При их отуствии нагревать пинцет можно над пламенем спиртовки (не самый безопасный метод), нагревательных столиках, либо подогревать инструменты в специальных лунках заливочного центра.

Парафин для заливки лучше использовать тугоплавкий, 58-60оС, поскольку, чем парафин труднее плавится, тем он меньше нагревается в процессе микротомии, и с такого блока проще получить тонкий срез.

Продуктивность этапа

Средний уровень продуктивности на заливке равен 60 блоков/час. Он посчитан исходя из коэффициента использования рабочего времени 75% и эквивалентен различным уровням выхода: 90 блоков/2 часа и 180 блоков/4 часа.
Поскольку при заливке высокий уровень напряжения, то эта задача должна быть ограничена сменой, но не более 4 последовательных часов.
Поэтому рабочее место для заливки должно быть хорошо освещено, не быть на сквозняке или в холоде и оснащено удобными инструментами (пинцетами, прессами для придавливания материала к дну блока) и мебелью, позволяющей работать несколько часов непрерывно.

3.2. Заливка объектов в парафин

Получение тонких срезов образцов исследуемых тканей возможно только после пропитывания последних достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин. В настоящее время целлоидин применяется очень редко.

Парафин – смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48 до 60 °C. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52 – 56 °C. Без дополнительной подготовки технический, пищевой и медицинский парафины не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками, такие как гистомикс («БиоВитрум», Россия), Paraplast (Sigma, США), Histoplast (Shandon, США).

Пропитку парафином проводят в термостате, обеспечивающем поддержание температуры на 1 – 2 °C выше температуры плавления используемого парафина (обычно устанавливают температуру 58 °C).

Поскольку расплавленный парафин и этанол не смешиваются, из обезвоженного материала следует удалить спирт (или метилсалицилат, если он был использован для длительного хранения объектов) при помощи промежуточной среды – растворителя парафина, смешивающегося с этанолом. В качестве промежуточной среды можно использовать хлороформ, авиационный бензин (рекомендован Р. Лилли, 1969), петролейный эфир, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан и др. В практической работе наиболее часто применяют хлороформ и ксилол. Неудовлетворительное качество заливки при использовании хлороформа может быть обусловлено применением хлороформа «для спектроскопии», в который добавлен этанол, разливного хлороформа (при использовании недостаточно просушенных после промывки емкостей) и реактива, долго хранившегося на свету. При доступности абсолютного этанола следует предпочесть менее токсичный петролейный эфир, который лучше удаляет этанол и позволяет достичь более высокого качества пропитки парафином.

Можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки и пропитывания материала.

Заливка в парафин с использованием хлороформа. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– смесь абсолютного этанола с хлороформом 1: 1 – 1 – 2 ч;

– хлороформ – парафин (1: 1) в термостате при 37 °C – 12 – 24 ч;

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин;

Читайте также: Дать определение ткани человека

– парафин (III) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин.

При отсутствии возможности использовать абсолютный этанол первый этап проводки можно пропустить, однако качество пропитки парафином может быть несколько хуже. После обезвоживания с использованием метилсалицилата (или метилбензоата) этот этап следует пропустить. Качество заливки при этом не ухудшится.

Заливка в парафин с использованием петролейного эфира. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– петролейный эфир (I) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир (II) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир (III) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир-парафин (1:1) в термостате при 37 °C – 3 – 24 ч;

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 60 мин;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 60 мин.

Схема проводки материала и заливки в парафин после фиксации объектов в жидкости Буэна, применяемая в отделе общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН.

Перед фиксацией мелкие, тонкие и легко деформирующиеся объекты необходимо поместить на кусочек плотной бумаги. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– жидкость Буэна для фиксации – 1 сут;

– короткая промывка в водопроводной воде – 1 – 15 мин;

– абсолютный этанол-хлороформ 1: 1 – 2 – 3 ч;

– хлороформ-парафин (1: 1) в термостате при 37 °C – оставить на ночь (10 – 15 ч);

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч;

– парафин (III) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч.

Автоматизация процесса замещения промежуточных сред на парафин достигается использованием вакуумных процессоров (например, VIP 6, Sakura), в которых не только происходит автоматическая смена и перемешивание реактивов, но и создаются специальные условия для лучшей пропитки тканей реагентами.

По окончании проводки осуществляется заливка. Объект помещают в бумажную или подогретую в термостате специальную пластиковую (из полипропилена, полистирола и т. п.) или металлическую формочку. Далее в нее наливают свежую порцию разогретого до 58 – 65 °C парафина. Разогрев заливочного парафина свыше 56 °C рекомендуется в связи с возможностью быстрого застывания парафина, вынутого из термостата, что приводит к неравномерной заливке блока с сохранением пустот. В случае необходимости особой ориентации кусочка ткани при изготовлении срезов можно повернуть материал, обратив плоскость резки ко дну формочки, с помощью подогретых препаровальной иглы и глазного пинцета.

Данный текст является ознакомительным фрагментом.

Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии